李勇[1]2007年在《端粒酶基因与大鼠胎儿神经干细胞永生化的研究》文中研究说明中枢神经系统的一些疾病(如帕金森氏病、Huntington病、脱髓鞘病和脑、脊髓损伤等)是因为神经细胞某一群体受损所致,它们严重的危害着人类健康,影响着人们的生活质量。传统的药物治疗只能缓解却不能根治这些疾病,并且神经系统对药物敏感,容易受到副作用的影响。近年来,随着细胞移植技术的发展和成熟,神经干细胞的移植已成为治疗这些疾病的有效途径。神经干细胞是神经系统中特定的原始神经细胞,广泛的存在于哺乳动物中枢神经系统中的多个部位,它能通过分裂、增殖、分化能产生出所有神经组织细胞类型,在体内终生自我维持和更新。由于NSCs的自我更新能力、多分化潜能、低免疫源性和良好的迁移及组织融合性等特性,使之成为理想的基因或药物治疗载体和细胞移植供体。但是,神经干细胞在体外长期培养过程中出现复制衰老,并且神经干细胞增殖速度慢,传代周期长,使得它们的数量不能达到科研和临床的要求,阻碍了神经干细胞临床应用进程。而永生化神经干/祖细胞系在转基因治疗和中枢神经系统移植的研究中显示出诸多优点如在体外可以自我更新,大量扩增;通过基因操作使细胞稳定表达报告基因,进行体内示踪,或治疗基因;通过外源基因永生化的神经干细胞,在体内仍然能像正常神经干细胞一样具有多向分化潜能。本研究构建重组质粒pEGFP-N1-hTERT并将其导入到大鼠胎儿神经干细胞中,对其荧光显微镜观察、CD133阳性细胞的流式细胞仪分析、培养特性测定、致瘤性试验、冻存等方面进行了较为系统的研究,主要得出以下结论:1.大鼠胎儿神经干细胞培养体系的建立通过对NSCs在无血清培养液SFCMⅠ和SFCMⅡ中生长情况,不同酶溶液消化传代对神经球形成的影响以及悬浮与贴壁培养方法对神经球增殖的差异进行分析,结果表明:(1)在试验中发现,无血清培养液SFCMⅠ是一种成熟的体外培养大鼠胎儿神经干细胞培养液,支持了神经干细胞在体外培养中的增殖和神经球的形成,能够达到神经干细胞增殖的需要。(2)试验表明,在神经干细胞所形成的神经球传代时,AccutaseTM是一种较为理想的酶溶液,消化的后细胞的存活率在92.6%左右,在神经球消化时最好辅以轻轻吹打,保持神经球在悬浮状态下消化,这样不但减少了酶对细胞的作用时间,而且有效的防止了细胞间发生粘联,提高了活细胞比率和数量,在培养中也增加了形成神经球的数量。(3)在细胞培养中发现,与明胶、鼠尾胶原和多聚赖氨酸包被处理的贴壁法培养细胞相比,1.5%的琼脂糖抗贴壁悬浮培养法更为适合神经干细胞的体外扩增。2.大鼠胎儿神经干细胞冷冻保存和体外诱导分化试验通过不同冷冻保护液对细胞冻存后的成活率和克隆形成率,以及3中细胞因子NGF、BDNF和GDNF对NSCs的诱导分化作用分析,认为:(1)可以根据实际情况使用D-MEM/F12+10%DMSO添加20%的FBS或NBS进行神经干细胞的低温冻存,超低温冻存对神经干细胞的多潜能性没有影响。(2)实验结果表明,含有100 ng/mL的NGF、BDNF和GDNF培养液在体外培养时,对神经干细胞有一定的诱导作用。添加NGF和BDNF的诱导培养液中主要分化为神经元,而添加GDNF的诱导培养液中主要分行为少突胶质细胞。3.pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与鉴定通过双酶切鉴定、DNA测序分析证实人端粒酶逆转录酶基因片段的准确性,以及通过绿色荧光蛋白间接观察到人端粒酶逆转录酶在细胞中的表达定位,已验证所构建的真核表达质粒pEGFP- N1-hTERT的正确性。重组质粒可在转染的神经细胞中表达人端粒酶逆转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白,通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察。人端粒酶逆转录酶真核表达载体的构建成功为进一步建立永生化神经干细胞奠定了基础。4.大鼠胎儿神经干细胞的永生化与检测通过对转染重组质粒的NSCs的GFP表达观察,多潜能性鉴定,RT-PCR和Western-blot分析,神经球中CD133+细胞增殖和细胞周期分布的流式细胞仪分析表明:(1)未转染的大鼠胎儿NSCs在体外培养中最高传7代,冻存了4.0×107 cells,而转染了重组质粒以后,细胞传代数上升,最高传12代,冻存3.35×107 cells(2)在本试验中,转染了重组质粒pEGFP-N1-hTERT的大鼠胎儿NSCs仍具有干细胞的生长特性和多潜能性,即在体外传代培养中可形成神经球并增殖,经血清诱导液诱导分化为神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞。裸鼠致瘤性试验证明了该细胞系无致瘤性。(3)通过RT-PCR试验证明了转染重组质粒的大鼠胎儿NSCs中,存在hTERT基因mRNA的转录产物;荧光显微镜检查结合Western-blot试验证实了融合蛋白hTERT-GFP的表达。(4)通过流式细胞仪分析未转染和转染重组质粒大鼠胎儿NSCs神经球中CD133+细胞增殖情况和不同时间细胞周期的变化,进一步证实了该重组质粒对神经干细胞端粒酶活性有上调作用,可促进细胞的体外长期增殖。
孟晋宏[2]2000年在《神经干细胞体内移植和体外L1转染的研究》文中研究表明哺乳动物中枢神经系统损伤和再生研究是神经科学研究领域的热点。中枢神经系统干细胞的研究是这一课题的重要组成部分，它有助于人们认以神经系统的发育过程，探索诱导细胞分化的分子机制，对于神经系统损伤的修复和疾病的治疗具有广阔的临床应用前景。本研究着眼于中枢神经系统干细胞的体外分化、体内移植和细胞粘连分子L1的体外转染，为神经干细胞(NSCs)的临床应用提供了新的实验证据，同时，为NSCs和L1分子协同作用的研究，提供了新的实验材料。 在实验的第一部分，我们成功地从EGFP转基因小鼠的胚胎中分离并培养出脊髓来源的NSCs，对它的最适培养条件进行了摸索，结果显示：1)培养液中只有EGF存在时，没有神经干细胞团形成；培养液中只有bFGF存在时，有少量干细胞团形成；培养液中EGF和bFGF同时存在时，干细胞团的数目最多。2)对体外培养不同时期的脊髓NSCs中的细胞成分的鉴定发现：体外培养2—2周时，
万凤[3]2017年在《基于干细胞巢调控的人参皂苷对缺血/再灌注神经干细胞增殖、分化的作用及其机制》文中认为目的研究人参皂苷通过作用于神经干细胞巢(NSCs niche)内的神经干细胞(NSCs)、星形胶质细胞(AC)和脑微血管内皮细胞(EC),对缺血/再灌注(OGD/R)后的NSCs增殖、分化的影响以及HIF-1α-VEGF信号通路的调节机制。方法1孕15-17d的SD大鼠,体外分离培养胎鼠海马NSCs,采用免疫荧光染色法对NSCs特异性标志物Nestin进行鉴定,NSCs增殖标记物BrdU进行增殖鉴定,神经元祖细胞特异性标记物Tuj-1及星形胶质细胞的祖细胞特异性标记物Vimentin对NSCs进行分化鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养星形胶质细胞,采用免疫荧光染色法对星形胶质细胞的特异性标志物GFAP进行鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养脑微血管内皮细胞,采用免疫荧光染色法对脑微血管内皮细胞的特异性标志物Factor Ⅷ进行鉴定。2 MTS法测定人参皂苷促进NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量及最佳给药时间点。3携带GFP基因的慢病毒转染NSCs,观察GPF的阳性表达率来确定NSCs的转染率,筛选出慢病毒转染NSCs的最佳转染指数MOI值及最佳转染时间。按照课题组先前的造模方法,采用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型模拟脑缺血/再灌注损伤,以缺氧缺糖4h为NSCs损伤的最高时间点。Western Blot检测慢病毒转染后NSCs核内HIF-1α蛋白表达,观察转染后HIF-1α蛋白表达情况,并计算出HIF-1α蛋白沉默率;免疫荧光及细胞核染色检测HIF-1α基因在NSCs的表达位置情况;免疫荧光染色法对转染后NSCs进行鉴定,并且检测转染后NSCs的增殖、分化情况。4实验分为6组,设立NSCs正常组、NSCs模型组、NSCs人参皂苷组(1.OOμg/ml)、慢病毒转染的NSCs(LV-NSCs)正常组、LV-NSCs模型组、LV-NSCs人参皂苷组(1.OOμg/mL),OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h三个时间点,分别收集处理NSCs和培养液,免疫荧光染色技术分析NSCs的增殖、分化情况,Western Blot分析NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测培养液VEGF含量。5采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与星形胶质细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组、NSCs/AC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组、LV-NSCs/AC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h三个时间点,分别收集处理NSCs、星形胶质细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析星形胶质细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。6采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与脑微血管内皮细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组、NSCs/EC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/EC 正常组、LV-NSCs/EC 模型组、LV-NSCs/EC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h三个时间点,分别收集处理NSCs、脑微血管内皮细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析脑微血管内皮细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。结果1 胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞的分离培养和鉴定体外成功分离培养胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞,经鉴定,其纯度达95%以上。2人参皂苷促进NSCs、胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量和最佳给药时间点①人参皂苷促进NSCs增殖的最佳剂量为1.00μg/mL,促进NSCs增殖的最佳给药时间点为24h。②人参皂苷促进星形胶质细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进星形胶质细胞增殖的最佳给药时间点为72h。③人参皂苷促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳给药时间点为24h。3慢病毒转染NSCs筛选最佳MOI值及最佳转染时间成功采用慢病毒转染NSCs,慢病毒转染NSCs的最佳MOI值为10,最佳转染时间为144h。与对照组相比,NSCs转染率为90.47%(P<0.01)。4 Western Blot检测OGD后慢病毒转染NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况与NSCs正常组和转染阴性对照组相比,NSCs转染组HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。经计算,HIF-1α 沉默率为 88.5%。5免疫荧光及细胞核染色检测OGD后HIF-1α在NSCs内的表达情况在缺氧条件下,NSCs正常组显示HIF-1α能够在NSCs核内表达;NSCs转染组显示GFP绿色荧光能够在细胞核内表达,并且HIF-1α不表达,表明慢病毒能够成功转染NSCs,并使HIF-1α表达沉默。6免疫荧光染色鉴定慢病毒转染NSCs后的Nestin及NSCs增殖、分化情况慢病毒转染后的NSCs均表达Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性,慢病毒转染后的NSCs仍能够增殖,并且分化为神经元的祖细胞和星形胶质细胞的祖细胞,但其增殖、分化能力明显降低。7免疫荧光染色技术检测OGD后NSCs增殖和分化情况①NSCs各组:NSCs正常组、NSCs模型组和NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与NSCs正常组相比,NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs模型组比较,NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组、LV-NSCs模型组和LV-NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs模型组比较,LV-NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数少量增加,差异无统计学意义。8 Western Blot检测OGD后各组NSCs核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs各组:NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白少量表达或几乎不表达;与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞核中的HIF-1α蛋白表达明显减少(P<0.01)。9 ELISA检测OGD后各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs各组:NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量很低;与N LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显减少(P<0.01)。10 MTS检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。11免疫荧光双标染色检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组和NSCs/AC人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/AC 正常组相比,NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/AC 各组:LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组和 LV-NSCs/AC 人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。12 Western Blot检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组星形胶质细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。②LV-NSCs/AC:LV-NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。13 ELISA检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/AC各组:LV-NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。14 MTS检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。15免疫荧光双标染色检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组和NSCs/EC人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin 阳性表达;分别复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/EC 正常组相比,NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:正常组、模型组和人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性表达;分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。16 Western Blot检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组脑微血管内皮细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与 LV-NSCs/EC 模型组相比,LV-NSCs/EC 人参皂苷组 HIF-1α 蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。17 ELISA检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组相比,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。结论人参皂苷通过调节NSCs niche内的NSCs、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞,通过调控HIF-1α-VEGF信号通路,以自分泌和旁分泌的共同方式,促进缺血/再灌注后NSCs增殖,并且诱导NSCs分化为神经元和星形胶质细胞的祖细胞。
徐强[4]2004年在《TH基因修饰骨髓基质细胞源神经干细胞自体移植治疗恒河猴帕金森病模型》文中研究表明一．概述 帕金森病是1817年英国医生James Parkinson描述的，以运动困难、肌肉强直、静止性震颤为特征的锥体外系疾病。多在50～65岁起病，呈进行性缓慢病程，主要病理变化是黑质纹状体区的多巴胺能神经元的变性、缺失，导致脑内多巴胺能神经递质相对减少，但其病因和发病机制尚不十分明确。目前，药物治疗、各种外科治疗(核团损毁术和DBS)只限于症状控制，并不能阻止帕金森病患者的病程进展。随着神经干细胞、分子克隆和重组基因技术的逐渐成熟，使神经干细胞基因治疗帕金森病的前景更加光明。 目前，PD基因治疗研究主要有两个方向：一是脑内导入酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)基因，通过TH基因的有效表达，提高脑内DA水平，以缓解PD症状；或导入各种神经营养因子或抗凋亡基因(bcl-2)、抗氧化基因(CuZnSOD和MnSOD)，改善黑质-纹状体的微环境，保护DA能神经元。二是联合基因治疗，即脑内导入两种以上的目的基因，希望同时达到上述目的。基因治疗的方法主要有：①体内直接转染法：把携带有治疗基因的载体(非病毒、病毒)直接注入到纹状体区，通过与周围细胞的粘附、吞饮、渗透、进入细胞内并与细胞内的染色体整合，或独自表达，表达产物的释放，起到生物药物泵的作用，发挥治疗作用，此方法简便、直接，但转染率低，易受到体内溶酶体中核酸酶的降解，靶向性差，基因表达程度低，可控性差，无法进行筛选和鉴定。②体外细胞介导法：体外细胞介导基因治疗结合基因转移技术和 弟一军医大学二零零一级博士学位论文导师:徐如祥教授脑内移植，可以在体外通过分子和生物化学技术对基因表达进行评估，首先是通过载体把目的基因转入到培养的靶细胞内，在体外进行筛选、鉴定，再进行扩增，然后移植于靶位点，转基因的表达功能通过生化技术和实验动物行为进行评估和监测。 帕金森病基因治疗的靶细胞有成纤维细胞，原代骨骼肌细胞、胶质细胞、胚胎中脑细胞、神经干细胞等。重组成纤维细胞、原代骨骼肌细胞虽然易于培养，能够发挥一定的治疗作用，但在脑内成活时间短、成活率低，不能与宿主细胞产生突触联系;胚胎中脑细胞、胚胎神经干细胞、成体神经干细胞存在非自体来源和来源有限的问题，限制了在帕金森病基因治疗上的应用。由于骨髓基质细胞容易获取，可以在体外大量扩增，而且可在一定条件下诱导成神经细胞并运用于自体移植，这为神经干细胞的应用提供了无限制的来源。骨髓源神经干细胞(NSCs一BMSCS)的开发和应用，克服了从脑组织获取神经干细胞的危险性和局限性，也避免了胎儿组织移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题。以骨髓源神经干细胞为载体，进行基因转染、定向诱导神经干细胞为DA能神经元，替代变性的多巴胺能神经元，同时，神经干细胞分泌的神经营养因子则可以改善局部的微环境，起着营养支持的作用，从而可根本上遏制帕金森病的渐进病程。 本研究采用分子克隆、骨髓源神经干细胞培养和脑立体定向细胞移植等实验技术，将hTH基因分别构建入pEGFP一cZ和peDNA3.IHis真核表达载体中，构建了pEGFP一cZ一hTH和PcDNA3.IHis一hTH。同时，纯化提取pEGFP一cZ质粒，酶切鉴定后分别转入培养的骨髓源性神经干细胞，体外进行其基因表达情况的观察，证实成功表达后，将转染的骨髓源性神经干细胞定向注射入经右颈总动脉注射MPTP制作的偏侧恒河猴帕金森病模型的尾状核头部和黑质部位。移植后定期观察恒河猴的动作行为变化。5个月后行头部’“F一FDG PET、MRI和”9mrI’c一TRoDAf一lSPECT检查，分别观察细胞移植后脑内的代谢、结构和脑内DA能神经元的分布。最后，免疫组织化学观察移植细胞的分布情况。第7页第一军医大学二零零一级博士学位论文导师:徐条祥教授二.本实验的主要方法和结果:1.为适时观察基因在细胞内的表达，以户从VZ一TH为模板，PcR扩增，携带Eco班和BamHI双酶切位点的hTH目的片段，大小为1，500bp。 回收PcR产物与与pEGFP一cZ的双酶切片段连接，连接产物转化感 受态BL21，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取质粒经酶切和测序鉴 定，结果显示:hTH目的片段测序结果与报道序列(gi:37 1 26)同源 性达100%;pEGFP一cZ一hTH酶切片段大小正确，说明已成功地将 hTH基因克隆到荧光表达载体pEGFP一cZ上。pEGFP一cZ为真核荧 光表达载体，5’端连接有报告基因即增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein，EGFP)基因，EGFP在紫外光激发下可发强 绿色荧光，能较好的标示出细胞转染情况。2.为移植后跟踪移植细胞的迁移分布情况，以p认钱VZ一TH为模板，PCR 扩增携带KPul和xbal双酶切位点的hTH目的片段，大小为1，500bp。 回收peR产物与KPnl和Xbal双酶切peDNA3.lhis片段连接，连接 产物转化感受态大肠杆菌，氨节青霉素抗性筛选阳性克隆。提取质粒 经酶切和测序鉴定，结果显示:hTH目的片段测序结果与报道序列同 源性达100%;PcDNA3.lhis一hTH酶切片段大小正确，说明已成功地 将盯H基因克隆到真核表达载体PcDNA3 .lhis中。其中，PcDNA3.lllis
沈云东[5]2007年在《神经干细胞体内外分化与体内移植延缓失神经肌肉萎缩的实验研究》文中研究指明第一部分绿色荧光蛋白(GFP)转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞体外培养与诱导分化的实验研究目的探讨绿色荧光蛋白转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞(GFP-NSC)体外增殖、分化的生物学活性，并探索一种体外诱导神经干细胞向神经元分化的培养方法。方法1、对GFP转基因大鼠的胚胎脊髓神经干细胞进行体外分离、培养和诱导分化，并应用特异性抗体分别对神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞进行免疫荧染色鉴定。2、神经干细胞体外连续传代3次以上，在原有神经干细胞培养液中加入Laminin和Heparin两种成份，继续体外悬浮培养5天。之后更换为神经干细胞分化液，诱导神经干细胞体外贴壁分化。分化2周后，应用神经元特异性抗体对神经元进行免疫荧光染色，计数神经干细胞分化为神经元的比例。并应用RT-PCR对分化细胞中突触素的表达量进行半定量检测。以神经干细胞经常规体外培养和诱导分化获得的神经终末细胞作为对照组。结果1．通过体外分离培养的方法获得了稳定传代的GFP-NSC，经体外诱导分化可以形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。2．本实验改进的胚胎脊髓神经干细胞体外诱导培养方法，使神经干细胞体外分化为神经元的比例明显增加，由原来的不足7％增加到20％以上。结论1．GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞具有正常神经干细胞的特点，具有良好的生物学活性。2．本实验采用的诱导神经干细胞向神经元分化的方法，可以明显提高神经干细胞分化为神经元的比例，为进一步研究神经干细胞体内分化及体内移植防治骨骼肌失神经萎缩奠定了基础。第二部分移植神经干细胞在周围神经内存活与分化的实验研究目的应用不同方法处理GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞，对其移植于周围神经内的存活与分化情况进行研究。方法1．构建携带神经营养因子NT3的慢病毒载体，并转染神经干细胞。2．建立F344大鼠胫神经切断的动物模型，将神经干细胞(实验组1)、经过体外向运动神经元诱导的神经干细胞(实验组2)及同时转染NT3的神经干细胞(实验组3)分别制成单细胞悬液移植于胫神经远侧段。细胞移植后4周、12周取材。分别应用神经元、运动神经元、神经胶质细胞、轴突以及突触素等的特异性抗体对胫神经冰冻切片进行免疫荧光染色，应用乙酰胆碱受体和突触素的特异性抗体对肌肉组织冰冻切片进行免疫荧光染色。对神经干细胞体内是否能够分化为神经元和运动神经元，分化形成的运动神经是否能够发出轴突，以及分化形成的神经元是否能够与失神经肌肉建立突触连接等问题进行研究，并比较各实验组神经干细胞体内分化情况的变化。结果GFP-NSC移植于周围神经后，可以长期存活，可以分化形成星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、运动神经元，而且分化形成的神经元可以发出轴突向远端生长。细胞移植后12周，实验组失神经肌肉表面突触素大量聚集，突触后膜形态较好，已接近正常肌肉突触后膜的形态。经体外诱导的神经干细胞体内移植后向神经元分化的比例明显提高而且时间提前；经体外诱导并转染NT3的神经干细胞分化为神经元的比例进一步提高。根据各组中神经元分化比例、运动神经元出现时间及突触素表达强度等结果进行比较，实验组3优于实验组2，实验组2优于实验组1。结论1．GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞体内移植后可以分化为运动神经元，并可以发出轴突到达失神经肌肉；2．神经干细胞经过体外向运动神经元诱导或同时转染NT3以后，其体内分化为神经元的比例明显提高，而且神经元出现的时间也明显提前。该结果为进一步研究神经干细胞体内移植防治骨骼肌失神经萎缩奠定了基础。第三部分神经干细胞移植延缓失神经肌肉萎缩的实验研究目的探讨神经干细胞移植于周围神经后，对于延缓失神经肌肉萎缩的效果。方法建立F344大鼠胫神经切断的动物模型，将神经干细胞(实验组1)、经过体外向运动神经元诱导的神经干细胞(实验组2)以及体外诱导同时转染神经营养因子NT3的神经干细胞(实验组3)分别制成单细胞悬液移植于胫神经远侧段。细胞移植后4周、12周取材。测量小腿三头肌肌湿重，并分别应用HE染色、Mallory三色染色的方法对失神经肌肉组织进行染色，同时应用突触后膜乙酰胆碱受体(AchR)特异性抗体对肌肉冰冻切片进行免疫荧光染色。应用图像分析软件对各组动物腓肠肌纤维截面积和突触后膜面积进行测定，并进行统计学分析。结果各组动物失神经肌肉之肌湿重、肌纤维截面积和突触后膜面积均出现不同程度的下降，但三个实验组结果均优于对照组，各实验组间比较，实验组3优于实验组2，实验组2优于实验组1，结果经统计学分析，存在显著性差异。结论1．GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞体内移植后发挥了延缓失神经肌肉萎缩的作用，同时对维持突触后膜的形态发挥了重要的作用。2．神经干细胞经过体外向运动神经元诱导或同时转染神经营养因子NT3后，其延缓肌肉萎缩的效果明显增强。
武强[6]2007年在《A_2M FP_6 DNA片段转染神经干细胞移植治疗转基因AD小鼠的实验研究》文中进行了进一步梳理阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是发生于老年和老年前期以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。随着分子生物学和分子病理学的飞跃发展,AD的病因及发病机制的研究取得了很大进展,淀粉样蛋白级联反应被认为在AD的发病机制中占主导作用,已成为AD发病机制研究中的热点和治疗AD的突破点。淀粉样蛋白级联反应学说认为基因突变或其它因素使Aβ淀粉样蛋白(amyloidβprotein, Aβ)的表达增加或代谢紊乱,导致Aβ的产生和清除不平衡,日积月累造成Aβ的沉积,形成老年斑(senile plaque, SP)和神经原纤维缠结(neurofibillary tangles, NFTs),最终导致神经细胞变性坏死。越来越多的资料表明Aβ淀粉样肽产生过多,其聚集物在脑组织中的形成与沉积是AD发病的一个中心环节和共同通道。因此,若能够减少Aβ肽的形成、抑制Aβ肽的聚集、抑制Aβ多肽的神经毒性、加速Aβ肽的降解与清除,则可能成为预防和治疗AD的理想途径。目前AD常规的治疗,既不能消除Aβ的沉积,也没有改善神经元的丢失。难以达到理想的治疗效果。随着基因治疗和干细胞工程技术的迅猛发展,为解决这一难题提供了新的思路。α2巨球蛋白(Alpha-2 macroglobulin, A2M)是一泛蛋白酶抑制剂,也是脑组织免疫炎症反应的一种急性期反应蛋白,主要由肝脏合成,在脑内可由星形胶质细胞产生,它广泛分布在细胞外液中,在血浆中维持较高的浓度。近来研究发现,A2M是Aβ肽的一种高亲和力的结合蛋白,其C末端的27个氨基酸可与Aβ肽特异性结合。通过A2M与Aβ的相互作用,A2M可中和Aβ的毒性、降解并清除Aβ。另外,A2M还可与一些小分子如细胞因子、生长因子、免疫炎症因子等结合并清除这些分子,从而影响细胞的表型,影响细胞因子、生长因子、免疫炎症因子等的平衡以及局部微环境的稳定,调节细胞的生长和生理过程。通过不同的限制性内切酶消化及聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)方法可将A2M分成6个片段,即FP1(aa99-392),FP2(aa341-590),FP3(aa591-744),FP4(aa775-1059),FP5(aa1030-1279),FP6(aa1242-1451)。各片段与生长因子、Aβ的体外试验证明,以转化生长因子( transforming growth factor-beta, TGF-β)为代表的生长因子选择性与FP3段结合,Aβ则与FP6段选择性结合,且其结合具有高度的特异性。这也提示A2M(FP6)可能成为一个治疗AD新的方向。神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)作为神经系统的全能细胞,有很强的分裂、增殖能力,且在不同因子作用下,定向分化成神经元和神经胶质细胞。体外培养的神经干细胞作为神经损伤、修复的治疗性供体已经展现了诸多的优点。而且它也是非常理想的基因治疗载体。鉴于A2M具有中和Aβ的毒性、降解并清除Aβ及其FP6段能特异性结合Aβ的重要特性,利用NSCs可作为基因治疗的载体及其对缺失神经元的替代作用,本研究小组在成功构建了pEGFP/A2M(FP6)真核表达载体的基础上,应用脂质体转染获得转染pEGFP/A2M(FP6)的NSCs,探索转染pEGFP/A2M(FP6)的NSCs治疗AD的新方法。初步实验发现,pEGFP/A2M(FP6)的转染能明显提高体外培养的NSCs体系对Aβ毒性的耐受性,并减少Aβ处理后细胞的死亡。在此基础上,本实验采用PCR、NSCs分离培养、基因转染等技术,并结合水迷宫测试、转基因小鼠鉴定、定向海马移植、免疫组化染色以及荧光显微镜观察和图像分析等手段,首先对所获pEGFP/A2M(FP6)重组质粒进行鉴定,将构建好的pEGFP/A2M(FP6)真核表达载体转染至NSCs中,观察携带pEGFP/A2M(FP6)NSCs的生物学特性,并将其定向移植到APP/PS1双转基因AD小鼠海马内,观察移植细胞的存活、分化、迁移,脑内Aβ沉积的变化,以及对APP/PS1双转基因AD小鼠学习记忆功能的影响。结果如下:一、pEGFP/A2M(FP6)重组质粒转染神经干细胞的实验研究1.采用机械分离法,成功的分离出胚胎小鼠皮层NSCs,利用DMEM/F12(1:1)培养基,加入生长因子B27和碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast growth factor, bFGF),成功地进行了NSCs的培养和传代。采用Nestin、GFAP、MAP-2进行鉴定,并进行了MAP-2和GFAP的双标记,培养的细胞有阳性表达,充分说明我们分离、培养的细胞为NSCs,而且具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。NSCs分离、培养、鉴定的完成为pEGFP/A2M(FP6)转染提供了载体。2.利用Nucleofector转染技术成功将pEGFP/A2M(FP6)重组质粒转染入NSCs,转染率约为50%,经G418筛选传3代,荧光显微镜下仍可见EGFP的表达,经10%胎牛血清诱导后,免疫荧光组织化学染色显示部分细胞MAP-2、GFAP表达阳性。表明转染pEGFP/A2M(FP6)对神经干细胞的生长、分化无明显影响。转染pEGFP/A2M(FP6)的NSCs用RT-PCR可检测到A2M FP6mRNA的高表达,免疫荧光组织化学法观察到A2M蛋白的表达。这也为我们细胞移植治疗AD提供了理论及实验基础。二、APP/ PS1双转基因AD传代小鼠的基因型鉴定及其行为学和组织学分析1.对转基因小鼠杂合体种鼠(来源于Jackson实验室)进行繁殖,抽取小鼠的尾血提取基因组DNA,并进行基因型分析,筛选得到了APP/PS1双转基因AD小鼠。2.抗Aβ免疫荧光组织化学染色显示APP/PS1双转基因AD小鼠的皮层及海马区有大量的Aβ染色阳性斑块。透射电子显微镜下海马区Aβ周围神经元溃变、肿胀,细胞内含有大量的脂褐素,神经突触稀松形态不一,微管小泡及线粒体堆积,胶质细胞胞浆肿胀。水迷宫实验发现该小鼠逃避潜伏期较对照鼠显著延长。表明APP/PS1双转基因AD小鼠具有AD主要的病理及行为学特征,为本研究提供了理想的AD动物模型。三、携带目的基因的神经干细胞移植治疗AD小鼠的实验观察1. AD小鼠水迷宫测试,pEGFP/A2M(FP6)-NSCs组和pEGFP -NSCs组小鼠逃避潜伏期较SO组及ACSF组显著缩短;pEGFP/A2M(FP6)-NSCs组和pEGFP -NSCs组AD小鼠逃避潜伏期相比,差异有统计学意义(p<0.05)。表明两组均能有效改善AD小鼠的学习记忆障碍,以pEGFP/A2M(FP6)-NSCs组改善效果更佳。2.抗Aβ免疫荧光组织化学染色显示,pEGFP/A2M(FP6)-NSCs组和pEGFP -NSCs组AD小鼠海马及皮层内,部分Aβ染色阳性斑块周围可见表达EGFP的移植细胞,表明移植的神经干细胞可迁移并包绕Aβ斑块。观察pEGFP/A2M(FP6)-NSCs组AD小鼠额叶、海马区域,Aβ染色阳性斑块数量和平均面积均较pEGFP -NSCs组、SO组及ACSF组显著减少。表明pEGFP/A2M(FP6) NSCs移植治疗可以减少AD小鼠皮层及海马区Aβ斑块的沉积。3.移植的神经干细胞,部分细胞Nestin染色呈阳性,表明仍具有干细胞的活性,MAP-2染色显示少数移植细胞呈阳性, GFAP染色部分移植细胞呈阳性。说明部分移植的神经干细胞分化为神经元及星形胶质细胞。本实验首先对所获pEGFP/A2M(FP6)重组质粒进行鉴定,将之成功地转染入神经干细胞,使其高表达具有生物学活性的A2M(FP6)。并将转染pEGFP/A2M(FP6)神经干细胞移植到APP/PS1双转基因AD小鼠海马,观察到AD小鼠脑内Aβ斑块沉积减少,部分移植的神经干细胞分化为神经元及星形胶质细胞,小鼠的学习记忆功能显著改善。本研究从神经干细胞应用及基因治疗的角度对AD的治疗进行了有益的探索。
刘辉[7]2002年在《神经干细胞生物学特性、神经干细胞移植治疗颅脑损伤后神经功能缺失及免疫基因治疗大鼠胶质瘤的研究》文中研究表明目前，损伤、恶性肿瘤和心脑血管疾病已经成为人类健康的头号敌人，现行的医疗方案已经远远不能满足疾病治疗的需要，在90年代兴起的干细胞研究为疾病的治疗提供了崭新思路，干细胞研究因为其巨大的应用前景被美国《Science》杂志评为1999年世界10大科学进展之首，为世人所瞩目。干细胞特有的生物学特征及潜在生物学应用价值成为近年生物学领域的热点课题。正因为干细胞的特殊科学意义及在医学上的应用前景，各国对此都投入了大量的人力物力进行研究，日本把干细胞列入“千年世纪工程”中的4大重点之一；英国议会通过了应用人胚胎进行研究的议案。 神经干细胞(NSCs)是长期具有自我更新能力的细胞，经过不对称分裂神经干细胞可以生成一个祖细胞及另一个干细胞，其中祖细胞进行有限的分裂而分化成神经元及胶质细胞，而干细胞则继续分裂。从哺乳动物及人类的中枢神经系统的一定部位可分离出神经干细胞，如脑室下区、海马齿状回、嗅脑、小脑皮质生发层等。 干细胞疗法近年来已成为治疗多种疾病的新策略，其目的是替代、修复或加强受损的组织或器官的生物学功能，同时干细胞具有自我更新与增殖分化的生物学特性，是基因疗法一种理想的靶细胞。由于神经干细胞具有基因的可操作性，可携带多个外源基因；转染后外源基因在体内体外稳定表达；移植后可整合到宿主脑组织；在宿主脑内迁移等优良特性，使其成为基因治疗的良好载体。 天津医科大学博士学位论文 有关海马神经干细胞的分离及生物学特性的研究，目前国外只有少量报道，国内则未见报道。神经干细胞移植在颅脑损伤方面的应用仅见个别报道，转染白介素12(工L一12)的神经干细胞用于治疗大鼠胶质瘤的研究则未见报道。本实验首先对取自胎鼠或胎儿海马的神经干细胞自我更新及多向分化生物学特性进行研究，并且对NSCs的标记神经上皮干细胞蛋白(nestin)、表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维生长因子(FGF一2)对NSCs的作用、NSCs体内分化等进行系统的研究，随后对NSCs移植修复颅脑损伤后神经功能缺失、转染工L一12的神经干细胞用于免疫基因治疗大鼠颅内胶质瘤进行初步研究。第一部分:神经干细胞生物学特性的研究 对胎鼠及胎儿海马EGF、FGF一2依赖性神经干细胞的分裂增殖、多向分化特性及超微结构进行研究，并且对NSCs的标记nestin、EGF及FGF一2对NSCs的作用、NSCS体内分化等进行系统的研究。 1.应用MTT检测法及5一滨脱氧尿核昔(BrdU)染色观察干细胞的分裂增殖，应用透射电子显微镜观察干细胞的超微结构，应用免疫荧光及免疫组化方法观察干细胞的抗原特性及分化潜能。胎鼠及胎儿海马中存在多潜能神经干细胞，体外培养时其细胞活性不断增加，大多数细胞呈BrdU阳性。在电镜下可见核浆比大，核仁明显，异染色质分散呈小碎片状，胞浆中有很多游离核糖体，线粒体及粗面内质网很少。在适当的条件下神经干细胞可以分化产生具有一定比例的神经元及神经胶质细胞。 2.Nestin是NSCs中的中间丝状蛋白。本实验使用细胞免疫染色、队CS、RT一PCR、Western Blot方法检验取自胎儿海马的NSCs的nestin表达。神经干细胞球体中的细胞几乎均(>90%)呈nestin阳性，但呈神经元特异性烯醇化酶伽sE)阴性，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阴性。通过RT一pCR方法检测到nestin在mRNA水平的表达，Western Blot显示nestin分子量大约为240KD。 3.EGF和FGF一2对NSCs有重要作用，最初由EGF和FGF一2共同作用分离的 天津医科大学博士学位论文hNSCs在去掉一种生长因子(EGF或FGF一2)后细胞增殖立即下降，在FGF一2持续存在时hNSCS产生明显多的神经元，但EGF存在与否对hNSCS的分化无明显影响。 4.在被移植到成年大鼠脑组织内，hNSCS发生部位特异性的分化，并可沿内源性NSCS的移动路径发生迁移。 可见胎鼠或胎儿海马神经干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞，具有不成熟的细胞核及胞浆超微结构，EGF、FGF一2作为外源性信号因子作用于胎鼠海马神经干细胞的相应受体，对其分裂分化可产生重要作用。nestin作为特异性标记可以帮助我们区分NSCs，因而对NSCs移植治疗颅脑疾病有重要的应用价值。NSCs移植后对体内环境信号的恰当反应，及其在体外的大量增殖能力使其在日后的实验及临床应用方面有重要意义。第二部分:神经干细胞移植治疗颅脑损伤后的神经功能缺失 在体外培养中NSCs能够不断分裂增殖，当NSCs被移植到动物体内，可与宿主细胞良好整合，对局部信号产生形态反应，恰当地分化成为不同的神经元及胶质细胞，并沿着神经轴迁移加入正常的神经发育。本实验对NSCS移植修复颅脑损伤后神经功能缺失，间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化，MSCs移植对颅脑损伤修复进行研究。 我们使用自由落体大鼠颅脑损伤模型，全部动物分为4组，假损伤组(Sham)，损伤组(TBI)，治疗对照组(TBI+DF)，治疗组(TBI+N SCs)。损伤组与正常组相比，在伤后48小时及7天运动神经功
高健[8]2018年在《人参皂苷对神经干细胞的作用及HIF-1a-VEGF通路的调控机制》文中研究表明目的从中医“祛瘀生新”的角度出发,基于神经干细胞的生物学特点,从在体神经干细胞发生和异体神经干细胞移植两个方面,探讨神经干细胞在缺血损伤修复过程中发挥的作用及机制。方法1孕15-17 d的SD大鼠,体外分离培养胎鼠海马NSCs,采用免疫荧光染色法对NSCs特异性标志物Nestin进行鉴定,NSCs增殖标记物BrdU进行增殖鉴定,神经元祖细胞特异性标记物Tuj-1及星形胶质细胞的祖细胞特异性标记物Vimentin对NSCs进行分化鉴定。2 SD雄性大鼠随机分为5组(n=7):正常对照组(Sham group)、模型组(Model group)、人参皂苷治疗组(Gin group)、NSCs移植治疗组(NSCs group)和人参皂苷治疗同时神经干细胞移植治疗组(Gin+NSCs group)。SD大鼠建立局灶性脑缺血模型,NSCs移植治疗组对建立缺血模型后大鼠缺血侧进行NSCs移植治疗,对缺血7 d后大鼠神经功能改善及脑组织梗死情况进行评估。3基于上述实验分组,收集缺血7 d后大鼠全血及脑组织,制备血清及脑组织匀浆液。采用酶联免疫分析ELISA方法测定在血清和组织匀浆液中的炎性介质,包括炎性细胞因子(IL-lβ,IL-6,TNF-α),趋化因子(CXCL-1,MCP-1),粘附分子(ICAM-1)及一些抗炎细胞因子(IL-4,IL-10)等,为神经干细胞移植治疗缺血性脑中风的作用机制提供有效证据,并进一步探讨了人参皂苷的抗脑中风机制。4携带GFP基因的慢病毒转染NSCs,确定慢病毒转染NSCs的最佳转染复数MOI值及最佳转染时间。实验分为4组,设立正常对照组(Shamgroup)、模型组(Model group)、NSCs移植治疗组(NSCs group)和慢病毒转染后HIF-1α基因沉默表达的NSCs移植治疗组(LV-NSCs group)。建立大鼠脑缺血模型后,NSCs移植治疗组(NSCs group)和HIF-1α基因沉默的NSCs移植治疗组(LV-NSCs group)分别在缺血侧侧脑室移植正常NSCs和HIF-1αα基因沉默的NSCs。缺血7 d后,收集血清及脑匀浆液用于测定其炎性相关因子,探讨HIF-1α在侧脑室移植NSCs进行脑损伤修复过程中可能发挥的作用,及其与炎症调节之间的关联。5新生小鼠随机分为4个组:空白对照组(Sham),缺血缺氧模型组(HI),2ME2组(2ME2)和DMOG组(DMOG)。小鼠右侧颈总动脉永久结扎,并进行30min低氧处理,建立缺血缺氧模型。选择2ME2作为HIF-1a蛋白表达抑制剂,DMOG作为PHD的活性抑制剂,即HIF-1a激活剂。通过缺氧/缺血后腹腔内注射后2ME2和DMOG进行干预,采用western bloting技术测定缺血缺氧后新生小鼠脑组织HIF-1a及VEGF表达量。采用western blotting方法测定缺血缺氧后脑组织中caspase 3表达量,研究HIF-1a及VEGF水平对缺血缺氧后新生小鼠大脑皮层凋亡的影响。6采用NSCs的特异性标志物巢蛋白Nestin及增殖细胞核抗原PCNA抗体对缺血缺氧大脑SVZ区内的NSCs进行鉴定和增殖标记。基于上述实验分组,采用免疫荧光双标方法检测缺血缺氧后对新生小鼠大脑SVZ区神经干细胞增殖情况,并研究HIF-1α和VEGF蛋白水平对SVZ区神经干细胞增殖的影响。7.采用DCX抗体评价神经前体细胞迁移活性,神经元特异性核抗原(NeuN)抗体可标记成熟的神经元。采用免疫荧光双标方法检测缺血缺氧后对新生小鼠大脑SVZ区及皮层神经干细胞分化情况,评价缺血缺氧后,HIF-1α和VEGF蛋白水平对新生小鼠大脑室管膜下区及皮层神经干细胞分化的影响。结果1胎鼠海马NSCs分离培养和鉴定体外成功分离培养胎鼠海马NSCs,经鉴定,其纯度达95%以上。2各实验组缺血7 d后大鼠神经功能改善、脑组织水肿及梗死情况(1)Model组神经行为评分显著高于Sham组(p<0.05),说明造模成功。人参皂苷治疗组和侧脑室移植NSCs治疗组能显著改善动物局灶性脑缺血后7天的神经损伤症状(p<0.05)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同改善大鼠脑缺血后神经损伤效果更明显。(2)缺血损伤后,model组大鼠脑组织出现明显白色缺血区域。人参皂苷和移植神经干细胞均可显著缩小脑缺血面积,减少梗死体积(p<0.01)。人参皂苷和移植NSCs共同进行治疗时,二者有很好的交互作用,协同改善缺血后脑梗塞体积。(3)脑缺血7 d,model组脑水肿率明显大于Sham组(p<0.05),而人参皂苷和移植神经干细胞均可明显改善脑缺血7 d后大鼠的脑水肿情况(p<0.05)。3 ELISA方法测定在血清和组织匀浆液中的炎性相关细胞因子(1)脑组织匀浆液中炎性因子水平缺血缺氧7 d,model组大鼠脑组织匀浆液中的炎性细胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α)均有显著的提高(p<0.01)。IL-1β水平在侧脑室NSCs移植治疗组,人参皂苷治疗组及侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组IL-1β水平均显著降低(p<0.01)。IL-6水平在侧脑室NSCs移植治疗组、人参皂苷治疗组及侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组均有所降低,但差异无显著性意义(p>0.05)。TNF-αα水平在侧脑室NSCs移植治疗组,人参皂苷治疗组及侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组TNF-α水平均显著降低(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同降低大鼠脑缺血损伤验证级联反应中TNF-α水平。(2)脑组织匀浆液中抗炎细胞因子水平缺血缺氧7 d,model组鼠脑组织匀浆液中的抗炎细胞因子(IL-4,IL-10)均有显著的提高(p<0.05)。IL-4在各个治疗组水平均显著升高(p<0.05)。IL-10水平在侧脑室NSCs移植治疗组、人参皂苷治疗组、侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组均有所升高,差异有统计学意义(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同升高大鼠脑缺血损伤验证级联反应中IL-10水平。(3)大鼠血清中粘附分子水平缺血缺氧7d,model组大鼠血清中的趋化因子(ICAM-1)显著升高(p<0.01)。ICAM-1水平在各个治疗组均降低,差异有统计学意义(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同降低大鼠脑缺血损伤验证级联反应中粘附分子ICAM-1水平。(4)脑组织匀浆液及血清中趋化因子的水平缺血缺氧7 d,model组大鼠脑组织匀浆液中的MCP-1及血清中CXCL-1均显著提高(p<0.01)。MCP-1水平在侧脑室NSCs移植治疗组及人参皂苷治疗组有所降低,但无显著性差异(p>0.05),侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组MCP-1水平显著降低(p<0.01)。趋化因子CXCL-1水平在侧脑室NSCs移植治疗组、人参皂苷治疗组、侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组均有所降低,差异有统计学意义(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同降低大鼠脑缺血损伤验证级联反应中趋化因子CXCL-1的水平。4 HIF-1α在侧脑室移植NSCs进行脑损伤修复过程中发挥的作用(1)慢病毒转染NSCs的最佳MOI值为10,最佳转染时间为转染后144 h。(2)神经功能学评分:侧脑室NSCs移植治疗组能显著改善大鼠局灶性脑缺血后7天的神经损伤症状(p<0.01),LV-NSCs移植治疗组神经行为评分情况与模型组相比,差异无统计学意义(p>0.05),其对缺血后大鼠神经功能改善作用不明显。(3)NSCs侧脑室移植对脑组织匀浆液及血清中炎性相关因子的影响①炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平在LV-NSCs移植组有降低趋势,但差异无统计学意义(p>0.05)。②抗炎细胞因子IL-4在LV-NSCs移植组有所升高,但差异无统计学意义(p>0.05);IL-10水平在LV-NSCs移植组降低,差异有统计学意义(p<0.01)。③趋化因子MCP-1水平在侧脑室LV-NSCs移植组有所降低,但无显著性差异(p>0.05),CXCL-1水平在LV-NSCs移植组降低,差异有统计学意义(p<0.01)。④趋化因子ICAM-1水平在LV-NSCs移植组降低,差异有统计学意义(p<0.01)。5 Western Blot检测新生小鼠皮层中HIF-1α和VEGF蛋白表达量在缺血缺氧条件下,HIF-1α和VEGF蛋白表达量上调。DMOG显著上调缺血缺氧后新生小鼠脑皮层HIF-1α和VEGF蛋白表达量,而2ME2下调HIF-1α和VEGF蛋白表达量。6 DMOG及2ME2对缺血缺氧后新生小鼠大脑皮层凋亡的影响正常状态下,凋亡因子caspase3低表达;缺血缺氧早期,caspase3表达量有所增加,缺血缺氧24 h,caspase 3表达量显著增加,大脑皮层HIF-1α大量表达可能诱导细胞凋亡。7缺血缺氧后HIF-1α和VEGF蛋白水平对新生小鼠大脑室管膜下区NSCs增殖的影响缺血缺氧后大脑SVZ区HIF-1α/Nestin、VEGF/Nestin双标的阳性细胞数目显著增多,2ME2有效降低了 HIF-1α/Nestin、VEGF/Nestin阳性标记细胞数量,DMOG使缺血缺氧后HIF-1α/Nestin、VEGF/Nestin阳性标记细胞数量显著增加。8缺血缺氧后HIF-1α和VEGF蛋白水平对新生小鼠大脑室管膜下区及皮层NSCs分化的影响正常状态下,DCX/PCNA,NeuN/PCNA低表达,缺血缺氧早期,DCX/PCNA表达量有所增加,给予2ME2干预后,缺血缺氧4 h及24 h DCX/PCNA表达量下调,DMOG干预组DCX/PCNA阳性表达细胞明显增多。缺血缺氧2 w,NeuN/PCN表达量显著增加,给予2ME2干预后,NeuN/PCN表达量下调,DMOG干预组NeuN/PCN阳性表达细胞明显增多。结论基于炎症系统,异体移植神经干细胞通过调节炎性相关因子水平发挥了抗脑缺血作用,中药人参皂苷发挥了协同增效的作用。HIF-1α和VEGF蛋白高表达促进了缺血缺氧损伤后脑内神经干细胞的增殖以及分化,促进了神经发生,修复了脑损伤。
王霞[9]2003年在《神经干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤》文中提出尽管当今围产期监测、孕期和新生儿监护等方面的医疗技术取得了长足的发展，但近十年来，新生儿缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)的发生率却无明显降低，平均每1000个活产足月儿中，就有3～4个婴儿发病，早产儿的发病率更高，其中10％～60％在新生儿期死亡，25％以上的患儿遗留永久的神经心理缺陷，如脑瘫、精神发育迟滞、学习困难和癫痫。而且，目前的治疗仅局限于支持疗法，而没有直接阻止脑损伤进程或促进损伤神经再生的措施。神经组织或细胞移植为恢复损伤的神经系统功能提供了有希望的新途径。在最开始的移植研究中，研究者多采用胎脑组织或细胞作为移植的供体，胎脑组织具有抗原性低和能够无氧代谢等特点，移植后易于存活，并能与宿主脑整合，可产生较好的治疗效果。但胎脑组织移植要求“点对点”移植，不同的移植部位需要来源于相对应部位的脑组织，否则就不能形成正常的纤维投射，————而且胎脑组织来源有限，还面临着医学伦理学的问题，临床应用受限，因此近年来人们致力于寻找其他的供体。癌细胞系和永生化的细胞系移植治疗缺血性脑损伤也取得了良好的疗效，但由于细胞类型单一而且存在致癌危险性也限制了它的使用；骨髓基质细胞出one marrowsromal cells，BMSCs）移植可明显改善脑损伤后的神经功能缺陷，由于其分化为神经细胞的比例低，其治疗机制认为主要与其分泌的多种细胞因子有关。BMSCS移植后能否分化为有功能的神经元，目前尚无定论，而且移植后会在脑内遗留许多非神经系统的细胞，作为移植的供体，其利弊还需进一步斟酌。神经干细胞（neural stem cells，NSCS）可在体外传代、长期培养、大量增殖，也可低温保存而维持其末分化、未成熟、多潜能的特性不变，经体外诱导可以分化为各种成熟的神经细胞表型，如神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞等；NSCS脑内移植后，不仅可以在脑内发育、分化、成熟形成有功能的神经元，而且还能长期存活，接受局部的信号分化为相应的神经元，与宿主脑建立起复杂的神经联系。至今为止，尚未见NSCS脑内移植形成肿瘤的报道。NSCS作为脑移植的供体，克服了上述供体细胞的局限性，不难看出，NSCS在脑损伤的治疗上具有广阔的应用前景。 目前，在使用 NSCS移植治疗缺血性脑损伤的动物实验和临床实验中，均己取得了一定的疗效，但是这些研究结果大多来自于成年动物和成年人，治疗新生动物模型少见。由于成年期动物宿主对移植物的反应与新生期动物是不同的，因此，NSCS移植对治疗 HIE是否有效尚需进一步研究。 1二一 本研究旨在观察NSCs移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（hypoxic－ische加c brain damage，HIBD）模型神经行为和脑组织病理学的影响，以期为NSCs移植治疗新生儿HIE提供实验与理论依据；同时对脂质体介导外源性基因导入NSCs的条件进行优化，为NSCs作为基因治疗载体提供实验依据。 研究包括以下三部分。一、大鼠胚胎神经于细胞的分离培养及鉴定 目的 建立胎鼠神经干细胞的分离、培养及分化鉴定技术；观察NSCs 的生长、增殖及分化的特点。方法 分离胎龄 14 d的Sprague－Dawlcy侣D）大鼠胚胎前脑皮质，经消化及机械吹打后采用无血清悬浮培养的方法获得细胞克隆。应用间接免疫荧光方法，鉴定NSCs和分化的神经细胞。结果 从SD大鼠胚胎前脑皮质分离的组织经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力。原代和传代细胞抗原nestin呈阳性。分化后的细胞可表达神经元和星形胶质细胞的特异性抗原NF七00和GFAP。结论 胎鼠NSCs具有自我更新和分化潜能，有很强的增殖能力，经体外培养能够分化成为神经元及星形胶质细胞。二、绿色荧光蛋白转染胚鼠神经干细胞 目的 探索脂质体介导目的基因转染NSCs的最佳条件，为NSCs移植研究提供追踪的方法，为NSCs作为基因治疗的载体提供实验依据。方法 分离培养胚胎大鼠NSCS，使用pEGFP（。作为报道基因，5脂质体Lipofectamne 2000一起转染NSCs，观察脂质体 ill 扛 一 转染后绿色荧光蛋白的表达的量效与时相关系；筛选稳定表达绿色荧 光蛋白（reen luorescent protein，GFP）的细胞克隆，观察其生长特 性：将筛选出的细胞克隆用立体定位仪植入新生＊D大鼠侧脑室内， 观察绿色荧光蛋白的表达。结果 使用脂质体Lipofectalnine 2000 介导绿色荧光蛋白质粒转染NSCs，转染时间在5～8小时左右，脂 质体（卜1）／＊＊A（卜9比值在1二与1：2之间，＊FP表达高峰在 转染48小时左右；转染GFP基因的NSCS的生长特性无明显改变， 诱导分化后仍然能有效表达GFP，移植到新生SD大鼠侧脑室后，在 体内也可有效表达GF
郑敏[10]2003年在《神经干细胞定向分化与移植治疗帕金森病的实验研究》文中研究指明研究背景与目的：神经干细胞(neural stem cell，NSC)的发现是神经生物学领域的最重要进展之一。NSC不仅对于中枢神经系统发育成熟后不可能再生的理论提出了挑战, 为研究神经发生、神经系统遗传病的发病机制提供了理想的载体，还为神经系统损伤修复和退行性病变的治疗带来了新的希望。NSC的培养扩增是研究的基础，本实验目的在于通过培养了解其生物学特性，为深入研究其体内外分化奠定基础。方法： 采用体外无血清培养和增殖刺激因子的作用，分离培养人和大鼠胎脑NSC。通过单细胞克隆实验和体外长期传代培养扩增和冻存复苏检测其自我更新能力、增殖能力和生物学特性稳定；免疫细胞化学检测NSC特征性标志nestin表达和分化为神经元和胶质细胞能力；BrdU掺入实验检测细胞增殖状态；通过克隆和细胞计数比较EGF、bFGF对鼠NSC增殖刺激作用，对LIF在人NSC培养中的作用进行探讨。结果：体外无血清选择性传代培养，获得的NSC能分化为神经细胞和神经胶质细胞，具有多向分化能力；有很强的自我更新能力，经体外20次传代培养后仍然具有克隆形成能力；NSC表达nestin，部分细胞处于增殖活跃期；NSC扩增迅速；传代培养的NSC性能稳定，经长期培养和冻存复苏后保持NSC特点；联合运用EGF、bFGF对NSC增殖作用较单用强；LIF对人NSC长期培养扩增有明显促进作用。结论：建立了体外培养人和大鼠NSC的方法，培养的NSC表达nestin，有自我更新、多向分化的特点，通过培养细胞大量扩增。EGF、FGF联合作用促进大鼠NSC增殖，LIF能促进人NSC培养扩增。
参考文献：
[1]. 端粒酶基因与大鼠胎儿神经干细胞永生化的研究[D]. 李勇. 西北农林科技大学. 2007
[2]. 神经干细胞体内移植和体外L1转染的研究[D]. 孟晋宏. 第四军医大学. 2000
[3]. 基于干细胞巢调控的人参皂苷对缺血/再灌注神经干细胞增殖、分化的作用及其机制[D]. 万凤. 北京中医药大学. 2017
[4]. TH基因修饰骨髓基质细胞源神经干细胞自体移植治疗恒河猴帕金森病模型[D]. 徐强. 第一军医大学. 2004
[5]. 神经干细胞体内外分化与体内移植延缓失神经肌肉萎缩的实验研究[D]. 沈云东. 复旦大学. 2007
[6]. A_2M FP_6 DNA片段转染神经干细胞移植治疗转基因AD小鼠的实验研究[D]. 武强. 第三军医大学. 2007
[7]. 神经干细胞生物学特性、神经干细胞移植治疗颅脑损伤后神经功能缺失及免疫基因治疗大鼠胶质瘤的研究[D]. 刘辉. 天津医科大学. 2002
[8]. 人参皂苷对神经干细胞的作用及HIF-1a-VEGF通路的调控机制[D]. 高健. 北京中医药大学. 2018
[9]. 神经干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤[D]. 王霞. 中南大学. 2003
[10]. 神经干细胞定向分化与移植治疗帕金森病的实验研究[D]. 郑敏. 重庆医科大学. 2003
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