漆艳香, 朱水芳, 赵文军, 肖启明, 廖晓兰[1]2004年在《玉米细菌性枯萎病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立》文中认为成功建立了玉米细菌性枯萎病菌快速检测鉴定的实时荧光PCR方法。该方法根据细菌16S rDNA序列的特异性,设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定性点突变特异性探针,并对10种细菌菌株和5种植原体进行了实时荧光PCR。结果表明,只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光信号,而其它参考菌不产生荧光信号,检测的绝对灵敏度是14.2 fg/μl质粒DNA,比常规的PCR电泳检测高约100倍。整个检测过程只需2h,完全闭管,降低了污染的机会,无须PCR后处理。
封立平, 倪新, 吴兴海, 伦才智, 吴翠萍[2]2015年在《玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法》文中指出为了提高口岸和基层实验室检疫和监测玉米细菌性枯萎病菌的准确性和工作效率,利用环介导恒温扩增技术(LAMP),根据内切葡聚糖酶(EGase)基因前导序列,设计2个内引物和2个外引物,对玉米细菌性枯萎病菌进行快速检测。结果表明,使用玉米细菌性枯萎病菌的近缘种或引致相似症状的病原菌菊欧文氏菌玉米致病变种Erwinia chrysanthemi pv.zeae、玉米内州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、燕麦假单胞菌Pseudomonas avenae、杓兰欧文氏菌Erwinia cypripedii检测其特异性,仅玉米细菌性枯萎病菌有扩增。LAMP检测灵敏度达到2 pg DNA,为普通PCR的100倍;与其它检测方法相比,LAMP方法检测时间短,效率高,不仅降低了设备投入,易于操作,而且具有较高的灵敏度和特异性,适合玉米细菌性枯萎病菌的现场检疫和大规模检测。
冯建军, 刘杰, 王飞, 李秋枫, 刘新娇[3]2014年在《PMA结合实时荧光PCR进行玉米细菌性枯萎病菌细胞活性检测初步研究》文中进行了进一步梳理本文将DNA染料PMA选择渗透性和实时荧光PCR特异性相结合,建立了一种快速灵敏检测玉米细菌性枯萎病菌细胞活性的新方法。结果表明,当菌悬液浓度不高于104 CFU/mL时,终浓度为1μg/mL或更高PMA渗透处理后,可以完全抑制死菌DNA的扩增,而活菌DNA的实时荧光PCR检测仍有荧光信号;当菌悬液浓度为105 CFU/mL时,20μg/mL的PMA也可以完全抑制死细胞DNA扩增。该方法能有效区分玉米细菌性枯萎病菌死活细胞,并有助于监测玉米种子中该病菌的活性。
漆艳香, 肖启明, 朱水芳[4]2003年在《玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR》文中认为为给农业和植物检疫部门提供一种特异性强、灵敏度高,可以快速、直接检测植物病原菌的方法,将玉米细菌性枯萎病菌16SrDNA基因克隆测序,根据该细菌与其他细菌菌株16SrDNA序列差异,设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针,除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外,还对假单胞菌属1个种,黄单胞菌属1个种,棒形杆菌属1个种,短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR检测.结果表明:只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光,其他细菌和植原体都没有荧光产生.检测的灵敏度为104CFU/mL的菌悬浮液,相当于4个细菌细胞的基因,灵敏度高,也就是说,反应体系中只要有2个活细菌,实时荧光PCR就能检测到.相对灵敏度为107CFU/mL,而且整个检测过程只需2h,由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统,不用凝胶电泳,降低了污染.
袁钧[5]2013年在《玉米细菌性枯萎病菌与马铃薯环腐病菌LAMP检测方法的建立》文中进行了进一步梳理环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新的核酸扩增技术,具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强等优点,己在核酸研究、临床诊断和转基因食品检测等领域得到了广泛的应用,成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。玉米细菌性枯萎病菌与马铃薯环腐病菌是两种重要的检疫性病原微生物,目前我国口岸的检疫中,主要采用传统的分离培养、生理生化鉴定、致病性试验和酶联免疫法等检验的方法,但均耗时长、效率低,不适合口岸要求。因此建立快速检测这两种致病菌的方法具有重要意义。本研究利用玉米细菌性枯萎病菌与马铃薯环腐病菌基因组DNA特有的保守区域设计LAMP引物,通过优化其反应条件,建立了玉米细菌性枯萎病菌与马铃薯环腐病菌的LAMP检测体系。以多种参比菌DNA为模板对LAMP检测体系的特异性进行了验证,利用玉米细菌性枯萎病菌与马铃薯环腐病菌DNA溶液和菌液梯度稀释液对LAMP检测体系的灵敏度进行了验证。在特异性测试中,LAMP检测体系仅对玉米细菌性枯萎病菌与马铃薯环腐病菌进行扩增,对非靶标菌不产生扩增。玉米细菌性枯萎病菌LAMP检测体系DNA和菌体检测灵敏度分别达到了0.858×10-4ng/uL和45CFU/mL。马铃薯环腐病菌LAMP检测体系DNA和菌体检测灵敏度分别达到了0.527×10-3ng/uL和150CFU/mL。为玉米细菌性枯萎病菌与马铃薯环腐病菌的检测提供了一种新的简便、快速的检测手段。
漆艳香[6]2003年在《实时荧光PCR检测玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii subsp.stewartii）的研究》文中认为玉米细菌性枯萎病是玉米上的一种毁灭性的病害，尤其对甜玉米更甚，在严重情况下可造成颗粒无收。目前我国尚无正式分布的报道，是被我国列为禁止进境一类检疫性有害生物。在我国口岸的检疫中，一直沿用传统的分离培养、生理生化鉴定、噬菌体检测、免疫荧光染色和致病性试验等检验的方法。应用该类方法耗时长、效率和灵敏度均较低，且经验性很强，又往往难以确定准确的细菌种类，不适合口岸快速验放的要求，难以标准化和大规模的推广应用，这些也正是目前细菌病原缺乏标准检测方法的重要原因。建立快速、准确的检测方法迫在眉睫、意义重大。 本研究成功建立了玉米细菌性枯萎病菌检测的TqMan探针实时荧光PCR检测方法，且在国内外未见相同方法报道。将玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆测序，根据本细菌与其它细菌菌株16S rDNA序列差异，设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针，除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外，还对假单胞菌属1个种，黄单胞菌属1个种，棒形杆菌属1个种，短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR。结果表明，只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光，其他细菌和植原体都没有荧光产生。且绝对灵敏度比凝胶咆泳高100倍，达到2.53×10~6个阳性分子。检测的灵敏度为10~4 CFU／mL的菌悬浮液，相当于4个细菌细胞的基因，灵敏度高，也就是说，反应体系中只要有2个活细菌，实时荧光PCR就能检测到。相对灵敏度为10′CFU／mL，而且整个检测过程只需2小时，由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统，不用凝胶电泳，降低了污染。 本方法特异性强、灵敏度高、可以快速、直接检测到玉米细菌性枯萎病菌，在检验检疫工作中有广阔的应用前景。
王赢, 周国梁, 印丽萍, 袁平, 王文兵[7]2009年在《玉米细菌性枯萎病菌PCR检测》文中进行了进一步梳理根据GenBank中玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的16S序列差异,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌特异性引物Ps2r/Ps3r,该引物能从供试的7株玉米细菌性枯萎病菌中特异性扩增出一条268 bp的预期条带,供试的32株近似种菌株都没有扩增产物;与国内外文献报道的其它5对特异性引物相比,除引物PSA/PSB外,引物DEP1/DEP2、ES16/ESIG2c、HRP1d/HRP3c和CPSL1/CPSR2c在不同程度上对部分近似种菌株出现了扩增。试验结果表明,引物Ps2r/Ps3r和PSA/PSB能特异性扩增玉米细菌性枯萎病菌,得到预期的扩增产物。对不同系列稀释度的DNA和玉米样品中病菌的检测结果表明,由引物Ps1/Ps4和Ps2r/Ps3r组合的巢式PCR方法的检测灵敏度高于引物ITSA/ITSB和PSA/PSB组合的巢式PCR方法,也高于Bio-PCR检测方法;前者可以检测到玉米种子中300 cfu/sample的目的细菌,该检测方法在进境玉米种子样品玉米细菌性枯萎病菌的检疫中具有比较理想的应有潜力和推广价值。
吴琼, 陈枝楠, 范怀忠, 金显忠[8]2004年在《玉米细菌性枯萎病及其病原菌的检测技术》文中研究表明玉米细菌性枯萎病是影响玉米生产的重要病害 ,该病害通过带菌的种子进行远距离传播 ,对该病菌的检测成为防止和控制该病害的重要手段。介绍现有的检测该病菌的各种方法 ,即黑色素选择培养法、double sandwichELISA以及RAPD PCR ,LCR PCR ,Nested PCR ,multiplePCR和荧光实时PCR等分子生物学检测方法 ,并对这些方法的特性进行比较和探讨。
陈曦, 张明哲, 林晓佳, 吴志毅, 陈吴健[9]2014年在《玉米细菌性枯萎病和玉米内州萎焉病的酶联免疫—实时荧光PCR检测》文中研究表明针对玉米细菌性枯萎病和玉米内州萎焉病这两种检疫性病菌进行酶联免疫—实时荧光PCR检测研究,对该方法进行了特异性、灵敏度以及实际样品模拟试验。结果表明,该方法具有较好的特异性,检测低限在100~200 cfu·mL-1,同时可用于实际样品的检测鉴定。
袁钧, 高文娜, 汪万春, 廖晓兰[10]2013年在《玉米细菌性枯萎病菌LAMP检测方法的建立》文中认为利用玉米细菌性枯萎病菌基因组DNA特有的保守区域设计LAMP(loop-mediated isothermal amplification)引物,通过优化其反应条件,建立了玉米细菌性枯萎病菌的LAMP检测体系。以多种参比菌DNA为模板对LAMP检测体系的特异性进行了验证,利用玉米细菌性枯萎病菌DNA溶液和菌液梯度稀释液对LAMP检测体系的灵敏度进行了验证。在特异性测试中,LAMP检测体系仅对玉米细菌性枯萎病菌进行扩增,对非靶标菌不产生扩增。LAMP检测体系DNA和菌体检测灵敏度分别达到了0.858×10-4ng/uL和45 CFU/mL。为玉米细菌性枯萎病菌的检测提供了一种新的、简便的、快速的检测手段。
参考文献：
[1]. 玉米细菌性枯萎病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立[J]. 漆艳香, 朱水芳, 赵文军, 肖启明, 廖晓兰. 植物保护学报. 2004
[2]. 玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法[J]. 封立平, 倪新, 吴兴海, 伦才智, 吴翠萍. 植物保护学报. 2015
[3]. PMA结合实时荧光PCR进行玉米细菌性枯萎病菌细胞活性检测初步研究[J]. 冯建军, 刘杰, 王飞, 李秋枫, 刘新娇. 植物检疫. 2014
[4]. 玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR[J]. 漆艳香, 肖启明, 朱水芳. 湖南农业大学学报(自然科学版). 2003
[5]. 玉米细菌性枯萎病菌与马铃薯环腐病菌LAMP检测方法的建立[D]. 袁钧. 湖南农业大学. 2013
[6]. 实时荧光PCR检测玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii subsp.stewartii）的研究[D]. 漆艳香. 湖南农业大学. 2003
[7]. 玉米细菌性枯萎病菌PCR检测[J]. 王赢, 周国梁, 印丽萍, 袁平, 王文兵. 植物病理学报. 2009
[8]. 玉米细菌性枯萎病及其病原菌的检测技术[J]. 吴琼, 陈枝楠, 范怀忠, 金显忠. 中国生物工程杂志. 2004
[9]. 玉米细菌性枯萎病和玉米内州萎焉病的酶联免疫—实时荧光PCR检测[J]. 陈曦, 张明哲, 林晓佳, 吴志毅, 陈吴健. 浙江农业学报. 2014
[10]. 玉米细菌性枯萎病菌LAMP检测方法的建立[J]. 袁钧, 高文娜, 汪万春, 廖晓兰. 植物检疫. 2013