山东省青岛市第一中学 266002 指导教师：张德超
摘 要: 海葡萄（学名长茎葡萄蕨藻），是蕨藻属的一种可食用藻类，海葡萄对生长环境和水质的要求极高，人工养殖难度大。本研究以海葡萄表面粘附着细菌为研究对象，从海葡萄样品分离可培养海洋细菌，并基于16S rRNA 基因序列分析的方法分析样品中的细菌多样性。
关键词：海葡萄 海洋细菌 多样性
海葡萄（学名长茎葡萄蕨藻），也被称为“绿色鱼子酱”，是一种生长在热带海域的食用海藻，口感清新鲜香，是寿司的“绝配”。海葡萄原生于日本冲绳，是蕨藻属的一种可食用藻类，长茎葡萄蕨藻的直立枝外形类似葡萄，其藻体可分为匍匐茎、直立枝和丝状假根三部分，整个藻体为一个多核细胞。由于长茎葡萄蕨藻对生长环境、水质的要求极高，人工养殖难度大。目前只有在菲律宾马丹岛、日本冲绳岛、中国台湾地区及大陆沿海城市青岛、海南内陆有这种海藻的养殖场。
细菌胞外具有一层分泌的粘多糖，具有附着于物体表面的特点，在各种动物、藻类和沿海植物的表面也能形成微生物膜，附着性几乎是海洋微生物的普遍特性。在海洋藻类生长过程中,伴随着海洋细菌的共同作用,有些附着细菌可能提供藻类有效营养，有些附着细菌可能对藻类产生治病性。
本研究主要以海葡萄为材料,对其表面可培养的粘附着细菌进行分离培养和系统发育分析,旨在为进一步深入了解海葡萄在生长过程中对其产生影响的细菌种类。
一、材料与方法
1.材料
（1）样品来源。
样品由青岛海葡萄有机绿藻研发养殖有限公司提供。
（2）样品前期处理。
首先用无菌海水冲洗海葡萄3-4次，吸干藻体表面水分，称取海葡萄样品0.5g（3份），放入装有10mL无菌海水的离心管中，利用超声波破碎仪（宁波新芝JY 92-II型）处理。
（3）分离培养基。
2216E海水培养基：蛋白胨 (OXOID) 5g、酵母提取物（OXOID）1g、琼脂15g。用1000ml海水配制，pH值为7.5。
2.方法
（1）海洋细菌的分离。
用生理盐水（0.9%，NaCl）对样品进行10倍系列稀释，涂布在2216E海水培养基上，25℃培养7天，根据菌落形态等特征挑取不同菌落, 在培养基平板上划线纯化, 每个菌落纯化至少2次。用25%甘油将分离纯化的菌株保存于-80℃超低温冰箱。所有步骤均按常规无菌方法操作。
（2）海洋细菌的系统发育分析。
根据菌落的形态和培养特征等指标选取特征不同的菌株用酚氯仿抽提和乙醇沉淀法进行细菌总DNA的提取。
采用细菌16S rRNA基因扩增通用引物，27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1541r（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）。
PCR反应条件（30个循环）：预变性：94℃，4min；扩增：94℃变性，1min；55℃复性，1min；72℃延伸，1min, 共28个循环。补齐：72℃延伸，10min。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 目的片段大小约为1.5Kb。
PCR扩增产物经过切胶纯化后，送华大基因公司采用ABI 377 DNA测序仪对DNA进行测定。
通过Blastn程序对菌株的16S rRNA基因序列进行相似性比对，用Clustal X软件进行序列相似性分析和序列比对，采用软件Mega 5.0程序，Neighbor-joining方法构建系统发育树。
二、结果与分析
菌株的分离和系统发育分析。
一共分离得到10株海洋细菌。这些菌株测序后，将序列结合在Genbank的搜索结果，利用软件Mega 5.0采用Neighbor-joining方法，构建系统发育树。
这些菌株分布在7科和8属中。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆其中8个菌分布于γ变形菌纲（γ-Proteobacteria）的5科、6属（Cobetia、Pseudoalteromonas、Marinobacter、Alteromonas、Marinomonas和Vibrio）中；一个菌分布于黄杆菌纲（Flavobacteriia）的Flavobacteriaceae科；另一个菌分布于α变形菌纲（α-Proteobacteria）的Rhodobacteraceae科。
本研究分离的菌株大多属于γ-变形菌纲，γ-变形菌纲中主要包括交替单胞菌目（Alteromonadales）、海洋螺菌目（Oceanospirillales）、假单胞菌目（Pseudomonadales）和弧菌目（Vibrionales）。这四个目细菌在海洋环境中广泛存在，通过分析分离各个目所属菌株与其相关菌株的系统发育关系，可以初步推测该菌株可能具有的生理特性。
菌株HP-6同具有反硝化和降解功能有关的除烃海杆菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）相似性最高。
菌株HP-1同中温黏着杆菌（Tenacibaculum mesophilum）相似性最高，中温黏着杆菌广泛分布于各种藻类和海洋生物表面，推测菌株HP-1同海葡萄生长过程中相互作用，提供营养物质和保护作用。
菌株HP-2同Epibacterium mobile相似性最高，Epibacterium mobile也广泛分布于各种藻类表面。
菌株HP-10同致病弧菌Vibrio fortis相似性最高，推测菌株HP-10对海葡萄的生长具有致病性。
细菌是海洋生态系统的重要组成部分, 藻类和细菌之间的关系也越来越引起人们的重视。黄建辉等研究了不同的氮浓度、磷浓度及培养方式对海葡萄生长的影响。
结果表明，水体中的氮浓度对长茎葡萄蕨藻生长的影响具有差异; 水体中的磷浓度对长茎葡萄蕨藻生长的影响没有差异; 不同的培养方式对长茎葡萄蕨藻的生长有很大的影响。
刘杰等对青岛海域爆发中后期的浒苔表面粘附着细菌研究发现，分离的18株浒苔粘附着细菌共分布在8科、10属之中。其中有7株菌分布于α-proteobacteria;7株菌分布于γ-proteobacteria中;4株菌分布在Flavobacteriaceae、Microbacteriaceae和Bacillaceae的3个属当中。
本文从16SrDNA系统发育途径研究了海葡萄可培养粘附着细菌的多样性状况，实验结果在一定程度上可为海葡萄的培养提供理论依据。
参考文献
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论文作者:王玉琛 王健祥
论文发表刊物:《素质教育》2019年6月总第307期
论文发表时间:2019/4/19
标签：菌株论文; 细菌论文; 葡萄论文; 藻类论文; 生长论文; 相似性论文; 海洋论文; 《素质教育》2019年6月总第307期论文;