冯国和, 赵桂珍, 竹上勉, 窦晓光, 乔光彦[1]2002年在《乙脑病毒prME与E蛋白编码基因重组构建的DNA免疫试验研究》文中指出目的 研究乙脑病毒prME、E蛋白的体外表达特点 ,比较不同重组质粒所进行的DNA免疫效率。方法 分别将乙脑病毒 (JaGAr 0 1株 )prME、E蛋白编码基因 (2 0 0 1bp、15 0 0bp)构建于融合FLAG标记基因的真核表达载体pcDNA(FLAG) 3上 (pJME、pJE) ,脂质体法将二重组质粒转染于HepG2及COS 1细胞系 ;采用不同抗体系统 (anti FLAG、anti E) ,经Westernblot法检测乙脑病毒prME[相对分子质量 (Mr)约 72× 10 3]与E(Mr 约 5 4× 10 3)蛋白表达水平 ;将质粒肌注BALB c鼠 ,二次免疫后 3周 ,腹腔注射乙脑病毒 (10 5PFU 10 0 μl)作为病毒攻击并观察 2 1d。 80 %空斑减少中和实验法检测中和抗体滴度变化。结果 anti FLAG可检测到由质粒pJME、pJE编码的相应蛋白产物在转染细胞内表达 ,同时在pJME转染的细胞内检测到一个新的 11× 10 3的低Mr 蛋白。anti E仅在pJME转染的细胞内检测到E蛋白。肌注pJME可产生高水平中和抗体滴度以及诱导有效的保护性免疫 ,效果等同于普通灭活JE疫苗 ,但优于pJE。结论 pJME的体外表达水平优于pJE。DNA免疫实验结果与prME、E蛋白体外表达特点相一致
冯国和[2]2002年在《乙脑病毒prME与E蛋白编码基因的构建、表达及DNA免疫的研究》文中提出目的 该研究从乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)JaGAr-01株中获取prME与E蛋白编码基因，构建到带有FLAG标记基因、CMV以及T7噬菌体启动子的真核表达载体pcDNA(FLAG)3上，分别命名为pJME与pJE；采用脂质体转染法分别将二重组质粒转染于HepG2、KN73以及COS-1动物细胞中，探讨质粒转染剂量和所编码的蛋白表达量之间的关系；分析由pJME与pJE编码的prME与E蛋白在不同哺乳动物细胞内的表达特点；采用肌肉注射与基因枪注射方式将pJME与pJE注射于鼠体内，分析由不同质粒所诱导产生的中和抗体滴度与保护性免疫变化；探讨在转染细胞内蛋白表达水平和DNA免疫效率的相关程度。 材料与方法 细胞、病毒、载体及动物：HepG2与COS-1细胞系分别来自于人肝癌细胞和猴肾细胞，培养于37℃、5％CO_2与含10％胎牛血清(Fatal calf serum，FCS)的Dulbeco'modified eagle medium(D-MEM)中；KN73细胞也来源于一种人肝间质细胞，培养于37℃、5％CO_2与含10％FCS的RPMI1640中，均用于细胞转染实验。乳地鼠肾细胞(Baby hamaster kidney，BHK)培养于37℃、5％CO_2与含1％FCS的Eagle medium(E-MEM)中，用于80％空斑减少中和试验(Plaque reduction neutralization test，PRNT80)。C6／36细胞系来自于蚊细胞并培养于28℃、含10％FCS与相应氨基酸的E-MEM中，用于JEV培养。野生型并具神经毒力的JEV JaGAr-01株，用于质粒构建及以后动物实验中的病毒攻击。所用表达载体为pcDNA(FLAG)3，在其多克隆位点区域内的HindⅢ／BamHI酶切位点之间插入FLAG标记基因(编码FLAG蛋白含8AA'，分子量约1KDa)，其同时带有巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)与T7噬菌体启动子。选用雌性、4周龄Balb／c鼠进行DNA免疫动物实验，免疫鼠在病毒攻击后被观察21日，每天检查其生存状态。 JEV prME与E蛋白编码基因的重组构建：从JEV感染的C6／36细胞中提取细胞内总RNA。RT-PCR方法分别扩增出JEV prME(2001bps)与E （1500hP）基因片段。两个不同 5’末端引物：5’－ATG AAG hG TCA AAT’ITC CAG GGGA，符合于 prME区域第 477至 501 核昔酸（nucleohde，nt）位点；5’－’I’IVf AAT TGT CTG GGA ATG GG，位于 E区域第978至997nt位点。共用相同 3’末端弓！物：5’－AGC ATG CAC Aw GCT CGC TAA GAA，互补于2454至 2477nt位点。此外，限制性内切酶 BaxnHI合成于 5’末端引物，Eec－Al合成于 3’末端引物。使用 QIAqUick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化 RT－PCR产物，ABI－PRSM＊310Genetic Analyzer（Pekin－Elmer／Applied）测序分析，并与发表的JaGAr－01株核酸序列进行比较。将BamHI／EcoAI酶消化的RT－PCR产物插于PcDNA厂LAG产的BamHI／EcoRI酶切位点之间。含有JEV PrME与E基因片段的重组质粒分别命名为PJME与PJE。将二者分别转化于大肠杆菌 JM109中并经 LB琼脂培养（AmPicillin，70u吵IIl，Sig－ma）筛选出阳性菌落，接种于 Znil LB培养液中，碱裂解法提取质粒。Burn－HI／ECORI酶切鉴定，再经位于载体上的’I7噬菌体启动子引物进行测序分析，以检测插人子与载体间的接合位点。扩增培养鉴定后的克隆，重复前述的鉴定步骤。再次鉴定后的质粒被调整成终浓度ling／Inl保存并用于转染实验。 pJME小JE的转染与表达：不同量的重组质粒分别为pJME：10 pg／well，sugiwell，3ug／well；PJE：10u吵well，swg／well，3ug／well；同时以 10ugiwellPCDNA厂LAG乃为阴性对照。采用脂质体转染技术将重组质粒转染于HePGZ细胞。具体为：将不同量 PJME、PJE以及 PcDNA厂LAG万分别与＊…脂质体混合后配制成终体积＊0…＊＊A许质体混合物，室温孵育15分钟后加人预先经无FCS的D－MEM冲洗的HepGZ细胞中，37℃3 ／J＼时孵育后更换新鲜含 10％FCS D－MEM培养液继续培养 48小时，收集细胞并悬浮于TE BufferhH7．5人以检测由重组质粒中插人子所编码的PrME上蛋白的表达。采用Anti－FLAG抗体系统检测分析HePGZ细胞内带有FLAG标记蛋白的JEV PrME下蛋白的表达特征。简言之，细胞裂解物经10％SDS一聚丙酸胺凝胶电泳，每种样品上样总量 20屿，之后转印于尼龙膜过夜（Transfer buffer＊．1呢SDS，25mM Tis，192InM Glycine，20啪Methanol），取膜经 TING－N b伽r（50mM Tis pH7．5，smM EDTA，150mM NaCI，0．25阮 Geratin，0．05％ Nonident P－40）室温处理 2 X 15分钟，将鼠源性 Anti－FLAG单抗与膜在 37℃反应 60分钟，TING－N b业r室温洗膜 2 x 15分 ·2·钟，将膜与连接辣根过氧化酶羊抗鼠IgG在37t反应60分钟，再次洗膜二X 15分钟，选用放大化学发光蛋白杂交检测系统检测结果，并经计算机软件 STORM860扫描成像。以 10Pglwell 的 PJME与 PJE分别转染于 KN73与COS八细胞，采用Anti－FLAG系统进行Western blot分析，检测相关蛋白在细胞内的表达特点，方法同前。采用Anti－E特异性抗体系统检测HepGZ人OS－1细胞内 E蛋白的表达。取前述的 10卜g／well pJME＊卜g／well
李喜梅[3]2008年在《乙脑病毒prME蛋白与鼠免疫球蛋白G Fc段编码基因的融合构建及鉴定》文中研究表明目的本项研究采用巢式-RT-PCR法从BALB/c鼠脾组织获取免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)G Fc段编码基因,用限制性内切酶从乙脑病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)重组子pJME中获取prME蛋白编码基因,分别将二者插入同一真核表达载体pcDNA3.1(+)不同酶切位点间,构建重组子命名为pJME/IgG Fc,并建立稳定表达融合蛋白的CHO细胞株,为流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)DNA疫苗增强效应等方面研究奠定基础。材料与方法一、实验材料1、细胞及动物中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞购自中国科学研究院上海细胞库,生长于37℃,5%CO_2及含10%胎牛血清(Fatal calf serum,FCS)的Dulbecco'modified eagle medium(D-MEM)高糖培养液中。BALB/c鼠购自中国科学院上海实验动物中心。2、质粒及菌株含JEV prME蛋白编码基因重组质粒被命名为pJME,由本实验室构建;真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司,用于JEV prME蛋白与IgG Fc段编码基因的融合构建;大肠杆菌JM109与DH5α购自Takara公司,用于重组质粒构建、转化。3、主要试剂RNA抽提试剂(Code No.D312),RT-PCR试剂盒(Code No.DR027A),DNA片断纯化试剂盒(Code No.DV807),DNA A尾试剂盒(Code No.D404),琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(Code No.DV805),DNA连接试剂盒(Code No.D6023),质粒小剂量提取试剂盒(Code No.DV801A),限制性内切酶EcoRI、BamHI以及NotI等均购自Takara公司,用于重组质粒的构建和酶切鉴定。脂质体(Lipofectamine2000)购自Invitrogen公司,用于CHO细胞转染。新霉素类似物(G418)购自GiBCO公司,用于CHO细胞抗性克隆株的筛选。氨苄青霉素购自Sigma公司,琼脂糖购自Takara公司,用于质粒的转化和电泳分析;D-MEM高糖培养液,10%FCS,青,链霉素均购自海科隆公司,用于CHO细胞的培养;山羊抗鼠IgG-Fc购自Santa公司,FITC标记的兔抗山羊CD32购自北京中杉公司,用于重组质粒转染后的免疫荧光检测;蛋白裂解液,上样缓冲液,PVDF膜,预染蛋白Marker购自碧云天公司,辣根酶标记兔抗山羊IgG购自北京中杉公司,均用于Western-blot分析。二、实验方法1、JEV prME蛋白与鼠IgG Fc段编码基因的重组构建从BALB/c鼠脾组织提取总RNA,巢式-RT-PCR方法扩增,经修饰后形成IgG Fc段编码基因片段,将其构建于测序载体pMD19-T simple EcoRI/NotI酶切位点,采用ABIPRSM~(TM)310Genetic Analyzer(Pekin-Elmer/Applied)及引物Bca BEST PrimerRV-M对重组质粒进行测序分析,并与Genebank公布的IgG Fc CDS区域序列相比较。反转录引物及3'末端外引物:5'GGT GGA GGT AGG TGT CAG AG 3',互补于IgG Fc CDS区域第1491～1510核苷酸(nucleotide,nt)位点;3'末端内引物:5'GCG GCC GCT TTA CCA GGA GAG TGG GAG AG 3',互补于IgG Fc CDS区域第1432～1460nt位点。5'末端外引物:5'AGC GAG ACC GTC ACC TGC AA3',符合于IgG Fc CDS区域第709～728nt位点;5'末端内引物:5'GAA TTCGGT GGA GGC GGT TCA GGT GGA GGT GGT TCA GGA GGA GGT GGA TCGATG GTG CCC AGG GAT TGT GGT TGT AAG 3',符合于IgG Fc CDS区域第718～795nt位点。限制性内切酶EcoRI(-GAA TTC-)合成于5'末端,NotI(-GCGGCC GC-)合成于3'末端。将EcoRI/NotI酶消化的RT-PCR产物插于真核表达载体pcDNA3.1(+)EcoRI/NotI酶切位点之间,此重组质粒命名为pcDNA3.1(+)/IgG Fc。将其热转化至大肠杆菌DH5α中并经LB琼脂(ampicillin,100mg/L,Sigma)培养筛选出阳性菌落,接种于3mL LB培养液中,小剂量提取试剂盒提取质粒。EcoRI/NotI酶切鉴定并再次用同样的方法测序分析。将重组子pJME转化大肠杆菌DH5α,同样的方法小剂量提取质粒,限制性内切酶BamHI/EcoRI进行酶切电泳鉴定,切胶获取JEV prME蛋白编码基因并经测序鉴定。用限制性内切酶BamHI/EcoRI对质粒pcDNA3.1(+)/IgG Fc进行双酶切,将获取的JEV prME蛋白编码基因插于pcDNA3.1(+)/IgG Fc的BamHI/EcoRI酶切位点之间,构建成含有JEV prME蛋白与BALB/c鼠IgG Fc段编码基因的重组子,命名为pJME/IgG Fc。转化pJME/IgG Fc于大肠杆菌DH5α,小剂量提取质粒并分别经BamHI/EcoRI,BamHI/NotI酶切电泳鉴定。2、pJME/IgG Fc稳定转染CHO细胞并获得稳定表达融合蛋白的细胞株确定本实验最佳G418筛选浓度:将常规培养的CHO细胞(1000个/mL)加入24孔板(0.7mL/每孔)孵育,6h后每孔分别加入不同浓度的G418,依次为600mg/L,650mg/L,700mg/L,750mg/L,800mg/L,850mg/L,900mg/L,每种浓度设3个孔,余下3孔为正常细胞对照。培养11d后确定能杀死所有细胞的最低G418浓度作为本实验的最佳筛选浓度,即为800mg/L。采用脂质体转染技术将重组子pJME/IgG Fc转染CHO细胞,同时设空载体pcDNA3.1(+)转染细胞,未转染细胞为阴性对照。具体为:转染实验前天以4×10~5细胞/mL接种CHO细胞于24孔板中(每孔0.5mL),37℃,5%CO_2条件下常规培养24h至转染当天细胞达到90%以上汇合。将pJME/IgGFc和pcDNA3.1(+)加入D-MEM培养液中(质粒/培养液:0.8μg/50μl),脂质体加入D-MEM培养液(脂质体/培养液:2μl/50μl)中室温孵育5min,将稀释的pJME/IgG Fc和pcDNA3.1(+)分别与脂质体稀释液轻轻混匀,室温孵育20min后加入预先经无FCS的D-MEM冲洗的CHO细胞中,常规培养6h后更换为新鲜含10%FCS D-MEM培养液继续培养18h,胰酶消化细胞以1:10的比例接种到新鲜的培养液中,常规培养24h后加入800mg/L G418筛选,根据液体颜色每3d换液1次,加压筛选7d,400mg/L G418浓度继续维持扩大培养阳性克隆。3、免疫荧光检测6孔组织培养板常规培养pJME/IgG Fc转染的CHO细胞,待细胞密度达到60%-70%时,4%多聚甲醛固定细胞1h,0.1%Triton-100打孔10min,10%BSA封闭1h,山羊抗鼠IgG Fc4℃过夜孵育,兔抗山羊CD32 37℃避光孵育1h,50%甘油封片后于荧光显微镜下观察。4、Western-blot分析细胞裂解物经8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,每种样品上样总量30μl,之后转印于PVDF膜过夜,取膜经5%脱脂奶粉室温振荡孵育2h后,将山羊抗鼠IgG Fc抗体与膜4℃过夜孵育,TBST室温洗膜3×10min,将膜与连接辣根过氧化酶兔抗山羊IgG在室温反应1h,再次洗膜3×10min,3',3'-二氨基联苯胺(DAB)法显色检测pJME/IGFc编码的特异性融合蛋白的表达。实验结果1、pJME/IgG Fc的重组构建巢式-RT-PCR法获得IgG Fc段编码基因经测序分析与发表的IgG Fc CDS区域序列相符合。酶切获取pJME中JEV prME蛋白编码基因,测序分析与发表的基因序列相符合。重组子pJME/IgG Fc经BamHI/EcoRI酶切释出的插入子与pJME经相同酶切释出插入子的分子量大小相一致,又经BamH I/NotI酶切释出的插入子分子量约在2500bps-3000bps之间。DNA测序分析两个目的基因在真核表达载体中正常连接。2、pJME/IgG Fc在CHO细胞中的转染G418最适筛选浓度为800mg/L。将转染pJME/IgG Fc的CHO细胞加压筛选(800mg/L G418)7d,培养板中可见小细胞团簇形成,G418浓度减半(400mg/L)维持培养约30d,普通光镜检查显示小细胞团簇逐步增大,细胞团簇之间逐渐融合。3、pJME/IgG Fc转染的CHO细胞的免疫荧光检测pJME/IgG Fc转染的CHO细胞可见较显着绿色荧光标记,主要分布在胞浆,也可见于胞膜。单纯载体转染或未进行转染的CHO细胞中未见特异性绿色荧光标记,仅见散在的非特异性绿色荧光杂质。4、pJME/IgG Fc转染的CHO细胞的免疫印迹分析将pJME/IgG Fc转染的CHO细胞裂解并提取蛋白进行Western blot分析,在大于Mr约95×10~3以上电泳区域内可检测得到一特异性蛋白带,而单纯载体转染或未进行转染的CHO细胞未见相应蛋白带。结论1、构建的重组子pJME/IgG Fc含有prME和IgG Fc基因。2、转染了pJME/IgG Fc的CHO细胞能够稳定表达prME和IgG Fc融合蛋白。3、pJME/IgG Fc表达的融合蛋白相对分子量为101×10~3,主要分布在胞浆,少量分布于胞膜。
程龙[4]2007年在《乙型脑炎病毒prM-E基因的克隆、表达及prM-E基因、E基因DNA免疫的研究》文中研究表明乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是引起母猪繁殖障碍的主要病因之一，给养猪业造成了巨大的经济损失，同时乙型脑炎是一种人畜共患病，是人类中枢系统最常见的虫媒病之一。因此，建立一种安全、简便、经济的制备乙脑诊断抗原的方法，寻求稳定、安全、新型的乙脑基因工程疫苗已经成为当今JEV防治的主要研究方向。本研究以乙型脑炎(JEV)SA14-14-2株全基因作为模板，根据文献设计出两对特异性引物，采用RT-PCR技术人工扩增出了JEV SA14-14-2株prM-E、E基因的cDNA。将纯化的prM-E基因成功地克隆到pUC19载体中，再转化到大肠杆菌JM109感受态细胞，得到的转化子经分子量比较和酶切分析筛选阳性克隆。结果表明，得到的阳性重组子(pUC19-prME)中含有prM-E基因，并且正确插入到载体中。将prM-E基因克隆到PET32a(+)载体上，得到的转化子经酶切分析，筛选出符合阅读框的重组子，构建成重组表达质粒PET-prME，再将重组表达质粒转化进宿主菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下表达出约为89KDa、53KDa和36KDa的叁条蛋白带。经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测证实表达产物具有免疫学活性，这为制备乙脑特异性抗原奠定了基础。作者将prM-E、E基因克隆到pcDNA3.1(+)载体上，得到的转化子经酶切分析，筛选出符合阅读框的重组子，构建成重组质粒pcDNA-prME和pcDNA-E。将构建好的重组质粒对Balb／c鼠进行DNA免疫：每组5只、4周龄、雌性Balb／c鼠共4组，分别将溶于50μL灭菌PBS溶液的不同免疫原肌注于不同组鼠的左后肢，具体包括pcDNA-prME，pcDNA-E，pcDNA 3.1各50μg，单纯PBS 50μL，共免疫2次，间隔2周。二次免疫两周后，各试验组小鼠(5／5)健康存活。分别采集各组小鼠的血，并分离血清，利用中和试验对抗体进行效价测定。结果是pcDNA-PRME、pcDNA-E免疫组的中和滴度分别为1：35和1：20。可以得出结论：使用pcDNA-prME与pcDNA-E重组质粒对小鼠进行肌肉注射可以产生中和抗体，pcDNA-prME所致的中和滴度略高于pcDNA-E。目前针对黄病毒的疫苗大多包含包膜E蛋白的中和抗原表位，而prM蛋白对维持E蛋白结构是必要的。因此，本研究分别用pcDNA-prME、pcDNA-E免疫小鼠，对比其免疫效果，为JEV核酸疫苗的研发提供了一些资料，创造了一定的条件。
张羽[5]2011年在《日本脑炎病毒NJ2008株人工突变致弱及其N-糖基化位点的功能研究》文中研究指明日本脑炎(Japanese Encephalitis, JE),又称流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B),是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病,与西尼罗病毒(West Nile Virus, WNV)和登革热病毒(Dengue Virus, DENV)等同属于黄病毒科黄病毒属。JEV在鸟与蚊子之间有一个区域性传播循环,猪作为中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。该病对养猪业的危害主要表现为夏秋季节母猪的繁殖障碍与公猪的睾丸炎,在我国流行面积较大,近年来经济损失较为严重,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。由于现阶段对于乙脑尚无治疗的特效手段,因此预防乙脑的发生尤为重要,而疫苗是控制该病发生的最佳手段。寻求稳定、安全的猪用乙脑疫苗,已经成为近年JEV感染防治的主要研究方向。反向遗传操作(又称感染性克隆)为在DNA水平上研究RNA病毒的基因组结构及功能和病毒宿主相互作用提供了重要手段,进而深入研究RNA病毒的本质和开发新产品。自反向遗传操作技术在乙脑病毒上应用以来,在对乙脑病毒致病机理、分子表达调控机制、细胞生长特性、毒力决定基因、疫苗研制等方面的研究已取得明显进展。本研究构建了两个突变感染性克隆株(突变E138、N154)分别在细胞和动物模型上验证其毒力的变化,为猪源乙型脑炎病毒减毒活疫苗的研制提供了一个良好平台；同时构建突变N154的重组真核质粒,通过其对小鼠细胞免疫水平、体液免疫水平以及免疫保护力的检测,评价其作为改良核酸疫苗的潜能。研究主要从以下几方面展开：1猪源乙型脑炎病毒NJ2008株全基因克隆及序列分析猪源乙型脑炎病毒NJ2008株是从南京某猪场流产胎儿的脑组织中分离并在BHK-21细胞上经数次传代,本实验根据乙型脑炎病毒SH0601株的基因组序列设计并合成JEV特异性引物进而应用RT-PCR技术分11段扩增了JEV NJ2008株基因,将所得片段克隆至pMD18-T载体上,经测序后获得了JEV基因组全序列。序列分析表明,该JEV基因组全长10,961bp,含有一个大的开放阅读框架,编码由3432个氨基酸残基组成的聚合蛋白,其5'非编码区(5’UTR)和3'非编码区(3'UTR)分别由95和578个碱基组成,与其它毒株比较发现3'非编码区(3’UTR)的44bp处共缺少16个碱基。通过全基因和E基因的进化树分析可得,猪源乙脑NJ2008株病毒属于基因Ⅲ型,该病毒的全基因与其它32株病毒核苷酸进行比较发现,同源性在99.4%和88%之间,与其它45株病毒E蛋白的核苷酸比较发现,同源性在99.2%和87.7%之间；该病毒的全基因与其它32株病毒氨基酸进行比较发现,同源性在99%和89.1%之间,与其它45株病毒E蛋白的氨基酸比较发现,同源性在99.5%和89.7%之间,突变位点分散于各个区域。与其它16株猪源乙脑病毒E蛋白的氨基酸比较发现,E蛋白的309位氨基酸发生了突变,由酪氨酸(Tyr)-丝氨酸(Ser),并且307-309位为乙型脑炎病毒E蛋白的一个B细胞线形表位。2猪源乙型脑炎病毒NJ2008株感染性克隆的构建及鉴定本实验根据猪源乙型脑炎病毒NJ2008株基因组序列设计并合成JEV特异性引物,进而应用RT-PCR技术分4段扩增了JEV NJ2008株全基因组cDNA。将扩增的1、2两个片段通过重迭PCR的方法扩增出JEV 5'cDNA,将扩增的3、4两个片段通过重迭PCR的方法扩增出JEV 3'cDNA。在扩增5’前端时,引入T7启动子序列用于后期的体外转录得到病毒的转录本,在基因组5’前端和3’末段分别引入SalⅠ和KpnⅠ酶切位点,最后将5'cDNA和3'cDNA连入pBluescriptⅡKS载体,构建的质粒命名为pSK-SUP、pSK-HYP。进一步的酶切鉴定及接头处序列测定的结果表明,成功获得了NJ2008株基因组全长cDNA克隆。用SalⅠBamHⅠ双酶切质粒pSK-SUP,用BamHⅠ、KpnⅠ酶切已经构建好的质粒pSK-HYPO,然后通过体外连接获得全长基因组。体外连接的全长基因组转录合成病毒RNA,转染BHK-21细胞,72h后将转染病毒RNA细胞冻溶1次后接种BHK-21细胞,拯救出病毒。通过间接免疫荧光证明病毒拯救成功,并且比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线,发现病毒学及分子生物学特性没有显着差异。通过测序分析,拯救病毒的氨基酸与亲本毒共有3个氨基酸的差异,尚没有文献报道该病毒的毒力与这3个氨基酸有关。以上结果表明JEV强毒株NJ2008株感染性克隆构建成功,建立了JEV疫苗株的反向遗传操作系统,为研究JEV的分子生物学以及致病机制提供了技术平台。3猪源乙脑病毒E138位突变株感染性克隆的构建与病毒拯救日本脑炎病毒E蛋白的138位氨基酸对于该病毒的毒力强弱起到至关重要的作用,所以本研究以乙脑病毒NJ2008株全长感染性克隆为亲本,利用反向遗传技术将该病毒的E蛋白138位谷氨酸(Glu)突变为赖氨酸(Lys),构建了突变株的全基因感染性克隆。将其转染乳仓鼠肾细胞(BHK-21),72h后出现病变,并在BHK-21细胞中盲传3代,通过病毒蚀斑形成试验、间接免疫荧光和荧光定量RT-PCR等方法与亲本感染性克隆株对比分析其感染性的差异。结果表明,突变病毒的蚀斑数和荧光数明显比亲本株少,在感染2-3d后,细胞内病毒RNA的量大约是亲本株的1/3。另外,在小鼠脑内接种同剂量的亲本株病毒和E138突变感染性克隆病毒,接种E138突变感染性克隆病毒株的小鼠的致病力大大降低。该实验将为猪源乙型脑炎病毒减毒活疫苗的研制提供了一个良好平台。4猪源乙脑病毒NJ2008株N-糖基化位点的突变影响病毒的复制、胞内定位以及致病力日本脑炎病毒E蛋白仅含有一个糖基化位点,N154-N-T。已经有文献报道,有些病毒E蛋白糖基化位点的改变会影响病毒的形态、感染力以及免疫应答,但乙型脑炎病毒该位点的突变是否影响病毒的感染力或致病力尚不清楚。所以本研究以乙脑病毒NJ2008株全长感染性克隆为亲本,利用反向遗传技术将该病毒的E蛋白154位天冬酰胺(Asn)突变为丙氨酸(Ala),构建了N154突变株的感染性克隆。将其转染乳仓鼠肾细胞(BHK-21),72h后出现病变,并在BHK-21细胞中盲传3代,通过病毒蚀斑形成试验、间接免疫荧光和荧光定量RT-PCR等方法与亲本株病毒对比分析其感染性的差异。结果表明,突变病毒的蚀斑数和荧光数明显比亲本株少,在感染2-3d后,细胞内病毒RNA的量大约是亲本株的1/2。通过激光共聚焦显微镜观察到,在感染BHK-21细胞的早期(24h),突变N154病毒与亲本毒的蛋白在细胞内的定位有所不同,突变N154病毒的蛋白在细胞中呈现明显的聚积。突变株病毒脑内接种乳鼠,对乳鼠致病力有所下降。由此可以看出,E蛋白糖基化位点的突变降低了乙脑病毒的复制、影响了蛋白在胞内的折迭以及降低了病毒的致病力,这也将为猪源乙型脑炎病毒弱毒疫苗致弱机理的作用研究而奠定良好的基础。5猪源乙脑病毒prM-E蛋白及其N-糖基化位点突变体的真核质粒构建PrM和E蛋白是乙型脑炎病毒两个重要的囊膜蛋白,将prM、E基因及prM的信号肽序列插入真核表达质粒pVAXI中构建重组真核质粒pVAXI-prME,其中prM和E各含有一个糖基化位点(N15,N154),单独或联合突变其糖基化位点,将天冬酰胺(N)突变成丙氨酸(A),构建3株突变的重组真核质粒pVAXI-prME-M1、pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3,重组质粒转染VERO细胞,利用间接免疫荧光证明亲本与3株突变的重组质粒在真核细胞内能有效的转录和表达；通过肽N-糖苷酶F (PNGase F)作用后,Western-blot检测表明突变糖基化位点的重组真核质粒表达产物的分子量小于亲本质粒的表达产物,并而这些重组质粒都能与JEV单克隆抗体特异性结合,证明其具有一定的生物学活性和抗原性。6猪源乙脑病毒prM、E蛋白N-糖基化位点对Balb/c小鼠的特异性免疫影响为了评价构建的亲本和突变重组真核质粒的免疫效力,将这4株重组真核质粒作为DNA疫苗免疫Balb/c小鼠。将6周龄Balb/c小鼠随机分成5组,每组14只,设pVAXI-prME、pVAXI-prME-M1、pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3共4个免疫组,同时设pVAXI空载体对照组,肌肉注射免疫,重组质粒的免疫剂量为100μg/只。然后通过测定抗体水平、抗体亚型、中和抗体和细胞因子(IL-4,IL-2和IFN-γ),并做了攻毒保护试验来衡量突变N154的重组质粒的免疫效果。结果表明：重组质粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3,即突变E基因的N154后,既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫,且体液免疫水平比pVAXI-prME高。抗体亚型分析结果表明,突变N154的重组质粒既能诱导IgG1的分泌又能诱导IgG2a的分泌,但以IgG1为主；同时细胞因子检测结果进一步表明突变N154的重组质粒主要诱导Th2型细胞因子(IL-4)的产生,因此说明其主要诱导产生Th2型免疫应答。攻毒实验结果表明重组质粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3色完全保护小鼠免受致死量的乙脑病毒的感染,因此通过突变E基因154位糖基化位点的DNA疫苗可以明显的提高体液免疫应答,并且可以为改良的JEV核酸疫苗提供依据。
周言, 张琳, 翟永贞, 李喜梅, 王占英[6]2007年在《不同途径接种乙脑病毒prME蛋白编码基因DNA疫苗所致BALB/c鼠的细胞免疫》文中研究表明目的:研究经不同途径接种乙脑病毒prME蛋白编码基因DNA疫苗所诱导的细胞免疫。方法:将乙脑病毒prME蛋白编码基因DNA疫苗(命名为pJME)分别以肌注、滴鼻两种免疫方式免疫BALB/c鼠,流式细胞仪检测脾脏CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群,乳酸脱氢酶释放实验测定脾脏特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果:pJME肌注组与滴鼻组免疫鼠CD4+T淋巴细胞百分比(30.91+0.72)%、(27.89+0.42)%,均高于灭活疫苗与载体肌注组(23.73+0.17)%、(23.78+0.21)%(P<0.05),肌注组显着高于滴鼻组(P<0.05);而CD8+T淋巴细胞百分比(14.62+0.25)%、(13.73+0.50)%,也均高于灭活疫苗和载体肌注组(10.80+0.39)%、(11.97+0.06)%(P<0.05),肌注组与滴鼻组无显着差异(P>0.05);两组有明显CTL效应(pJME肌注组29.1%,pJME滴鼻组17.1%),明显高于载体肌注组6.0%,pJME肌注组明显优于滴鼻组。结论:pJME以两种途径免疫鼠时可诱导明显细胞免疫反应。
翟永贞, 周言, 马力, 冯国和[7]2010年在《乙脑病毒prME蛋白与鼠GM-CSF编码基因的融合构建与表达》文中认为目的构建乙脑病毒prME蛋白与鼠GM-CSF融合基因重组子并建立稳定细胞表达株。方法套式-RT-PCR法从BALB/c鼠脾组织获取GM-CSF编码基因,用限制性内切酶从含乙脑病毒prME蛋白基因重组子获取prME蛋白基因,定向克隆至同一真核表达载体pcDNA3.1(+)不同酶切位点,构建重组子pJME/GM-CSF并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJME/GM-CSF转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。Western blot法检测转染的CHO细胞中融合蛋白表达。结果 pJME/GM-CSF经BamH I/EcoRI和BamH I/Not I酶切释出的插入子片段(2001 bp、2472bp)分别与预期结果相符合。所编码的融合蛋白相对分子量(Mr)为85×103。结论 pJME/GM-CSF成功构建,转染的CHO细胞可稳定表达融合蛋白。
闫丽萍[8]2007年在《流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因组序列分析及E蛋白抗原表位鉴定》文中提出流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种以蚊虫为媒介传播的人和动物共患的病毒性疾病，对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，对猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失。猪是JEV的中间宿主，带毒猪是本病的主要传染源。因此，控制猪的JE不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。本研究首先根据已发表的JEV SA14-14-2株基因序列设计合成了4对引物，通过RT-PCR从乙脑病毒SA14-14-2株经BHK21细胞传至第20代的毒株SA14-14-2-B20中扩增得到了覆盖乙脑病毒基因组全长的4个cDNA片段，将所得片段克隆至pMD18-T载体上，经测序和拼接后，获得了JEV基因组全序列(SA14-14-2-B20)。序列分析表明，该JEV基因组全长10 977bp，含有1个大的开放阅读框架，编码1个由3 432个氨基酸残基组成的聚合蛋白，其5’非编码区和3’菲编码区分别由95和583个碱基组成。将此全序列与SA14源病毒株核苷酸、氨基酸进行比较，同源性均在99％以上，突变位点分散于各个区域，而且发现SA14-14-2-B20一些位点和SA(A)及野毒株SA14核苷酸、氨基酸序列相同而与疫苗株SA14-14-2不同，推测这些区域可能与减毒没有关系。发现SA14-14-2-B20在3’非编码区第10 701位插入一个碱基G。比较了31株JEV全序列的3’非编码区，结果提示10701位碱基G插入区域可能是JEV易变位点。将SA14-14-2-B20序列与GenBank发表的31株JEV全序列进行同源性分析，以进一步了解JEV之间的遗传进化关系。本研究所获得的SA14-14-2-B20株全序列测定，一方面有助于揭示病毒的致病和减毒机理，另一方面也为减毒活疫苗生产的质量控制，主要为监控可能发生的回复突变提供分子基础。此外，病毒基因组全序列cDNA克隆的建立为进一步进行感染性克隆的研究奠定了基础。E蛋白是JEV的主要结构蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。本试验通过PCR扩增EF1(1～291aa)、EF2(292～402aa)和EF3(403～500aa)3个片段，PCR产物分别定向克隆到表达载体pGEX-6p-1中，经诱导各融合蛋白均以包涵体的形式表达。兔抗SA14-14-2病毒血清的ELISA和Western blot结果均表明EF1和EF2片段1～402aa是E蛋白的免疫优势决定区。为对这一免疫优势区域进行抗原表位鉴定，设计一套52个部分重迭的短肽，这些短肽覆盖全部1～402aa片段。将每一个短肽基因序列分别合成一对寡核苷酸链，退火后插入表达载体pGEX-6p-1，与GST进行融合表达，多数表达的融合蛋白以可溶解的形式存在。用JEV阳性血清进行Western blot和ELISA扫描，鉴定出11个抗原表位，分别为E1(1～16 aa)、E10(73～88 aa)、E11(81～96 aa)、E19(145～160 aa)、E33(257～272aa)、E39(305～320 aa)、E45(353～368 aa)、E47(369～384 aa)、E48(377～392 aa)、E49(385～400aa)和E63(373～388 aa)。通过Western blot蛋白免疫印记对鉴定的抗原表位进行精细分析，最终确定为9个抗原表位：E1(1～16 aa)、E10-4(77～84 aa)、E11-2(83～94 aa)、E19(145～160 aa)、E33(257～272 aa)、E39-2(309～316 aa)、E45-3(359～362 aa)、E48-1(377～384 aa)、E49(385～400aa)。应用此9个融合蛋白对小鼠进行免疫，结果表明9个融合蛋白均能诱导小鼠产生针对短肽的特异性抗体。且通过中和试验鉴定出E10(73～88 aa)、E39(305～320 aa)为线性中和表位。其中表位E10与现有的报道区域重替，另一个中和表何E39为新确定的。将鉴定的表位合成多肽，混合包被ELISA板，证实可以用于检测猪血清。本研究对JEV SA14-14-2株E蛋白进行抗原表位的鉴定，将有助于进一步阐明E蛋白的结构与功能，将为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法和基于表位疫苗的设计研究提供重要的研究工作基础。
陈弟诗[9]2011年在《猪乙型脑炎病毒—细小病毒—伪狂犬病毒活载体疫苗的研究》文中研究说明猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)及流行性乙型脑炎病毒(JEV)是引起猪繁殖障碍性综合征(SMEDI)的叁大主要病毒性病原,临床上常与免疫抑制性病毒：猪瘟病毒(HCV)、猪呼吸繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)等和一些细菌性疾病等混合或继发感染,除引起严重的繁殖障碍外,更导致猪病临床症状复杂多变性,增加治疗和防控的难度,造成巨大经济损失。为节约人力简化免疫程序、降低免疫干扰、减小动物应激、鉴别疫苗与野毒,研发一种高效、稳定、安全、方便的新型疫苗来同时预防和控制好当前叁种病毒病,是最大幅度降低猪繁殖障碍性综合征(SMEDI)及相关疫病行之有效的途径。PRV活载体和PPV VP2病毒样颗粒的联合应用,为发展新型动物疫苗提供了思路。本研究开展了对四川省猪场猪只PRV和JEV的血清学调查,以掌握其流行现状；研究了密码子优化的JEV多抗原表位串联基因e与PPV VP2嵌合DNA疫苗；并以猪伪狂犬病毒疫苗株SA215为载体,构建了JEV-PPV-PRV活载体疫苗。主要研究内容如下：1、四川省部分猪场伪狂犬和乙型脑炎的血清流行病学调查采用PRV gE ELISA检测试剂盒对2009年-2010年以四川省18个地区的27个具有代表性大中小型猪场不同批次送检的血清1177份进行了伪狂犬野毒的检测,并对数据进行了统计分析。结果显示,各猪场平均gE抗体阳性率为8.2%,阴性猪场占59.3%,川东北区阳性率最高为18.8%,公猪野毒感染率最高达7.4%,基础母猪规模为100头以下的小型猪场猪只伪狂犬野毒阳性率最高为52.7%。对四川省10个地区的14个猪场进行PRVgB抗体ELISA检测,结果显示,各猪场gB抗体阳性率从最低的66.7%到最高100%,14个猪场平均抗体阳性率达87%,表明四川省PRV的免疫情况参差不齐,差异较大。采用JEV抗体ELISA检测试剂盒对四川14个地区21个规模化猪场从2009年2月至2010年10月的1100份样品进行了检测,并对数据进行了统计分析,结果显示,JEV抗体总阳性率为75.1%,川西区抗体阳性率最高为83.6%,4月份抗体阳性率逐渐升高,到5月份阳性率达到第二高水平92.1%。将826份JEV ELISA检测为阳性的样品按照猪群类别分类随机抽样20%,采用JEV RT-PCR进行检测,结果显示,后备猪阳性率为6.5%最高,表明四川省猪群存在JEV感染。2、乙脑E基因多抗原表位基因的设计和原核表达通过生物信息学方法对JEVE蛋白抗原表位进行了预测,结合文献报道筛选出5个B细胞表位和1个T细胞表位,为了增强细胞免疫应答引入通用辅助T细胞表位(PADRE),选取合适的接头Linker序列将各表位进行不同顺序线性串联组合,初步优化获得基于多抗原表位疫苗分子的氨基酸序列,并用生物软件对串联的乙脑多表位肽进行了分析评价。以原核表达质粒pET-32a为载体,构建了含JEV多抗原表位串联基因的原核表达质粒pET-e,经IPTG诱导成功表达,Western blot结果表明,JEV阳性血清能特异性识别JEV多抗原表位串联基因e的表达产物,表明JEV多抗原表达蛋白e具有免疫原性,为后续研究奠定了基础,以便应用于基因疫苗研制。3、猪细小病毒VP2蛋白N端甘氨酸富集区的缺失对病毒样颗粒的形成及免疫原性的影响PPV VP2蛋白N端连续9个甘氨酸富集的编码区是VP3蛋白的切割位点,常规PCR扩增容易导致该区段的缺失,为研究该缺失对PPV VLPs的影响,探索VP2病毒样颗粒上适合外源基因插入的位点,笔者构建了该区段缺失的VP2的真核表达载体pCI-△VP2,并以完整VP2作为对照,采用脂质体介导法转染Vero细胞,通过生物信息学技术,SDS-PAGE和Western-boltting,间接免疫荧光以及正染和免疫电镜对表达产物进行分析观察；进一步将重组质粒以核酸疫苗的方式直接肌注免疫小鼠,采用间接ELISA试验,淋巴细胞增殖试验和T细胞亚群流式细胞技术,分析免疫小鼠的体液和细胞免疫应答。结果显示,缺失△VP2和完整VP2在Vero细胞中均能自我装配成VLPs,并具有与完整病毒粒子类似血凝性,pCI-△VP2和pCI-VP2均可诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和良好的细胞免疫应答。结果表明,甘氨酸富集区的缺失不影响VP2病毒样颗粒的装配和免疫原性,△VP2同样可进行PPV VPLs疫苗和抗原转运载体的研制,为VPLs载体改造和修饰位点的探索提供了新方向,为VP2基因结构与蛋白质功能的关系提供了新的理论依据4、密码子优化的JEV多抗原表位e与PPV VP2嵌合真核表达载体pCI-Ve的构建按照哺乳动物密码子偏爱性对JEV多抗原表位串联基因e进行了密码子优化,人工合成密码子优化的e基因,将密码子优化的e基因连接到PPV VP2的N端,以真核表达载体pCI-neo为基础,分别构建了含密码子优化的JEV多抗原表位e的pCI-e和密码子优化的JEV多抗原表位与PPV VP2嵌合基因Ve的真核表达质粒pCI-Ve。构建的重组质粒pCI-e和pCI-Ve由脂质体介导转染Vero细胞,经过SDS-PAGE和Western-blotting,以及间接免疫荧光检测,结果表明e和Ve成功表达,具有免疫原性,电镜观察重组质粒pCI-Ve的细胞表达产物,表明产物可能形成病毒样颗粒。5、JEV-PPV新型核酸疫苗的免疫效果研究将真核表达质粒pCI-Ve、pCI-e和pCI-VP2以肌肉注射方式,100μg/只剂量免疫健康昆明鼠,2周后相同剂量加强免疫一次,检测其体液免疫和细胞免疫情况,同时检测了中和抗体产生情况,还通过攻毒实验对pCI-Ve的免疫保护作用进行了评价。结果表明,pCI-Ve够诱导小鼠产生良好的体液和细胞免疫应答,对致死剂量的JEV强毒攻击能提供75%的保护率,表明pCI-Ve具有作为预防猪乙脑和细小病毒病的新型DNA疫苗的潜力。6、JEV-PPV-PRV活载体疫苗的研究将密码子优化的JEV多抗原表位基因e和PPV VP2嵌合基因Ve连接到本实验室的通用PRV SA215转移载体中,构建了转移载体pPI-Ve,通过与亲本株PRV SA215同源重组,构建了重组PRV SA215(G)。经Western-blot、PCR、绿色荧光和细胞病变的观察鉴定,结果表明PRV SA215 (G)构建成功。通过在Vero细胞上的致病变效应和电镜观察表明插入外源基因Ve几乎不影响亲本株SA215的生物学特性,电镜观察到PRV SA215 (G)在Vero细胞培养物中形成比VP2病毒样颗粒稍大的类似颗粒,推测表达了Ve嵌合病毒样颗粒。猪只免疫试验结果表明,PRV SA215 (G)以106.0TCID50/只,1次性肌肉注射免疫仔猪,能诱导较好的JEV、PPV和PRV体液免疫应答,能诱导良好的Thl型和Th2型细胞免疫应答,主要为Thl型,能产生亲本株类似的中和抗体效价。表明PRV SA215(G)可作为预防JEV、PPV和PRV的活载体疫苗的优良候选株。
常彩芳[10]2010年在《乙脑病毒非结构4A蛋白编码基因重组构建与表达》文中研究表明目的构建乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)非结构(non-structure, NS)4A蛋白编码基因重组子,将其转染中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞并用间接免疫荧光法探讨该重组子的表达特征,为进一步研究JEV NS4A蛋白的生物学功能奠定基础。材料与方法一、实验材料(一)细胞、质粒及菌株CHO细胞购自中国科学研究院上海细胞库,生长于37℃,5%CO2及含10%胎牛血清(Fatal calf serum, FCS)的Dulbecco'modified eagle medium (DMEM)高糖培养液中；含FLAG片段的JEV NS4A蛋白编码基因重组质粒被命名为pJNS4A由本实验室构建；真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司,用于JEV NS4A蛋白编码基因重组子的构建；大肠杆菌JM109与DH5a购自Takara公司,用于重组质粒构建、转化。(二)试剂及抗体RNA抽提试剂(Code No.D312), RT-PCR试剂盒(Code No.DR027A),DNA片断纯化试剂盒(Takara, product No.DV807), DNA A尾试剂盒(Takara, product No.D404),琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(Takara,product No.DV805),DNA连接试剂盒(Takara,product No.D6023),质粒小剂量提取试剂盒(Takara,productNo.DV801A),限制性内切酶EcoRI、BamHI均购自Takara公司,用于重组质粒的构建和酶切鉴定。脂质体(Lipofectamine2000)购自Invitrogen公司,用于转染CHO细胞。氨苄青霉素购自Sigma公司,琼脂糖购自Takara公司,用于质粒的转化和电泳分析；DMEM高糖培养液,10%FCS,青霉素购自海科隆公司,用于CHO细胞的培养；兔抗鼠IgG Fc(一抗),购自Cell Signaling公司,山羊抗兔(荧光二抗)购自北京中杉金桥公司,用于质粒转染后的免疫荧光检测。二、实验方法(一) JEV NS4A蛋白编码基因重组质粒构建与鉴定以JEV SA14-14-2株Total RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增JEV NS4A基因片段,并在该基因片段的5’端加入FLAG序列,再在其两侧加入起始密码子与终止密码子,最后在其两侧加入BamHI/EcoRI酶切位点。将反转录引物：5'GAATTCTTAGGCTCCTGCACAAGCT ATGAC3'及限制性内切酶EcoRI(-GAATTC-)合成至JEV NS4A编码基因5’末端。PCR法扩增前向引物5'GGATCCATGACTAAAAAACCAGGAGGGC3',将BamHI(-GGA TCC-)合成至5’末端,反向引物为上述反转录引物。1%琼脂糖凝胶电泳并回收最终PCR产物,后者与pMD19-T simple连接构建重组子pMD-JNS4A。使用PrimeSTAR(?) HS DNA Polymerase (CodeNo.DR0--10S),对重组质粒CTB756-T-7为模板,以CTB906 F(5'CGGGATCCATGG ACTAC AAGG ACGACGATGAC AAGATGTC AGCCGTTAG CTTCATAG3')为引物进行PCR扩增。将PCR扩增产物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No. DV805A)进行切胶回收约900bp的片段后,使用BamHI/EcoRI进行酶切,经乙醇沉淀后,命名为Insert DNA；将质粒pcDNA3.1(+)使用BamHI/EcoRI进行酶切,然后使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code--No.DV805A)切胶回收约5.4kbp的DNA片段后,命名为Vector DNA;使用TaKaRa DNA Ligation Kit (Code No. D6022)中的Solution I将Insert DNA和Vector DNA连接后,热转化至E.coli Competent CellJM109(Code No.D9052)中,涂布平板,37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌,提取质粒命名为CTB906-2,使用引物T7、BGHrev对上述质粒进行测序,结果正确。转化pJNS4A于大肠杆菌DH5α,小剂量提取质粒pJNS4A,并用BamHI/EcoRI酶切进行核酸电泳鉴定。(二)pJNS4A稳定转染CHO细胞采用脂质体稳定转染法即Lipofectamine 2000将pJNS4A转染CHO细胞,同时设转染空载体pcDNA3.1(+)的CHO细胞与未转染的正常CHO细胞为阴性对照。具体方法为：1、转染实验前在6孔板中培养CHO细胞,待细胞生长浓度约90%-95%,即每500ul含0.5-2.0×105／个。配制脂质体／质粒混合物：溶液A、B：分别将重组质粒pJNS4A和空载体pcDNA3.1(+)各8μg(每孔)加入DMEM培养液(不含胎牛血清)500ul中溶液总体积各为250μl(每孔),轻轻混匀,标记；溶液C：将20μl脂质体加入500μlDMEM培养液中,共四管,轻轻混匀,室温孵育5分钟；分别将A与C,B与C液体混合,室温放置20分钟(这时溶液会变浑浊)以形成脂质体／质粒混合物；弃去6孔板中的原液,向6孔板中逐滴加入上述混合液体,边加边摇动培养板,每孔2ml,做标记。在37℃,5%的CO2中培养4小时后,改用无血清无抗生素的DMEM培养液继续培养。2、筛选6孔板培养24小时后,改为24孔板继续培养。用含G418浓度依次为100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900ug／mL的DMEM培养。每种浓度设3个孔,转染空质粒的CHO细胞及正常CHO细胞为对阴性照组。培养15 d后,以能杀死所有正常CHO细胞的最低G418的浓度作为本实验的最佳筛选浓度即为100 ug／m L,维持培养。(叁)免疫荧光检测将转染pJNS4A的CHO细胞、转染空载体的CHO细胞及正常的CHO细胞接种于6孔板中的盖玻片,以盖满玻片不溢出为度,标记。于37℃,5%CO2的条件下常规培养待细胞密度达到约60%-70%时,4%多聚甲醛固定细胞1 h,0.1%Triton X.100打孔10 min,10%BSA封闭1 h,兔抗鼠IgG Fc分别按1：800稀释,4℃孵育过夜。FITC标记山羊抗兔IgG按1：00稀释浓度,于37℃避光孵育1 h,50%甘油封片后于荧光显微镜下观察荧光标记。结果1、JEV NS4A蛋白编码基因构建(1)以JEV SA14-14-2株Total RNA为模板,经重组构建含有FLAG片段的JEV NS4A蛋白编码基因重组子pJNS4A。经酶切鉴定表明：重组质粒经BamHI/EcoRI酶切释出的插入子与pJNS4A经相同酶切释出插入子的分子量大小相一致,均约为900bps,使用引物T7、BGHrev对上述质粒进行测序,含有JEVNS4A蛋白编码基因片段,证明质粒构建成功。(2)将pJNS4A在感受态大肠杆菌中扩增,提取质粒RNA,行核酸电泳对其鉴定。可见在约900bps的位置上有一明显条带,证明质粒构建成功。2、JEV NS4A蛋白编码基因重组质粒转染CHO细胞免疫荧光鉴定转染pJNS4A的CHO细胞可见存在较显着绿色荧光标记,主要分布在胞膜。在正常CHO细胞及转染空质粒的CHO细胞中未见特异性绿色荧光标记,仅见散在的非特异性绿色荧光杂质。结论1、构建的重组子pJNS4A含有JEV NS4A编码基因。2、转染了重组子pJNS4A的CHO细胞能够稳定表达JEV NS4A,其主要分布在胞膜。
参考文献：
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