1天津市第一中心医院，天津 300052；2天津医科大学口腔医院，天津 300052
目的：检测脂联素在糖尿病牙周炎昆明系小鼠牙周组织中表达的变化及对牙周组织病理形态及预后的影响，从而为临床糖尿病伴有牙周炎的患者治疗提供理论依据。方法：60只3周龄的昆明系小鼠按不同造模方式分为三组：对照组（20只），糖尿病组（20只），糖尿病+牙周炎组（20只），建立小鼠糖尿模型和小鼠牙周炎模型。分别通过与ELSA法、RT-PCR、western lot检测三个实验组小鼠的牙周组织脂联素基因和蛋白的表达变化的含量。结果：造模后20天，糖尿病组及小鼠血糖、空腹胰岛素水平（Fins）及胰岛素抵抗指数始终大于正常值，与空白对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。造模一个月、三个月、半年后，脂联素基因及蛋白在健康组小鼠牙周组织中表达水平最强 , 在2 型糖尿病组 、2 型糖尿病伴牙周炎组小鼠牙周组织中表达水平依次减弱; 组间比较均有差异 ,存在统计学意义 (P<0.05)。结论：表明糖尿病后牙周组织脂联素表达降低是牙周炎发病及加重的重要因素之一，为临床治疗和预防牙周炎提供理论依据。
关键词：脂联素；昆明系小鼠；牙周炎；2 型糖尿病；牙周组织
【中图分类号】R94【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)09-0021-01
大量流行病学研究证实牙周炎与肥胖有关系，纵向临床研究也表明牙周炎的发展与体重指数的增加有关，并且使糖尿病患者糖化血红蛋白的控制不佳[1-3]。在牙周炎，肥胖和T2DM之间，慢性炎症状态成为了其共同的病理机制之一。脂联素均与牙周炎和2型糖尿病有密切关系。我们采用建立糖尿病小鼠牙周炎动物模型的方法，研究脂联素的变化牙周炎对机体炎症状态的影响，以及这种影响是否与机体的胰岛素有关，从而揭示牙周炎与T2DM病变发生发展的关系，为临床治疗和预防提供理论依据。
实验方法：
1.1实验动物及主要药物和试剂
1.1.1实验动物
选用体重为20.1+0.86的8周龄雄性昆明系小鼠60只。标准颗粒饲料喂养，自然昼夜光线照明，室内相对湿度40%-70％，室温保持于20-25℃。实验期间动物自由饮水、进食。
1.1.2主要药物和试剂
Trizol；rTaqDNA聚合酶、dNTP Mixture；逆转录系统。苏木素-伊红CD3:一抗：兔抗小鼠CD3；二抗：山羊抗兔IgG SABC- FITC二抗检测试剂盒。10％水合氯醛TLR3:一抗：兔抗鼠TLR3单克隆抗体；二乙胺四乙酸二钠(EDTA)。
1.2实验方
1．2.1实验动物造模及分组
选用体重为20.1+0.86的8周龄雄性昆明系小鼠60只(。标准颗粒饲料喂养，自然昼夜光线照明，室内相对湿度40%-70％，室温保持于20-25℃。实验期间动物自由饮水、进食。按不同造模方式分为三组：对照组（20只），糖尿病组（20只），糖尿病+牙周炎组（20只）。四氧嘧啶（Alloxan）注射法建立小鼠糖尿病模型，具体步骤：四氧嘧啶以55 mg·kg-1×3d 分次尾静脉注射造成小鼠糖尿病模型。分别于给药24h、72h和10天、20天、30天测定尾静脉血糖，以两次血糖值均大于16 mmol/L为标准诊断小鼠糖尿病，本实验40只小鼠两次血糖值均高于此诊断标准，糖尿病小鼠模型造模成功。牙周局部结扎联合涂菌建立小鼠牙周炎模型，具体步骤：腹腔注射10%水合氯（300-350mg/kg）醛麻醉, 取仰 卧位,小鼠四肢与头固定于手术架, 将小鼠舌牵出丝线捆绑固矩,以防止窒息。将3.0丝线分别结扎于左、右上颂第一磨牙及第二磨牙牙颈部并尽 量置于牙龈沟内，将浓度为109 CFU/ml的4种标准菌混合悬液接种于牙龈沟内, 每周检查丝线一次, 有脱落者及时重新结扎。建模时间为8周。
1.2.2 血清中脂联素的检测
分别在造模成功后一个月、三个月、半年，随机处死三个实验组小鼠（各5只）处死前经心脏取血。具体步骤如下：(1)称重，10%水合氯（300-350mg/kg）醛麻醉,诱导小鼠全麻；(2) 小鼠仰卧位固定，用手指触摸心脏搏动明显的位置，用拇指、食指、中指将心脏固定；(3)右手持注射器，平行于胸腔的方向进针，针头向前下穿刺，边进针边轻微回抽，有血液回抽到注射器时，保持针头的位置，采集足够的血液(约3m1)，放入无菌离心管中，每个离心管编号，与小鼠相对应。(4)收集的血液室温下静置30min，20000rpm离心10min，取上清于EP管中，置于．80℃保存备用。用ELISA方法检测血清中脂联素的水平：按试剂盒说明书操作
1.2.3 组织学切片制备及HE染色
将处死的小鼠头部软组织和骨组织分离，取小鼠右下颌骨固定于中性福尔马林48小时，15%EDTA(乙二胺四乙酸二钠)中性福尔马林溶液脱钙4周（每4天换一次脱钙液），常规脱水，石蜡包埋，沿第一磨牙近远中矢状面切成5 μm厚切片，每个样本取牙周结构完整切片进行HE染色，光镜观察。
1.3.统计学分析
数据以均数士标准差(`c 士s)表示, 由第一作者采用SPSS 15.0统计软件进行完全随机设计的方差分析。两组之间的两样本比较用q检验(即 Newman-kueuls法),检验水平为双侧α＝0.05。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠糖尿病造模后血糖检测
检测小鼠注射四氧嘧啶后，不同时间段的血糖变化，并与空白对照组对比；结果显示，给药24h后，小鼠血糖水平已高于正常值（6.7mmol/L）；给药后10d，血糖仍维持在较高水平，与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），结果见表1。
2.3 牙周组织总RNA的鉴定和定量
通过Trizol一步法提取牙周组织总总RNA，分光光度计测定的A260/ A280在1.7～2.0之间， OD260/OD230也在1.5-1.9之间，证明所得RNA纯度较高，基本去除了蛋白质等的污染，可用于PCR的扩增。经1%甲醛变性的琼脂糖凝胶电泳结果可见28S及18SrRNA条带清晰可见，5SrRNA条带模糊，同时28S：18S=2：1，表明总RNA的完整性好，基本无降解（如图1）
2.4各组小鼠不同时间牙周组织APN 蛋白的表达
Western-Blot结果可见造模一个月、三个月、半年后，APN蛋白 在健康组小鼠牙周组织中表达水平最强 , 在2 型糖尿病组 、2 型糖尿病伴牙周炎组小鼠牙周组织中表达水平依次减弱; 组间比较均有差异 ,存在统计学意义 (P<0.05)。（如图2）。
3讨论
牙周炎是和龋病并列的两大口腔疾病之一, 其危害在于造成牙体的松动脱落, 和破坏咀嚼器官的完整性, 引起面部形象合发音、功能的变化[4-5]。糖尿病可以加重牙周炎和牙周组织破坏, 在糖尿病条件下的牙周炎骨丧失显著增加[6]。糖尿病有可能通过促进在炎症部位破骨细胞而生成, 从而增强骨吸收, 促进了牙周炎骨丧失。同时糖尿病也被证实为牙周疾病的独立的危险因素，存在的微循环障碍可以使组织局部缺氧缺血、其牙周组织修复能力降低、也为细菌繁殖加速从而引发以及加重牙周炎症。糖尿病治疗的及时,血糖控制的良好, 牙周炎即可随之减轻。反之,会伴发重度牙周炎和难治性牙周炎。并且,牙周炎的发生往往更会进一步加重糖尿病得病情。牙周状况控制好的话则血糖控制相对比较良好, 糖尿病病情久比较稳定。反之, 则难以有效的降低血糖, 容易使病情恶化, 严重的还会引起各种并发症, 从而成为不可逆性的改变, 严重的会导致病人病残或死亡。
参考文献：
[1]黄宇虹,高秀梅,张伯礼.脂联素的研究进展[J].中国临床药理学与治疗学,2004,9(9):961-965.
[2]吕莉,冯凭.不同血糖水平人群血清脂联素水平与胰岛素抵抗的关系[J].现代诊断与治疗,2008,19(1):9-11.
[3]陈幼萍,舒毅,曾春平,潘苗,罗少荘.罗格列酮对2型糖尿病患者高血糖应激状态脂联素的影响[J].中国药师,2010,13(12):1722-1724.
[4]郭伟,张木勋.内质网应激与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病[J].医师进修杂志,2005,28(11):56-58.
[5]曲建昌,窦京涛.瘦素与肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病[J].药品评价,2011,8(1):33-36.
论文作者:赵博1，王永兰2
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年9月
论文发表时间:2016/10/28
标签：小鼠论文; 牙周炎论文; 糖尿病论文; 组织论文; 血糖论文; 水平论文; 昆明论文; 《中国医院药学杂志》2016年9月论文;