永顺县皮肤病防治所化验室 湖南湘西 416700
摘要：目的：探讨通过自麻风病流行区收集的水、土壤样本进行检测，对麻风杆菌检出情况。方法：自麻风病一般流行区采集标本49份，自高流行区采集标本31份，自较高流行区采集标本57份。从73个不同地域对119份水样采集，约500ml，从15个不同地域对23份土样采集，约50g，对麻风杆菌行PCR检测。结果：本次从不同流行程度的麻风病地区采集的水、土壤样品共137份中，PCR阳性共70份，经测序操作，含麻风菌共40份，达57.1%确认率。较高流行区样品57份中，PCR阳性29份，经测序，含麻风菌13份；高流行区样品31份，PCR阳性17份，经测序，含麻风菌13份；一般流行区样品49份，PCR阳性23份，经测序，含麻风菌14份。较高流行区共用水源无麻风杆菌DNA检出；高流行区和其它一般流行区部分水源水中有麻风杆菌DNA检出。结论：通过对麻风病流行区所收集的水、土壤检测显示，均有麻风杆菌检出，表明可能是引发麻风病的重要传染源，故需加大对水、土壤的管控力度，以改善高发状况。
关键词：水、土壤检测；麻风病流行区；麻风杆菌
近年来，随着我国在传染性疾病控制力度上的加强，麻风病呈低流行态势，但偶有新发病例，特别是在麻风病流行区，如何防范仍为相关部分研究重点。多项研究显示，通过对自麻风病流行的区收集的水、土壤展开检测，有麻风菌检出，并认为，此种水、土壤在一定程度上可能为麻风杆菌病原库，加强检测，对改善整体健康状况意义显著［1-2］。本次研究就此展开探讨，现回顾结果如下。
1 材料与方法
1.1 采集样品 自麻风病一般流行区采集标本49份，自高流行区采集标本31份，自较高流行区采集标本57份。从73个不同地域对119份水样采集，约500ml。包括共用饮用水源水，健康人家和麻风病患者家中水田水、饮用水、池糖水。从15个不同地域对23份土样采集，为麻风病患者水田瘀泥、房发周围的土样等，约50g。于4°C条件下冷藏。
1.2 处理样品
1.2.1 处理水样方法 于装有0.22μm滤膜的过滤装置中加入所采集的500ml水样，浓缩为50ml，设置离心条件为8000×g，行30min的离心操作，对沉淀予以留取。取Tris-HCL 1ml加入沉淀，最大程度混匀。将牛血清白蛋白在少量混悬液中加入，涂片，完成抗酸染色操作。于13000r/min离心条件下，对其余混悬液行20min离心操作，将上清液弃除，所获沉淀对DNA予以提取。
1.2.2 处理土样方法 取无菌纯水在土样中加入，并做充分的涡旋处理，适当静置后，对上层混悬液提取；重复多次，对混悬液50ml收集。取Tween20 0.05ml在混悬液加入，于600×g条件下，行15min离心操作，对上层液收集。在800×g条件下，对上层液行30min离心操作，将上清液弃除，对沉淀物留取。其它操作同水样。
1.2.3 提取DNA 取90μl的0.1mol/L Tris-HCL作混悬沉淀操作，于-70°C环境中，90°C环境中，作3次反复冻融处理，取10L蛋白酶K于离心管中放置，在56°C环境下，孵育2h。对蛋白酶K做灭活处理。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆于13 000r/min条件下，行3min离心操作，将上清液于-20°C环境中保存。
1.2.4 麻风杆菌PCR检测 阳性对照为NHDP63麻风菌株DNA。PCR反应条件为试剂盒推荐，在95°C环境中，行15min的预变性操作，后完成循环40个。单个循环设置：94°C环境中，行30s变性处理，60°C环境中，行90s退火，72°C环境中，行90s延伸，72°C环境中，行10min延伸。应用2%琼脂糖凝胶做电泳处理，于实验用凝胶成像仪下，对检测结果进行精准观察，若样品序列同NCBI数据库中所呈现的麻风菌序列有≧92%的同源性，可对此样品有麻风菌存在予以确认。
2 结果
本次从不同流行程度的麻风病地区采集的水、土壤样品共137份中，PCR阳性共70份，经测序操作，含麻风菌共40份，达57.1%确认率。较高流行区样品57份中，PCR阳性29份，经测序，含麻风菌13份；高流行区样品31份，PCR阳性17份，经测序，含麻风菌13份；一般流行区样品49份，PCR阳性23份，经测序，含麻风菌14份。较高流行区共用水源无麻风杆菌DNA检出；高流行区和其它一般流行区部分水源水中有麻风杆菌DNA检出。另外，不管一般流行或较高流行区，与日常生活关联性较强的池塘水、池塘边淤泥中，均有麻风杆菌DNA检出。而患者家门口土壤及水缸水中，也有较高的麻风杆菌DNA检出比例，为68.4％（26/38），且经测序，有麻风杆菌检出占69.2%（18/26）。
3 讨论
本次研究应用PCR-直接测序法，对水、土壤中含有的麻风菌DNA进行检验，为对分枝杆菌进行鉴定的金标准。本次所采集的水样本、土壤样本均为环境样品，故DNA具混合DNA性质［3-4］。虽引物具麻风菌特殊性，但因模板过于复杂，会对PCR扩增的效率和特异性产生影响，诱导非特异性产物生成，故对PCR反应参数予以优化，采取测序的方式，对样品中有无含麻风菌进行确认，具十分必要性。本次研究在开展PCR扩增前，对水、土壤部分样品做抗酸染色处理，应用特异性引物，对DNA扩增提取，得出现场环境中有分枝杆菌检出［5-6］。而患者家门口土壤及水缸水中，也有较高的麻风杆菌DNA检出比例，为68.4％（26/38），且经测序，有麻风杆菌检出占69.2%（18/26）。提示麻风病可经被污染的水传播。有研究示，土壤中含有的麻风菌与患者打喷嚏、咳嗽排出可能相关，同时，也有麻菌菌在人以外的环境中独立存在的可能，需加大研究力度，以对麻风病的流行予以控制。
综上，通过对麻风病流行区所收集的水、土壤检测显示，均有麻风杆菌检出，表明可能是引发麻风病的重要传染源，故需加大对水、土壤的管控力度，以改善高发状况。
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论文作者:张运锋
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第8期
论文发表时间:2018/5/29
标签：麻风论文; 杆菌论文; 麻风病论文; 检出论文; 土壤论文; 样品论文; 较高论文; 《中国误诊学杂志》2018年第8期论文;