（1昆明医科大学第三附属医院<云南省肿瘤医院>神经外科 云南 昆明 650118）
（2昆明医科大学第三附属医院<云南省肿瘤医院>病理科 云南 昆明 650118）
【摘要】 目的：研究咖啡因对体外培养U251神经胶质瘤细胞活性的影响。方法：采用 MTT法研究不同浓度和作用时间对瘤细胞的影响。结果：随着咖啡因浓度增加、作用时间延长，OD值在逐渐下降，咖啡因在4～10mM时，24h与48h的OD值趋同，在10mM时三个时段的OD值基本相同。结论：本实验初步证明了咖啡因在体外可以抑制U251人胶质瘤细胞的细胞活性。
【关键词】咖啡因；神经胶质瘤细胞；细胞活性
【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）14-0131-03
根据世界卫生组织的统计，原发脑肿瘤的年发病率平均约为10～20/10万人[1]。脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，占颅内肿瘤的 41%～44.6%。近25年来其发病率以每年1.2%的速度呈逐年上升的趋势。胶质瘤大多数呈膨胀性和浸润性生长，由于其分化差、增殖快和具有侵袭性，疗效欠佳，预后相对较差。目前, 主张采用综合治疗 ( 手术、放疗、化疗等) , 疗效虽有所提高，但治疗效果难令人满意，仍是神经科医生面临的最大难题之一。
咖啡因是茶、咖啡及许多日常饮料的有效成分，它有广泛的药理效应，近些年来，有研究表明，咖啡因对多种癌细胞有一定程度的抗癌效应，甚至被应用于临床的化疗辅助用药以增强化疗疗效。咖啡因可以很容易透过血脑屏障作用于中枢神经系统[4]，所以脑胶质瘤的治疗也随后进入了研究者的视野，正在各个水平进行咖啡因抗胶质瘤的研究。世界上多个医学、流行病学中心先后进行了几个前瞻性大样本的调查研究。令人遗憾的是，其结果不能完全统一，有的显示有抗癌效应，有的显示没有。由于咖啡和茶在世界范围内的习惯饮用，所以如果其所含咖啡因的确有抗癌或预防肿瘤发生的作用，则对全人类抗癌或预防肿瘤发生有着重大意义。为了解咖啡因对脑胶质瘤是否有抗肿瘤作用，我们设计了以下实验进行了初步研究。
1.材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
人胶质瘤细胞株U251购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心，RPMI-1640、胰酶、胎牛血清均购自GIBCO公司；咖啡因、MTT、DMSO均购自Sigma-Aldrich公司；全自动酶标仪为Sigma 960型；倒置显微镜为 Olympus CKX41公司产品。Thermo Scientific 1300 series A2超净台；Thermo Scientific Forma Series II 水套CO2培养箱；湘仪离心机（TD5A-WS台式低速离心机）。
1.2 U251细胞株的培养：
U251人胶质瘤细胞株培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度，取传代后第3天处于指数增殖期的细胞备用。
1.3 U251细胞的MTT测定
将U251单细胞悬液接种到3块96孔板上（1×104/孔，200μl/孔），在孵箱中培养48小时，细胞贴壁，设一个对照组，五个咖啡因浓度实验组（1，2，4，6，10mmol/L），每组10孔。将加入咖啡因的96孔板置于37℃、5%CO2、饱和湿度下的孵箱内分别培养24、48、72小时，每孔内加MTT(5mg/ml,20μl/孔)，孵箱内继续培养4小时，弃上清液，加入DMSO 100μl/孔，在平板离心机上震荡10分钟（2000r/min）,甲臜溶解后，用全自动酶标仪（波长570nm）测定每孔的OD值。实验重复3次。
1.4 统计学分析
数据采用“平均值±标准差”表示，用SPSS统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05具有统计学意义，P＜0.01具有显著统计学意义，P＞0.05无统计学意义。
2.结果
3.讨论
前人的研究显示,咖啡因对抗癌效果的研究显示了模棱两可的结果，有的实验显示抗肿瘤有效，有的实验显示效果不明显。国外的病例对照、流行病学研究和几个较大的多中心前瞻性实验研究也出现了结论不尽一致的情况。
曾有文献报道，有5个病例对照研究[2-6]对“咖啡和茶的摄入与脑肿瘤关系”进行了探讨，但结论并不一致。两个关于“咖啡摄入和胶质瘤的患病风险关系”的流行病学研究显示[3, 6, 7]，两者并无任何关系。在3个大型前瞻性队列研究中，Holick等[8]的研究结果一致显示，在男性，咖啡因的摄入和胶质瘤的患病风险之间呈反向相关性，但在女性，这种关系在统计学上没有显著性。Michaud等[9]进行的大型前瞻性队列研究结果认为：咖啡因和茶的摄入与脑膜瘤患病风险没有相关性。但对胶质瘤来说，实验提示有一个“门槛”效应：若咖啡因和茶的摄入≥100ml/天，则其与胶质瘤患病风险有明显的反向相关性；若＜100ml/天时，则上述反向相关性不明显。这个结论对性别来说，男性比女性更明显一些，而女性的月经状态对实验结果没有影响。
本实验中我们研究了咖啡因对人神经胶质瘤U251细胞活性和凋亡的影响，结果显示，随着咖啡因浓度加大和作用时间的延长，U251细胞均呈现出活性抑制趋势，这与Ku等[10]在U87MG人胶质瘤细胞上实验结果相一致，我们MTT实验的结论是：咖啡因在体外可以抑制人胶质瘤U251细胞的活性，且显示出浓度、时间依赖性细胞活性下降趋势。我们认为：在体外，咖啡因对U251人胶质瘤细胞有活性抑制作用，且随咖啡因浓度增大和作用时间延长出现瘤细胞增值抑制加强趋势。本实验只是初步证明了咖啡因在体外有一定的抗U251胶质瘤细胞增殖活性，但是否对多种类、多级别胶质瘤细胞均有效、能否作为脑胶质瘤辅助治疗的新方法和其分子学的具体作用机制还需进一步的深入研究。
【参考文献】
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云南省教育厅科学研究基金项目资助（项目编号：2014Y167）
论文作者:范耀东1,罗林1,左频1,袁红平1,白刚1,倪炜1
论文发表刊物:《医药前沿》2016年5月第14期
论文发表时间:2016/6/21
标签：咖啡因论文; 细胞论文; 胶质瘤论文; 活性论文; 体外论文; 浓度论文; 作用论文; 《医药前沿》2016年5月第14期论文;