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摘要：无菌检查法是以活的微生物作为检验对象, 所以只要能影响微生物的生长因素, 就能影响测定结果的准确性。药品、辅料及器械等无菌的可靠性可通过无菌检查来确认, 而无菌检测的可信度与抽样量、检查用的培养基质量、材料、操作环境、无菌技术、仪器性能、操作方法等有关。在检定中应控制这些因素的影响, 方可保证检验结果的准确可靠。本文分析了药品无菌检查的影响因素，并阐述了无菌制剂微生物检验方法验证。
关键词：无菌制剂；检查；方法
无菌检查法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的检查法，是作为批无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。
一、药品无菌检查的影响因素
1、操作环境的影响
（1）药品无菌检查的环境要求:国家药典明确规定:无菌检查应在环境洁净度B级背景下的局部A级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程必须严格遵守无菌操作,防止微生物污染。每次操作前用0.1%苯扎溴胺或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角, 然后启动层流净化装置, 同时用紫外线杀菌灯照射0.5 h。紫外线杀菌灯应定期检查辐射强度, 不符合要求的紫外线杀菌灯及时更换。操作时采用沉降菌检测方法检查空气中的菌落数,以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度。这些工作在菌检中应得到足够的重视,确保无菌室达到规定的技术指标。
（2）无菌检查环境对药品检查造成的影响:菌种处理应在阳性室进行, 严禁在无菌检查用洁净室操作, 否则会导致试验室环境污染或菌种间交叉污染。无菌室的温度、湿度也会对药品检查造成影响, 故应严格控制无菌室的温度在18-26℃, 相对湿度不大于65%。若室温过低, 培养基中的琼脂易发生凝固, 进而影响厌氧菌的检出。
2、设备及用具的影响。无菌室内应固定存放乙醇灯、镊子、剪刀、75%乙醇棉等。药品检验人员进入无菌室后勿频繁走动, 操作过程中如需传递物品应通过传递箱, 不要随意出入无菌室。凡操作所用的器皿均应洗涤干净, 用牛皮纸包扎严密, 灭菌。经高压蒸汽灭菌的物品取出时切勿立即置冷处, 避免因急速冷却, 使灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压而易感染细菌, 取出后应置恒温培养箱中烘干,待用。各种恒温、恒湿培养箱除定期检查外,还应每天观察箱内温度及湿度的波动范围;每次使用高压蒸汽灭菌器前,应检查、判断其是否在设定的温度与压力条件下可达到灭菌效果。反之, 不符合器械及设备使用和管理规定的情况均有可能影响药品检验的准确性。
二、无菌制剂微生物检验方法验证
1、验证试验的内容。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆抑细菌、抑真菌验证试验和供试品的处理项验证试验，以验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。
2、验证试验的关键因素。试验菌，包括试验菌的选择、菌种的要求、试验菌液的制备、菌液贮藏条件和期限及菌数的测定等，这些都将直接影响验证结果，而且在不含抗菌活性的供试品中也会影响微生物回收试验的结果。
3、验证方法
?菌种选择。选择的菌株都是微生物试验中常用的控制菌，且为标准菌株。每一试验菌均应进行验证试验，根据各菌株所代表的微生物种类进行验证试验，如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌代表好氧细菌和厌氧菌，培养基采用硫乙醇酸盐流体培养基； 而白色念珠菌和黑曲霉代表真菌，培养基采用胰酪胨大豆液体培养基。
（2）菌种要求。无菌检查方法验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代，以保证试验菌株的生物特性。
（3）菌液制备。取经30℃～45℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌营养肉汤培养物、取经35℃培养18～24h的生孢梭菌流体硫乙醇酸盐液体培养物、取经23℃～28℃培养24～48h的白色念珠菌胰酪胨大豆胨液体培养物、取经23℃～28℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3～5mL0.9％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液分别稀释，制成约含菌10～100 cfu/mL。
（4）供试品的取样和处理。无菌产品中个成分的含量应该是均匀的，因此只要确定在验证的方法中， 按所需的总接种量即可，而不必强求按规定的容器数取样。如果供试品需要溶解、稀释、乳化等处理，则必须确认这些处理对微生物无影响。
4、验证实验
（1）薄膜过滤法的验证分别做供试品组及对照组，与对照组比较供试品组微生物的生长情况[2]。冲洗次数及冲洗体积同时要在验证试验中得到确认。
（2）直接接种法的验证分别做供试品组及对照组，与对照组比较供试品组微生物的生长情况。结果判断与薄膜过滤法的验证相同。
5、需要注意的问题
（1）培养基的适用性检查包括培养基的无菌性检查和培养基的灵敏度检查，验证试验的培养基适用性检查必须符合要求。
（2）验证试验用的菌悬液并不是只要活的菌体就行，而是要保持旺盛的生命力，所以，菌悬液存放时间不能太长。除黑曲霉孢子菌悬液外，其它试验菌液使用期限不超过24 h，并应置4 ℃冰箱保存。加菌量应小于100 cfu，无菌检查验证试验加菌量还不得少于10 cfu，以保证实验结果的重现性。
（3）薄膜过滤法采用大取样量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，仪器操作简单。该系统是全封闭过滤系统，避免了操作过程中外源性细菌的污染，对实验结果的可信性影响较小。因此，无菌试验采用薄膜过滤法或直接接种法并不依赖于验证试验确定，而是取决于供试品的特性，如能直接溶解过滤或处理后过滤的供试品均应采用薄膜过滤法检查。
总之，通过开展验证工作，积累了大量的经验和数据，使无菌制剂的无菌检查的验证方法已经具有较明确的思路和方法，增加了试验的可操作性；尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响，提高供试品的阳性检出率，使无菌检查方法更具科学性，保证检验结果的准确性[2]，为控制无菌制剂的质量奠定了基础。
参考文献：
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[3] 闫柏琴，李小燕．中药制剂微生物限度检查方法验证探讨[J]．中华中医药杂志,2014,23（3）：59．
论文作者:薛晶晶
论文发表刊物:《中国医学人文》2018年第6期
论文发表时间:2018/8/9
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