王峰[1]2002年在《旋毛虫5日龄成虫期特异性基因的克隆与表达》文中研究指明旋毛虫病是一种严重的人兽共患病，可感染人及150多种动物，呈世界性分布。近年来在我国17个省、市、自治区发现有多起人体感染的暴发流行。河南省为我国旋毛虫病高发区之一，仅郑州市已发生7次暴发流行，发病400多人。若不及时诊断和治疗，患者死亡率可高达3％～30％。因而旋毛虫成为我国肉食品卫生检验中的首检寄生虫，开展旋毛虫病的预防和控制工作在我国更具紧迫性和重要性，而预防和控制旋毛虫病的关键在于建立一套快速、简便、特异性高的检测手段以及采取各种有效预防措施降低动物感染率。 目前对旋毛虫病尚无满意的诊断方法，病原学检查检出率低且不易为患者接受。国内外学者对旋毛虫病的免疫学诊断进行了大量的研究，但所用的诊断抗原多为旋毛虫肌幼虫虫体粗抗原，由于抗原成分复杂，用于本病的免疫学诊断时常与其它寄生虫病发生交叉反应而出现假阳性。 对旋毛虫病的免疫预防的研究表明，由于旋毛虫在不同的发育期虫体抗原组分存在明显的差异且同一期虫体抗原结构也极其复杂，且在其长期的寄生生活中，逐渐形成了免疫逃避机制，目前采用成份复杂的虫体抗原往往难以取得理想的免疫预防效果且极不稳定，而且旋毛虫的体外培养仍未取得突破，这都为大规模采用常规免疫方法防治带来了困难。 随着分子生物学技术的发展，使得旋毛虫抗原的体外表达成为可能。与常规抗原相比，基因工程抗原具有纯度高、成分单一、易于大规模生产等优势，为旋毛虫病的免疫诊断和免疫预防提供了新的手段。旋毛虫病的有效诊断和预防的关键为特异性高、保护性强抗原基因的获得，其重要的有效途径之一为构郑州大学川们年硕士论文 旋毛虫5 日龄成虫期特异性基因的分子克隆与表达一建CDNA文库，从中筛选理想的抗原基因。目前利用基因工程方法对旋毛虫的大部分研究主要集中在肌幼虫抗原，由于肌幼虫期是旋毛虫在宿主体内产生免疫逃避最长的时期，形成囊包后可长期寄生于宿主体内，其生命活动处于相对休眠状态，基本不需要表达蛋白，因而其mRNA含量低，所建的文库有效重组子较少，难以筛选到目的基因。据报道，从旋毛虫肌幼虫 C DNA文库中筛选到的克隆编码蛋白抗原的效果并不理想，而成虫期和新生幼虫期是旋毛虫的两个侵袭期，特别是5日龄成虫u L 在其生活史中是旋毛虫的一个特殊时期，在雌性成虫的子宫内含有大量幼虫胚胎，并有少量幼虫排出体外。此期虫体代谢极度旺盛，需要在短时间内合成大量期特异性蛋白，而且其分泌的侵袭因于很可能为ADS与肌幼虫相比所特有的致病因子和强保护性抗原，对宿主免疫作用极为敏感。因此，可以通过构建高质量的 ADS CDNA文库来筛选出其差异性表达北期特异性）的功能性抗原基因，利用基因工程技术将其克隆入载体，并大量表达出有效的单一纯化抗原，对于旋毛虫病的免疫诊断和预防具有重要意义。 材料与方法 本实验在己构建好的ADS差减文库的基础上，应用放射性同位素Q／中标记ADS差减文库CDNA片段T671进行SOLlthCC杂交、探针鉴定，利用地高辛标记此期特异性片段，采用两步噬菌斑原位杂交从 ADS CDNA文库中调取其全长CDNA，登陆国际NCBI数据库进行同源性检索及编码蛋白相似性比较。登陆 InterProscan进行氨基酸序列分析。利用信号肽序列分析软件mignal vZ刀）分析预测 XZI编码蛋白的信号肽区域。应用蛋白序列分析软件包 ANTHEPROT4．3分析用1编码蛋白的组成并对其二级结构。亲水性、抗原性及等电点进行预测。根据测序及对 XZI编码蛋白分析结果，考虑到信号肽序列可能对基因的原核表达有影响，利用 ECORI在全长序列的 170 hp处将基因信号肽序列切去。根据未切信号肽序列与去信号肽序列的读码框架，同时分别克隆入表达载体PET28P，构建其原核表达载体PET28K比x、PET28－XZlex。将重组质粒克隆人大肠杆菌DHSA，筛选出阳性克隆，对阳性克隆经酶切鉴定、测序鉴定。经 2郑州大学川0丰硕士论文 旋毛虫5日龄成虫期特异性基因的分子克隆与在这一鉴定构建正确的重组表达载体转化大肠杆菌DE。，对阳性克隆进一步筛选、鉴定并传代培养纯化。将所得工程菌通过IPTG刺激培养，取不同时间培养物裂解液进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酚胺凝胶电泳 旧DS－M＊E）分析，染色后进行薄层凝胶光密度扫描测定目的蛋白表达量。同时对表达产物进行了Western－blot检测。 结果 1．应用放射性同位素标记进行southern杂交、探针鉴定，结果显示ADS差减文库CDNA片段T671仅与ADS CDNA文库杂交，表明T671为ADS期特异性CDNA探针。 人利用地高辛标记T671期特异性片段，采用两步噬菌斑原位杂交法对ADSCDNA文库筛选，结果获得一 1132hp全长 CDNA）宇列（X21），其中包含 1030hP的开放阅读框架。 3．NCBI基因数据库同源性检索未见相似序列，NCBI蛋白数据库相似性比较表明该基因编码蛋白与表皮胶原蛋白相似性较高卜物％。 4．InterProscan分析显示：氨基酸序列
王峰, 杨继要, 武峰, 付宝权, 刘明远[2]2003年在《旋毛虫5日龄成虫期特异性基因的筛选与序列分析》文中研究指明目的 获得旋毛虫 5日龄成虫期特异性基因序列。方法 应用旋毛虫 5日龄成虫期待异性探针对 5日龄成虫cDNA文库进行杂交筛选、克隆测序及核苷酸序列数据库 (GenBank)查寻比较 ,登陆InterProScan进行基因、氨基酸序列分析。结果 利用消减杂交 (subtractedhybridization)获得的旋毛虫 5日龄成虫期特异性探针筛选 5日龄成虫cDNA文库 ,获得一个长 1 1 32bp的基因。其开放阅读框架由 1 0 30个核苷酸组成 ,编码 343个氨基酸。序列分析表明 ,该序列是一个尚未见报道的旋毛虫基因序列 ,在序列 1 1 7～ 1 2 0位氨基酸为氨基葡聚糖 (GAG)结合位点 ,在 2 7～ 86 ,1 5 3～ 32 8位氨基酸处存在Gly -X -Y胶原蛋白重复序列 ,分别编码两个胶原蛋白多肽。结论 获得旋毛虫 5日龄成虫期特异性基因 ,其编码产物为表皮胶原蛋白
付宝权, 王峰, 吴秀萍, 牛廷献, 卢强[3]2003年在《旋毛虫5日龄成虫期特异性基因全长cDNA的克隆与序列分析》文中认为目的获取编码旋毛虫5日龄成虫(5 day-old adult wrom,AD5)期特异性基因完整开放阅读框架(open reading frame,ORF)cDNA分子。方法利用地高辛标记的AD5期特异性cDNA片段T671作为探针对AD5 cDNA文库进行核酸杂交筛选,将筛选出的阳性克隆进行测序,利用分子生物学软件进行分析。结果获得1个全长1132bp的cDNA分子,该cDNA含有1个1032 bp完整的ORF,该ORF编码1个343个氨基酸残基组成的多肽,其分子量理论推导值为35.1kDa,等电点(isoelectric point,IP)为4.8.InterProScan
付宝权, 王峰, 吴秀萍, 牛廷献, 卢强[4]2003年在《旋毛虫成虫期特异性基因全长cDNA的克隆与序列分析》文中研究说明目的 获取编码旋毛虫5日龄成虫(AD5)期特异性基因完整开放阅读框架(open reading frame,ORF)cD-NA分子。方法 利用地高辛标记的AD5期特异性cDNA片段T671作为探针对AD5 cDNA文库进行核酸杂交筛选,将筛选出的阳性克隆进行测序,利用分子生物学软件进行分析。结果 获得1个全长1132bp的cDNA分子,该cD-NA含有1个1032bp完整的ORF,该ORF编码1个343个氨基酸残基组成的多肽,其分子量理论推导值为35.1kDa,等电点(isoelectric point,IP)为4.8。InterProScan分析显示117～120氨基酸残基(SGYG)为粘多糖结合位点,27～86氨基酸残基为一线虫表皮胶原蛋白N-末端区结构域,153～328氨基酸残基为胶原蛋白螺旋叁联体重复区(G-x-y)结构域。Signal PV2.0分析显示,在1～43氨基酸区域为信号肽。Blastn同源性分析表明,与其它已知生物基因序列无明显的同源性,为一新的cDNA分子。但与表皮胶原蛋白同源性较高,大于40％。结论 筛选获得一个新的编码AD5期特异性基因的完整ORF的cDNA分子。
李丽娜[5]2013年在《旋毛虫成虫cDNA文库构建及特异性基因PCNA的克隆、表达及功能鉴定》文中研究表明旋毛虫病（trichinellosis trichinosis）的病原体是旋毛形线虫（Trichinellq spiralis）简称旋毛虫，寄生于猪、野猪、鼠、熊等150种动物和人体内，成虫和幼虫分别寄生于同一宿主的小肠内。旋毛虫病是因为生食或半生食含有旋毛虫幼虫囊包的猪肉和其他动物肉类而感染，本病是世界上较常见的人兽共患病。不仅严重危害人类健康，而且对养猪业可造成巨大损失。近年来在我国17个省、市、自治区发现有多起人体感染的暴发流行。河南省为我国旋毛虫病高发区之一，仅郑州市已发生7次暴发流行，发病400多人。若不及时诊断和治疗，患者死亡率可高达3%一30%。因而旋毛虫成为我国肉食品卫生检验中的首检寄生虫，开展旋毛虫病的预防和控制工作在我国更具紧迫性和重要性，而预防和控制旋毛虫病的关键在于建立一套快速、简便、特异性高的检测手段以及采取各种有效预防措施降低动物感染率。对旋毛虫病的免疫预防的研究表明，由于旋毛虫在不同的发育期虫体抗原组分存在明显的差异并且在同一期虫体抗原结构也极其复杂，在长期寄生生活中，逐渐形成了免疫逃避机制，所以目前采用成份复杂的虫体抗原往往难以取得理想的免疫预防效果。旋毛虫抗原具有其特异性，成分极其复杂，并且不能在体外进行培养和繁殖，而且其临床表现较为复杂，因此给旋毛虫病免疫诊断及预防带来困难，故寻找旋毛虫特异性抗原基因就成为我们工作的重点。而构建cDNA文库，采用免疫学方法钓取cDNA片段，从而分析抗原蛋白的抗原表位，选取最佳抗原，是研究旋毛虫抗体的有效途径之一。目的：收集纯净的5日龄旋毛虫成虫，建立旋毛虫成虫cDNA文库并对旋毛虫增殖细胞核抗原PCNA基因进行克隆和测序，测序结果与GenBank中的PCNA基因序列比较。构建旋毛虫增殖细胞核抗原基因原核表达载体，用IPTG的方法诱导其表达目的蛋白，并用Westen鉴定其功能。方法：收集纯净的旋毛虫5日龄成虫，提取旋毛虫成虫的RNA，进一步建库。根据GenBank中登录的PCNA基因的序列设计引物，用PCR的方法从旋毛虫成虫基因库筛选这一基因，得到的PCR产物与pUM-T载体连接，转化到感受态细胞DH5a进行测序和同源性比较。分别抽提表达载体PET32a及目的基因的质粒，通过BamHI和HindIII双酶切并做产物回收的方法得到具有酶切位点的表达载体，从而连接目的基因及表达载体，构建表达重组体，将构建好的表达性重组体转化入感受态BL21。通过IPTG诱导表达出目的蛋白，经Westen鉴定此蛋白的功能。结果：1提取旋毛虫成虫RNA：在胶上可以清晰的看到28S,18S,5S叁条条带，条带亮度较好，无明显降解现象，说明RNA的完整性较好，可进行cDNA的合成，可用于文库构建。凝胶电泳图片发现，旋毛虫的18S rRNA条带亮度明显高于28S rRNA条带亮度，约为2倍，经多次重复，结果一致。2构建旋毛虫成虫cDNA文库：经过两次杂交和两次PCR，把所得到的cDNA文库进行电泳检测分析。3扩增出PCNA基因：以构建的旋毛虫cDNA文库为模版，用PCR的方法扩增出PCNA基因，其大小约为804bp。克隆基因与GenBank登录的增殖细胞核抗原的基因同源性为94%。4表达载体的构建：抽提表达载体pET32a的质粒，用BamHI和HindIII对表达载体pET32a进行酶切并做产物回收，得到了表达载体构建。5pET32a-PCNA重组表达质粒的鉴定：用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒后得到2500bp和804bp左右两条片段，与预期结果相符，表明pET32a-PCNA原核表达载体构建成功。6重组表达质粒pET32a-PCNA的表达：表达产物进行SDS-PAGE后，在30kD位置处可见明显的蛋白质条带。7Western blot做功能鉴定：用感染了旋毛虫的小鼠血清做一抗，得到明显的条带，从而鉴定了PCNA的抗原性。结论：1构建了云南株旋毛虫成虫cDNA文库；克隆了PCNA基因。2构建了云南株旋毛虫增殖细胞核抗原基因的原核表达载体。3表达了PCNA蛋白。4用Western的方法验证了增殖细胞核抗原的抗原性。
孙磊[6]2007年在《旋毛虫期特异性基因转录及表达特性研究》文中认为由于旋毛虫存在叁个不同的发育时期,而各个发育时期具有不同的抗原表达,因此研究旋毛虫期特异性基因有助于探明旋毛虫侵袭、致病机理以及包囊形成的分子机制。我们利用分子生物学和免疫学方法对本室业已发现的2条新生幼虫期特异性(即旋毛虫包囊形成时期)基因——II型脱氧核糖核酸酶基因T314和丝氨酸蛋白酶基因T668进行了转录及表达特性研究,并探讨了其参与旋毛虫寄生及包囊形成过程中的可能机制。根据T314和T668 cDNA序列设计特异引物,从感染旋毛虫的小鼠骨骼肌中提取总RNA,应用RT-PCR技术分别反转录出T314和T668 cDNA,在分子水平上对这2个基因的转录时空进行了鉴定。结果显示:T314、T668基因均从新生幼虫出生即开始转录,随着日龄的增加mRNA的量逐渐减少,T314 mRNA在感染后第20天仍能检测到,而T668 mRNA于感染后11-14天转录趋于停止。分别利用本室制备的兔抗T314和T668重组蛋白抗体,采用免疫组化技术,观察T314和T668基因编码蛋白的组织学定位。结果表明:T314、T668蛋白在新生幼虫感染后第1天均有表达,T314蛋白分布于虫体表皮,而T668蛋白分布于虫体的杆状体区域;T314蛋白在感染后7-20天分泌到虫体外的保姆细胞细胞质上,而T668蛋白则在感染后6-13天分泌到虫体外肿大的肌细胞核上。该结果预示着:T314蛋白(即DNase II)可能与旋毛虫寄生所需要厌氧环境的形成有关,可能的机制为DNase II降解线粒体DNA,使包囊内的有氧代谢转变为无氧代谢;而T668蛋白(即丝氨酸蛋白酶)可能参与包囊的形成,其可能的机制是作为转录因子调控肿大的肌细胞核大量表达胶原蛋白从而形成包囊。从pMD-18T-T314重组质粒中扩增T314目的片段,重组到PCR II载体中。利用SP6和T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA。通过浸泡将siRNA导入新生幼虫体内进行T314基因沉默,发现T314基因沉默后虫体总数减少,形成的包囊大部分空泡化,初步验证T314基因可能与旋毛虫包囊形成无关。
参考文献：
[1]. 旋毛虫5日龄成虫期特异性基因的克隆与表达[D]. 王峰. 郑州大学. 2002
[2]. 旋毛虫5日龄成虫期特异性基因的筛选与序列分析[J]. 王峰, 杨继要, 武峰, 付宝权, 刘明远. 河南预防医学杂志. 2003
[3]. 旋毛虫5日龄成虫期特异性基因全长cDNA的克隆与序列分析[C]. 付宝权, 王峰, 吴秀萍, 牛廷献, 卢强. 中国动物学会全国第九次寄生虫学学术讨论会论文摘要集. 2003
[4]. 旋毛虫成虫期特异性基因全长cDNA的克隆与序列分析[J]. 付宝权, 王峰, 吴秀萍, 牛廷献, 卢强. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2003
[5]. 旋毛虫成虫cDNA文库构建及特异性基因PCNA的克隆、表达及功能鉴定[D]. 李丽娜. 承德医学院. 2013
[6]. 旋毛虫期特异性基因转录及表达特性研究[D]. 孙磊. 吉林大学. 2007
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