关键词 KA；海马神经细胞；体外培养；乳鼠
细胞凋亡，又称为细胞程序性死亡，是指细胞由于其内部程序激活而发生的自杀性死亡[1]。海马是中枢神经系统重要的功能部位，神经细胞原代培养是体外研究神经系统疾病的重要手段之一，也是对神经系统损伤进行细胞分子水平研究的基础。因此，建立稳定方便的神经细胞体外培养方法，对研究神经系统疾病，特别是在研究神经细胞损伤和修复中的作用尤为重要[2]。在海马神经细胞分离培养过程中，突出的难点集中在取材难度较大，以及培养基中血清的影响，杂质细胞极易混杂，影响了海马细胞的培养和纯度[2, 3]。我们参考国内外海马细胞培养、分离的经验，对其关键步骤予以优化，建立了一种改良新生乳鼠海马神经细胞的体外培养方法。这一改良的新生乳鼠海马神经细胞体外培养方法，可为缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病研究，提供良好的神经细胞体外研究基础。
红藻氨酸（kainic acid, KA）是从海人草中提取的一种谷氨酸类似物，具有明确的神经兴奋和神经毒性。研究表明KA可通过激活相关受体如KA1、KA2、GluR5、GluR6、GluR7导致神经细胞凋亡，相关研究在神经退行性病变疾病的研究中已经受到重视[4]。为排除体内因素的干扰，我们借助采用改良方法培养出的新生乳鼠海马神经细胞，进行体外给药研究，探索KA对体外培养神经细胞存活率和形态的影响，探讨KA受体在细胞凋亡中的作用。
1.材料与方法
1.1 海马神经细胞体外培养
1.1.1 实验动物
出生24h内新生健康SD大鼠，由长沙医学院基础医学院提供，清洁级，雌、雄不限。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。
1.1.2 主要设备
超净工作台（江苏苏净），CO2培养箱（美国ＴThermo公司）， 恒温水浴箱（杭州博日），倒置相差显微镜（日本Olympus），激光共聚焦显微镜（日本Nikon）。
1.1.3 方法
主要试剂配制：0.01%多聚-L-赖氨酸溶液（PLL，Sigma公司），0.2μ过滤除菌。②细胞培养液1（接种用）[2, 3]：高糖DMEM（Hyclone）88%、B27（Gbico）2%、胎牛血清（杭州四季青）10%。③细胞培养液2（持续培养用）[2, 3]：Neurobasa（Gbico）98%、B27 2%。④0.25%胰蛋白酶液（Biodder），0.2μ过滤除菌（Sigma）。
细胞培养瓶、盖玻片预处理：用0.01%的PLL 2.5ml包被覆盖细胞培养瓶瓶底，4℃过夜。使用前PBS清洗3次。盖玻片高强度H2SO4溶液中浸泡过夜后洗净，高温高压灭菌，置于12孔板内，后续处理同培养瓶。
海马细胞原代培养：①取材：取24h内新生SD乳鼠，75%酒精消毒后，断头取脑置于预先冰浴处理的Hank’s平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）中。冰上分离出新生SD大鼠的双侧海马，剔除血管和筋膜。②消化：加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴振荡消化10~15min，待组织成粥糜状，加少量血清终止消化，吸去胰蛋白酶，用HBSS洗2次。③吹打及过滤：加入细胞培养液1（含10%胎牛血清）吹打成无肉眼可见组织颗粒的细胞悬液，经200目滤网过滤，800~1000r/min离心，用细胞培养液1重悬，制成单细胞悬液。④接种：细胞悬液调整细胞密度至8×105个/ml接种于细胞培养瓶中。24h后全量更换为细胞培养液2（不含血清），之后每2~3天换半液。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况。
海马细胞的鉴定[3]：利用海马神经细胞特异性抗体MAP2分别对培养2、5、7、21天后的细胞进行免疫荧光鉴定，鉴定神经细胞纯度鉴定。具体步骤：①取体外培养2、5、7、21天的海马神经细胞，0.01mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered salin，PBS）洗涤2次4%多聚甲醛4℃固定20min，PBS清洗3次每次5min，0.1%聚乙二醇对异辛基苯基醚 （ritonX-100）4℃处理15min，PBS清洗3次每次5min，5%羊血清封闭30min。②加一抗：加入一抗4℃湿盒孵育过夜。一抗为小鼠anti-MAP2（Abcam），工作稀释度为1:200。③加二抗：次日采用PBS清洗3次每次5min后，滴加FITC标记的抗小鼠二抗（Abcam），工作稀释度为1:200，室温孵育2h。④染色和观察：PBS清洗3次每次5min，4’6-二脒基-2-苯基吲哚（4’6-diamidino-2-phenylindole，DAPⅠ）对预处理的新生乳鼠海马神经细胞进行细胞核染色5min，PBS洗涤后，用抗荧光淬灭封片剂和指甲油封片，在荧光显微镜下检测MAP2阳性表达细胞数所占总细胞数的比例，即为神经元细胞纯度。
海马神经细胞纯度检测标准：MAP2是神经元细胞核内表达的特异性抗原，在星形胶质细胞（astrocyte，AS）及少突胶质细胞中不表达[2]。随机取样10个视野，摄像后计算每个视野中MAP2阳性表达。以在荧光显微镜下，可见MAP2在神经元细胞体和树突中表达为准，统计阳性表达细胞数占该视野总细胞数的比例，即为新生大鼠海马神经元细胞的纯度。
上述原代海马神经细胞培养、鉴定实验重复3次，每次均观察神经元细胞的形态发育及所占细胞比例。
1.2 KA对体外培养的原代海马神经细胞存活率的影响研究
1.2.1 实验细胞
采用1.1建立的改良培养方法培养7天后的原代海马神经细胞。
1.2.2 主要设备
全波长酶标仪（Molecular Device）
1.2.3 细胞分组
KA组，每组分7个不同时间段（给药孵育2、4、8、12、24h）；细胞对照组（用新鲜的细胞培养液2正常培养）
1.2.4 方法
KA工作液配制[5]：取0.1ml KA溶液（10mg/ml，Sigma）溶于10ml细胞培养液2中，0.2μ过滤除菌（Sigma）。
海马神经细胞KA培养处理：①接种细胞：0.25%胰酶消化细胞，加少量血清终止消化，离心，弃上清液，用细胞培养液2将细胞吹打成单细胞悬液，以每孔103~104个细胞接种到96孔板( 预先用PLL包被) ，每孔体积200μl。②培养细胞: 同一培养条件下，培养24~48 h，空白组仅加相同量的培养基。③给药：弃原培养液，PBS洗3次，KA组加入200μl KA工作液，分别孵育2、4、8、12、24h；细胞对照组加入新鲜细胞培养液2正常培养，培养时间与KA组对应；空白组换入新鲜培养液相同条件放置对应时间。
MTT测相对存活率[6, 7]：①显色：吸去原培养基，每孔加入MTT溶液（Biosharp）20 μl ( 5 mg /ml，pH = 7.4)。②37℃培养24h后，每孔加MTT溶液 ( 5 mg /ml) 20 μl，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加DMSO 150 μl，振荡10 min，使结晶物充分融解。③比色：选择570 nm波长，在酶标仪上测定各孔OD值，记录结果，采用3个复孔计算均值，重复3次实验。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆⑥计算：活性率= ( A实验-A空白) /( A实验-A对照) × 100%。
2.统计学方法：全部数据用平均数士标准差处理，采用SPSS22.0软件行单因素方差分析和各组均数的最小显者差值法(LSD法)检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。
3.结果
3.1 体外培养的海马神经细胞形态变化
接种后海马神经细胞呈单个细胞，密度均匀漂浮在培养液中，体积小，圆形，透亮；30min后逐渐出现贴壁；2h后，细胞贴壁明显；至6h个别细胞长出突起；24h细胞几乎完全贴壁，大部分细胞长出3~4个短小突起，此时细胞多为梭形，体积小，折光性好，细胞周围有光晕，核不可见。第3~4天，细胞胞体明显增大，突起增多增长。第5~6天胞体饱满，呈多边形，核大、圆，位于胞体正中附近，突起中有一支明显较粗较长，开始形成神经细胞网络。第7~8天，细胞形态最成熟饱满，体积较大，光晕明显，突起极发达，分支多，相互连接成交错网络状。9~10天后，细胞逐渐出现不明显皱缩，突起不再伸长。之后突起出现弯曲，甚至部分断裂、回缩，细胞变形，密度减小，细胞液中有漂浮碎片，细胞老化。21天时，细胞老化已非常明显。
3.2 海马神经细胞纯度鉴定结果
MAP2荧光显色结果：阳性呈绿色荧光，荧光分布于神经细胞的胞体和树突，轴突及胶质细胞均不染色。新生乳鼠海马神经细胞在体外培养至第7天时，采用anti-MAP2-FITC免疫荧光法在荧光显微镜下分别计数10个视野范围内的100个细胞。免疫荧光染色MAP2阳性海马神经元细胞纯度为96.7 ± 2.1%。
3.3 KA对海马神经细胞活性影响
MTT 比色结果显示，与细胞对照组相比，KA组4、8h后海马神经细胞死亡率显著增加（P<0.05），2、12、24h差异不明显。
4.讨论
海马是中枢神经系统神经形成的特殊结构[2, 4]。近年研究结果证明，海马结构早期变化参与阿尔茨海默病、海马硬化症、痴呆等相关神经元退行性疾病的病理、生理过程[3]。由于海马结构和功能的重要性，建立海马神经细胞原代培养的优化方案，是促进神经元相关疾病研究的必要基础。
为获得纯度更高、更接近人体状态的神经细胞，本研究对以往的培养方法做了以下改进。①取材：以往的培养方法多取材于胎龄17~18天的胎鼠，这种胎龄不易掌握，费用也较高，且因剖腹取胎鼠及胎鼠体积小，取材难度大，耗时长，造成操作过程中神经元细胞大量死亡，获得的单细胞悬液中活神经元细胞数量少[2, 3]。现已逐渐出现用新生乳鼠代替胎鼠的方法，也有研究尝试用出生后1~3天的仔鼠进行海马神经细胞体外分离培养[2]。但通过对比，培养效果和便利程度平衡性最好的还是24h以内的新生鼠。②不用机械剪碎组织块，减少机械损伤：因本研究取材部位为海马，组织块小，并且本研究采取水浴箱振荡消化，故无需机械剪碎胰蛋白酶即可与组织块充分接触，避免了机械剪碎造成的细胞损伤。③在原代神经细胞培养中，最困扰实验人员的是使海马神经细胞顺利贴壁生长和去除胶质细胞、成纤维细胞等杂细胞的平衡。本实验采用有血清接种联合无血清培养的方法，既提高神经细胞的接种密度，又在保证神经细胞正常生长的同时，最大程度地降低了杂细胞的生长。本研究中用于持续培养的细胞培养2，采用无血清Neurobasal+B27神经细胞培养体系，是目前培养效果较好，且易得成本较低的一种培养基。Neurobasal培养基是一种可满足新生和成体脑神经细胞培养的特殊基础培养基，其无血清培养液，成分构成清楚，有利于实验条件的稳定，利于研究特定因素对体外培养神经细胞的影响；另外，无血清培养液也使神经元细胞的生长环境更接近正常生理状态；同时，本研究在该 培养基中加入了B27，B27中含有谷酰胺、胰岛素、转铁蛋白、黄体酮、腐胺等细胞生长所必须的因子，是血清的良好替代物，还含有多种抗氧化剂和微量元素，具有保护神经元细胞的作用[3]。
谷氨酸是脑内最重要的兴奋性神经递质, 其受体分两类: 一类是与G蛋白偶联的代谢型受体, 另一类是与离子通道有关的离子型受体；离子型受体又分为三种类型：NMDA ( N-甲基-D-天冬门氨酸) 受体、AMPA受体和KA受体。相对NMDA受体和AMPA受体，KA受体研究较少[8-10]。
KA家族由5种不同亚基组成，分别是对kainate 亲和力较低的GluR5、GluR6、GluR7及亲和力高的KA1和KA2[4]。其中GluR5转录本主要存在于背根节细胞、大脑下脚、隔核、扣带皮质以及小脑的Purkinje细胞中。GluR6 在小脑颗粒细胞中分布最多，也存在于纹状体和海马的齿状回以及CA3区。GluR7mRNA在全脑都呈低水平表达。KA1几乎局限于海马的CA3区，但在海马齿状回、杏仁核、内嗅皮质中也有低水平表达。KA2在神经系统中的分布最为广泛[10]。已有动物实验表明，KA在体内可通过激活相关KA1诱导海马细胞凋亡。本研究通过体外实验证明，KA在体外同样能有效诱导海马神经细胞死亡[11, 12]。为后续的体外实验，以及更深入的细胞信号转导，相互作用研究提供了线索。并提示，研究的最佳时间在给药后4~8h之间。
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论文作者:刘一舟
论文发表刊物:《医师在线》2019年20期
论文发表时间:2019/12/5
标签：神经细胞论文; 细胞论文; 体外论文; 培养液论文; 血清论文; 神经元论文; 受体论文; 《医师在线》2019年20期论文;