赵宝华[1]2001年在《抗α毒素单链抗体的基因克隆和表达及其生物学特性研究》文中研究表明本研究应用RT-PCR技术，从两株分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株2E3和1A8中，分别扩增出抗体V_H和V_L基因，用linker（Gly_4Ser）_3基因，将V_H和V_L基因连接成单链抗体（ScFv）基因，并将其克隆至pGEM-T载体中。经核苷酸序列分析证实，V_H和V_L基因及linker基因拼接正确，ScFv-2E3基因全长为726bp，编码242个氨基酸，V_H基因序列位于linker基因的上游，大小为357bp，编码119个氨基酸残基；V_L基因序列位于linker基因的下游，含有324bp，编码108个氨基酸残基；linker基因大小为45bp，编码15个氨基酸残基（Gly_4Ser）_3；ScFv-1A8基因全长为729bp，编码243个氨基酸，V_H基因序列位于linker基因的上游，大小为351bp，编码117个氨基酸残基，V_L基因序列位于linker基因的下游，含有333bp，编码111个氨基酸残基，linker基因大小为45bp，编码15个氨基酸残基（Gly_4Ser）_3。经计算机软件分析，V_H和V_L基因均为新发现的基因序列，符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。ScFv-2E3的V_H和V_L基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（B）和轻链κⅢ家簇；而ScFv-1A8的V_H和V_L基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A）和轻链κⅥ家簇。 将两种抗A型产气荚膜梭菌α毒素ScFv基因ScFv-2E3和ScFv-1A8分别克隆至表达载体pUC119、pET20b、pET28a和pHOG21中，构建了重组质粒pUC-2E3和pUC-1A8，pET20b-2E3和pET20b-1A8，pET28a-2E3和pET28a-1A8以及pHOG-2E3和pHOG-lA8，然后分别转化至受体菌JM105、BL21（DE3）和XL1-BLUE中，得到重组菌株JM105（pUC-2E3）和JM105（pUC-1A8）、BL21（DE3）（pET20b-2E3），BL21（DE3）（pET20b-1A8），BL21（DE3）（pET28a-2E3），BL21（DE3）（pET28a-1A8），XL1-BLUE（pHOG-2E3）和XL1-BLUE（pHOG-1A8）。ELISA检测表明：经IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株JM105（pUC-2E3）和JM105（pUC-1A8）及XL1-BLUE（pHOG-2E3）和XL1-BLUE（pHOG-1A8）的菌培养上清中，在重组菌株BL21（DE3）（pET20b-2E3）和BL21（DE3）（pET20b-1A8）以及XL1-BLUE（pHOG-2E3），XL1-BLUE（pHOG-1A8）的胞周质中也检测到了ScFv的存在。经SDS-PAGE分析表明，蛋白表达产物在BL21（DE3）（pET28a-1A8），BL21（DE3）（pET28a-2E3）和XL1-BLUE（pHOG-2E3）中均形成了包涵体的形式，而且在重组菌株XLI－BLUE（pHOG－2E3人XLI－BLUE（pHOG－IAS）的胞周质中出现了特异的蛋白带。经薄层扫描分析：重组菌株XL IBLUE（pHOG－2E3＊XLI－BLUE（pHOG－IAS人BLZI（DE3）（pET20b－2E3）禾 BLZI（DE3）（pET20b AS）的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的4％、3％、0．9％和 0．7％，重组菌株 XLIBLUE切HOG上E3）的蛋白表达产物占菌体总蛋白的相对含量为22％，其相对分子量约为31 KD。 对ScFv的生物学特性研究表明：ScFv蛋白不但具有中和卵磷脂酶的活性，而且还能够对致死性腹腔攻击的小鼠产生良好的被动保护作用。
赵宝华, 许崇波, 段相林, 朱平[2]2002年在《表达抗α毒素单链抗体基因工程菌株的构建》文中认为将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv 2E3和ScFv 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET 2 0b ,pET 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒 ,分别转化至相应的受体菌JM10 5 ,BL2 1(DE3)和XL1 BLUE中 ,得到表达ScFv的重组菌株。ELISA和SDS PAGE分析检测表明 :经IPTG诱导后所表达的ScFv目的蛋白主要形成了包含体的形式 ,但也有少量ScFv存在于重组菌株的培养上清和胞周质中。经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE (pHOG 2E3)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 4% ,重组菌株XL1 BLUE (pHOG 2E3)的蛋白表达产物占菌体总蛋白的相对含量为 2 2 % ,其相对分子量约为 31ku。表达的ScFv蛋白不但具有中和卵磷脂酶的活性 ,而且能够对致死性腹腔攻击α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用
参考文献：
[1]. 抗α毒素单链抗体的基因克隆和表达及其生物学特性研究[D]. 赵宝华. 中国人民解放军军需大学. 2001
[2]. 表达抗α毒素单链抗体基因工程菌株的构建[J]. 赵宝华, 许崇波, 段相林, 朱平. 微生物学杂志. 2002