【摘要】 目的：通过单因素实验探究初步提取苦丁茶中总黄酮的最佳实验条件。方法：以纤维素酶-微波联合法提取黄酮，并通过单因素试验探究最佳工艺提取工艺。结果：最佳工艺条件为酶解温度45℃，PH5.0，酶解时间0.5h，酶用量0.02％，乙醇体积分数40％，乙醇用量30ml.微波时间50s。在此条件下，黄酮初步提取率比酶法提取和微波法提取有所提高。结论：该实验方法可作为提取苦丁茶中总黄酮参考，欲得出精确的总黄酮提取率还需进一步对提取物分离纯化。
【关键词】 总黄酮；纤维素酶；微波提取；单因素实验【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-7165(2015)16-0140-01Optimal extracting conditions for f lavonoids in Leaves of Llex latifolia and the value of itshealth care researchWU Rui-ling(China pharmaceutical university college of pharmacy Nanjing 210000 China)[Abstract] Objective:To obtain the optimal conditions for extacting flavonoids in Kuding tea by single-factor experiment. Methods:Extracting theflavonoids in Kuding tea using cellulose-microwave method,single factor and single-factor experiments were applied to obtain the best extractiontechnology. Results:The optimum extraction condition was based on 0.5h cellulose hydrolysis at 45℃ and PH 5.0 with an enzyme dose of 0.02％followed by extraction with 40％ ethanol 30ml under the assistant of microwave treatment for 50s. The average yield of flavonoids is more than enzymemethod and microwave method. Conclusion:The methods can be reference to extract flavonoids in Kuding tea. It is necessary to separate and purifyextraction to get accurate extraction yield of flavonoids.[Keywords] Total flavonoids; cellulase; microwave extraction; single-factor experiment
苦丁茶富含皂苷类、萜类、黄酮类、多酚类、氨基酸类、生物碱类和挥发油等活性物质，具有降血压、降血脂、降血糖、抗肝毒、抗炎、抗病毒、改善心脑血管循环等功效[1]。苦丁茶中黄酮类含量远高于其他茶叶[2]，而黄酮类化合物有抗菌抗炎、氧化、抑制脂肪酶等作用，有些还可作为CYP1A1和CYP1B1的底物或抑制剂，从而抑制肿瘤细胞的增长和潜在致癌作用的发生[3]，因此，苦丁茶中黄酮类物质有很好的保健开发前景和研究价值。目前，苦丁茶中总黄酮的提取方法主要是有机溶剂萃取法，微波或声波提取法，纤维素酶解法等[4-5]，与传统工艺相比。纤维素酶能破坏苦丁茶细胞壁纤维素的苷键，使细胞壁疏松破裂，减少提取过程中的传质阻力，从而提高提取效率[6]，无毒性，反应条件温和易控。微波可直接作用于分子，使其热运动加剧从而破坏细胞壁，使有效成分提出[7-8]。本实验参考孙俊[9]，曾柏全[10]的纤维素酶-微波联合提取法，借鉴前人分别用纤维素酶法与微波法提取苦丁茶中总黄酮的工艺，尝试联合这两种方法，最大限度的提高黄酮提取率，以探索一种简便有效的黄酮提取新工艺。
材料与方法1 材料与仪器苦丁茶为市售的炒制成品，粉碎后过80目筛，存于广口瓶中备用。芦丁试剂(中国药品生物制品检定所)；硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇、氢氧化钠(南京化学试剂有限公司)；纤维素酶(南京都莱生物技术有限公司)。所有试剂均为分析纯，溶液均为蒸馏水配置。
主要仪器：UV-722S紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(W-201B数显恒温水浴锅)；分析天平(塞多利斯科学仪器北京有限公司)；超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；SHB-3A循环多用真空泵(杭州天立大卫科教仪器有限公司)；PH计(上海精密科学仪器有限公司)；格兰仕微波炉(佛山市格兰仕微波炉电器有限公司)；高速冷冻离心机(上海江星仪器有限公司)；高速万能粉碎机(天津市华鑫仪器厂)。
2 方法2.1 标准曲线的制定精密称取120℃干燥至恒重的芦丁标准品5mg，置于50ml容量瓶中，加入乙醇定容，摇匀，超声20分钟，制成浓度为0.1mg·ml-1的芦丁标准溶液，分别精密量取芦丁标准溶液0ml,1ml,2ml,3ml,4ml,5ml于10ml比色管中，加5﹪亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6min后加入10﹪硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6min后加入4﹪氢氧化钠3ml,摇匀并加入蒸馏水至刻度，静置15min，在波长510nm处测定各溶液吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得芦丁浓度C与吸光度A之间的回归方程：y=6.08x-0.0044, R为0.99909.2.2 纤维素酶提取总黄酮工艺在苦丁茶粉末0.5g中加入适量纤维素粉末，加入少量乙醇溶液与PH缓冲溶液酶解,再用乙醇水溶液浸提，于恒温水浴中酶解一定时间，灭活，抽滤得滤液，用乙醇定容到50ml。取0.4ml总提取液于10ml比色管中，0.06ml5%的亚硝酸钠，摇匀后放置6min,加入0.06ml10%的硝酸铝,摇匀后放置6min,再加入0.6ml4%的氢氧化钠，混匀，用蒸馏水定容至刻度，15min后测定A510nm，根据芦丁标准曲线方程计算总黄酮浓度，从而计算苦丁茶粉末中总黄酮的提取率。
总黄酮浓度=(提取液体积×提取液总黄酮化合物浓度)／苦丁茶粉末的质量×100﹪2.3 纤维素酶提取总黄酮的工艺参数确定设置单因素实验分别考察酶解温度、酶解时间、酶用量、PH、乙醇体积对总黄酮提取率的影响。
①酶解时间。分别称取5份0.5g苦丁茶粉末于50ml容量瓶中，加入1.0mg纤维素酶，加入10ml50%的乙醇，室温下分别酶解0.5h,1.0h,1.5h,2.0h,3h，于70℃水浴5min灭酶活，取出冷却后加入25ml50%的乙醇，40℃恒温水浴1.5h后过滤，滤液用50%乙醇定容至50ml，稀释25倍，按照2.1方法计算苦丁茶中总黄酮量提取率。
②酶用量。分别称取5份0.5g苦丁茶粉末于50ml容量瓶中，分别加入0.5mg.1.0mg.1.5mg,2.0mg,3mg纤维素酶，其余条件参照①，计算总黄酮提取量。
③酶解温度。分别称取5份1g苦丁茶粉末于50ml容量瓶中，加入1.0mg纤维素酶，分别于40,45,50,55,60℃酶解2h，其余条件参照①，计算总黄酮提取量。
④PH。分别称取5份0.5g苦丁茶粉末于50ml容量瓶中，加入1.0mg纤维素酶，加入10ml50%的乙醇，分别调节体系的PH值为3.0,3.5,4.0,4.5,5.0，其余条件参照①，计算总黄酮提取量。
⑤乙醇体积分数。分别称取5份0.5g苦丁茶粉末于50ml容量瓶中，加入1.0mg纤维素酶，加入10ml体积分数为40%,50%,60%,70%,80%的乙醇，其余条件参照①，计算总黄酮提取量。
⑦乙醇用量。分别称取5份0.5g苦丁茶粉末于50ml容量瓶中，加入1.0mg纤维素酶，调节PH4.5，20min后，分别加入25,30,35,40,45ml50%的乙醇，其余条件参照①，计算总黄酮提取量。
2.4 微波提取总黄酮工艺精密称取1.0g 苦丁茶粉末于50ml容量瓶中，加入10ml50%乙醇水溶液，微波提取一段时间后，离心15min，重复提取后合并上清液，将上清液置于50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。取0.4ml总提取液于10ml比色管中，0.06ml5%的亚硝酸钠，摇匀后放置6min,加入0.06ml10%的硝酸铝,摇匀后放置6min,再加入0.6ml4%的氢氧化钠，混匀，用蒸馏水定容至刻度，15min后测定A510nm，根据芦丁标准曲线方程计算总黄酮浓度，从而计算苦丁茶粉末中总黄酮的提取率。
总黄酮浓度=(提取液体积×提取液总黄酮化合物浓度)／苦丁茶粉末的质量×100﹪2.5 微波提取总黄酮的工艺参数确定设置单因素实验分别考察乙醇浓度、乙醇体积、微波时间对总黄酮提取率的影响。
①乙醇浓度。精密称取1.0g 苦丁茶粉末于50ml容量瓶中，分别浸没于10ml浓度为40%,50%,60%,70%,80%的乙醇溶液中，在微波炉中低火加热80s，根据2.4测定苦丁茶中总黄酮提取率。
②乙醇体积。精密称取1.0g 苦丁茶粉末于50ml容量瓶中，分别加入10，15，20，25，30ml50%乙醇水溶液，其余条件参照①，测定苦丁茶中总黄酮含量。
③微波时间。精密称取1.0g 苦丁茶粉末于50ml容量瓶中，微波时间分别为40,50,60,70,80s，其余条件参照①，测定苦丁茶中总黄酮含量。
2.6 纤维素酶-微波结合提取工艺酶提取法提取完成后的样品溶液，按一定料液比加入乙醇溶液，在微波条件下继续提取，其他处理同上2.2与2.3节。通过酶提取法与微波提取法最佳工艺参数综合考虑确定结合法的最佳工艺参数。
结果分析1 纤维素酶提取的单因素实验1.1 酶解时间对总黄酮提取率的影响。
在固定酶用量，酶解温度，PH，乙醇用量，乙醇体积分数，考察酶解时间对提取率的影响，结果见图1。最佳酶解时间为0.5h。
3 纤维素酶-微波结合提取实验最佳工艺探究将两种方法组合，苦丁茶中总黄酮量一定，提取率达到理论值后将不再变化，而微波时间会发生变化，将两实验组合提取后，做三组平行试验，其平均提取率为40.5%。，比酶法和微波法均有了一定的提高。
Average absorbance Extraction field(%)0.980 40.5表10结论与总结纤维素酶可使组成植物细胞壁的构架物质纤维素降解，从而使黄酮便于提取；微波加快反应速度的同时提高提取效率，所用溶剂乙醇更大程度上保证了安全性，将纤维素酶法与微波法结合可以更大程度上提取利用苦丁茶中总黄酮。本实验结果表明，纤维素酶-微波联合法提取总黄酮的最佳工艺条件为酶解温度45℃，PH5.0，酶解时间0.5h，酶用量0.02％，乙醇体积分数40％，乙醇用量30ml.微波时间50s。
在此条件下，黄酮初步提取率比酶法提取和微波法提取有所提高。
本实验中的提取方法为黄酮的初步提取，最后提取物中因未进一步提取纯化可能含有茶多酚，咖啡碱，皂素，微量元素等导致提取率过大，因此可通过将提取物提纯后进一步测定总黄酮提取率。
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论文作者:吴蕊伶 蒋省炎
论文发表刊物:《医师在线》2015年8月第16期供稿
论文发表时间:2015/11/4
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