王健 张晓雨 王明考 朱晋国
【摘 要】 目的 研究miR-145对结肠癌细胞株SW480侵袭能力以及对FSCN1表达的影响，探讨其在结肠癌侵袭转移中的机制。 材料与方法 本实验采用化学方法合成成熟的miR-145寡核苷酸模拟物（mimics），以lipofectamine 2000瞬时转染结肠癌细胞系SW480；转染后48小时，采用实时聚合酶反应（Real-time PCR）检测转染后各组miR-145的表达；转染后24小时，使用预铺基质胶的Transwell模型检测细胞侵袭能力；转染后72小时，通过蛋白免疫印记（Western Blot）检测FSCN1蛋白表达。 结果 与对照组比较，miR-145模拟物（miR-145 mimics）组细胞miR-145表达明显升高（P<0.05）；穿过Transwell小室聚碳酯膜细胞数较对照组明显下降（P<0.05），蛋白印记（Western Blot）显示FSCN1表达明显下降（P<0.05）。结论 1、miR-145可降低结肠癌细胞株SW480的侵袭能力；FSCN1为miR-145的靶基因，miR-145可能通过对其负调控进而抑制肿瘤细胞侵袭，证明其可能在细胞侵袭过程中起到重要作用。
【关键词】 microRNA-145； 结肠癌； 侵袭性； 肿瘤转移
Effect of miR-145 on invasion ability of Colonic Cancer cell line SW480. Wang jian Zhang xiao-yu Wang ming-kao Zhu jin-guo
【Abstract】 Objective To investigate the effect of miR-145 on invasion ability of colorectal cancer cell line SW480 and regulation to FSCN1 , meanwhile to study the mechanism.Material & Methods Colonic cancer cell line SW480 was transient transfected with chemically synthesized mature miR-145 mimic oligonucleotides by lipofecatamine 2000 .At 48h after transfection , the expression of miRNA-145 was identified by Real-time polymerase chain reaction (PCR) . At 24h after transfection , the pre-coated matrigel model was used for the invasion assay .At 72h after transfection , targeting protein expression was evaluated by Western Blot,.Results After transfection of miR-145 mimics ,as compared with control group, the miR-145
was increased significantly in miR-145 mimics group, meanwhile the protein expression of FSCN1 was down-regulated (P<0.05),and the invasion ability was down-regulated significantly(P<0.05).Conclusion One: miR-145 suppress invasion ability of colonic cancer cell line SW480; Two: Evaluated as a target gene of miR-145, FSCN1 is negative regulated by miR-145 to suppress invasion ability of tuomor cells ,and may play an important role in metastatic process of tumor cells.
【Key words】 microRNA-145; Colonic cancer; Invasion; neoplasm metastasis
微小RNA(miRNA)是近年来新发现的一类内源性非编码小分子RNA，长约22nt，其序列在物种间具有高度保守性。微小RNA通过与靶基因的3’非翻译区（3’UTR）上的靶序列结合抑制靶mRNA的翻译或者降解靶mRNA，发挥其基因沉默效应。微小RNA基因往往位于内含子中，转录后（原始miRNA）首先在细胞核内被加工成70nt左右的微小RNA前体（pre-miRNA），转运到胞浆后再经Dicer 酶切割成约22nt 的成熟miRNA[1]。miRNA已被证明在肿瘤的发生发展中发挥了重要作用。结肠癌为世界范围内第二常见造成死亡的肿瘤。50%诊断结肠癌患者将会死于远处转移的并发症。目前关于结肠癌转移相关微小RNA研究尚少。本实验旨在研究miR-145对结肠癌细胞系SW480侵袭能力的影响，并进一步探讨其中可能的分子机制。
材料与方法：
1．材料
细胞株及主要试剂：结肠癌SW480细胞（中科院上海细胞库）；mi-RNA145模拟物序列（5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’，3’- GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU -5’），阴性序列（5’- CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’，3’- CAGUAACUGUACGUAUCGAGCA -5’）；miR-145 qPCR Quantitation Kit、U6 snRNA qRNA qPCR Normalization Kit均由上海吉玛公司合成；Lipofectamine2000(美国invitrogen公司)；胎牛血清及IMEM培养液（Hyclone）；FSCN1鼠抗人单克隆抗体(美国abcam)、GAPDH鼠抗人单克隆抗体(中国博士通公司)、辣根酶标记羊抗鼠IgG(二抗)(美国Jackson)；总蛋白提取试剂盒(碧云天公司)、总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)、逆转录试剂盒及Marker(美国Invitrogen公司)；PCR引物设计及合成(上海吉玛公司)。
2．细胞培养与转染：采用IMDM培养加10%胎牛血清37°C，5%CO2温箱培养细胞。转染时将2*10?5个SW480细胞接种在6孔板内，待50%-80%细胞汇合时进行转染。采用Lipofectamin2000转染，方法参照说明书。实验分3组：SW480细胞转染mimics组（miR-145mimics转染组）、SW480转染无意义序列组（阴性对照组）、SW480组（空白对照组）。
3．Real-time PCR检测转染后miR-145的表达：转染后48 h，提取细胞总RNA，逆转录为cDNA。分别用miR-145和U6引物于荧光定量PCR仪(Lightcycler480)进行Real-time PCR扩增，以U6作参照。扩增体系20ul：2×Real-time PCR Buffer 10ul， miRNA specific Primer 0.4ul，cDNA 2ul；Taq DNA polymerase（5U/L）0.2ul；ddH20 7.4ul。反应条件：1步：95℃预变性3 min(cycle，1)，2步：92℃12 s，60℃60 s(cycle，40)，3步：60-92℃，0.2℃?2 s-l(cycle，1)。Real-time PCR结果判定：△Ct=CT目的基因-CT内参(U6)，△△CT=△CT治疗组一△CT对照组，RQ(Relative Quantitation)治疗组=2-△△CT，RQ对照组=1。
4．Western-blot法检测蛋白表达：转染48h后提取总蛋白，SDS/PAGE电泳，冰浴下80V转膜60min。室温封闭2h，一抗（FSCN1及GAPDH均为1:1000稀释），二抗（辣根过氧化物酶标记IgG抗体均为1:10000）稀释，室温孵育1-2小时。按照碧云天公司公司的ECL试剂盒说明书进行检测。
5．细胞侵袭实验：将Matrigel原液于冰箱内4℃冰浴过夜融化，用融化的Matrigel原液和预冷无血清DMEM培养液配制Transwell chamber上室凝胶液(0.8μg/μL) ，以每孔100μL包被transwell上室，37℃放置4h使其成胶。转染步骤相同，同样每个细胞系都分为mimics转染组和阴性对照组、空白对照组。转染24h后，每个处理组细胞消化重悬调整细胞浓度至10^6个细胞/mL，每孔transwell上室加入200μL细胞悬液，下室加入600μL条件培养基（含有20%FBS），置于37℃、5%CO2培养箱培养。每个处理组设3个复孔。 培养48h后从双室培养板中取出transwell小室，吸弃小室内的液体，用棉签檫净基底膜胶，PBS漂洗后立即使用4%多聚甲醛固定15min；PBS漂洗2次，每次2min；1×Giemsa染色30min，ddH2O漂洗数秒钟，200倍镜下观察并拍照，选取上中下3个视野计数，取均数作为透膜细胞数。
6．统计学方法
数据以均数±标准差表示（X±S），采用SPSS 13.0统计软件对数据进行单因素方差分析，两两比较采用LSD法，以P<0.05认为差异有统计学意义。
结 果
1．miR-145转染表达对SW480侵袭转移能力的影响
1.1 实时荧光定量PCR检测miR-145 水平的表达
Real-time PCR检测miRNA-145的表达：寡核苷酸转48小时后miR-145的△Ct值分别为：模拟物组10.42±0.68，阴性对照组15.67±0.74，空白对照组15.35±0.69，经分析miR-145模拟物转染组与阴性对照组及空白脂质体组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）,阴性对照与空白脂质体之间无统计学意义（P=0.951）。
1.2 Transwell基质胶侵袭实验检测转染24小时后细胞侵袭能力
各组显微镜下细胞数（Fig1）分别为25.33±2.08（mimics组），68.00±3.32（阴性对照组），66.67±3.51（空白脂质体组）。转染模拟物组较阴性对照组及空白对照组细胞数量明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），表明上调miRNA-145后细胞侵袭能力显著下降。
2．探讨miR-145 mimics 转染后对FSCN1表达的影响
2.1 Western Blot检测miR-145 mimics转染后FSCN1蛋白水平的表达
寡核苷酸转染72 h后检测FSCN1蛋白水平表达（Fig 2），阴性对照组FSCN1蛋白灰度值为空白对照组的（98.10±6.80）%，差异无统计学意义，miR-145 模拟物转染组FSCN1蛋白灰度值为空白对照组（60.27±5.60）%，表明miR-145模拟物转染后FSCN1蛋白水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05)）。
讨 论
正常情况下，miR-145在多种组织中广泛表达[2-3]。而在肿瘤组织中的低表达，提示其可能是抑癌因子[4]，多项研究也证实其在抑制肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。研究发现，microRNA在肿瘤转移侵袭过程中亦发挥重要作用[5]。本实验中转染miR-145 mimics 增强其表达后，细胞的侵袭能力较阴性对照、空白对照组明显下降，表明其与肿瘤侵袭呈负相关，表达降低可增强肿瘤细胞侵袭能力，促进肿瘤转移。
Sachdeva等[6]研究发现miR-145对肿瘤生长抑制作用具有细胞特异性，对具有转移能力的乳腺癌细胞，其生长抑制作用明显减弱，但可以显著抑制此类细胞的转移侵袭，荧光素酶报告实验显示miR-145可以靶向调节肿瘤转移基因Mucl，通过沉默Muc1表达发挥其抑制肿瘤转移的作用。另外，G ?tte等[7]报道miR-145还可以通过靶向细胞黏附分子JAM—A和FSCN1（肌动蛋白交联蛋白FSCN1），影响细胞骨架重新排列和细胞核旋转，从而调节乳腺癌细胞的运动。T Chiyomaru等[8]报道在膀胱癌中miR-133a、miR-145作为抑癌基因并可直接调控FSCN1，从而调节膀胱癌细胞的生长、增殖、侵袭能力，并且FSCN1的表达与肿瘤侵袭、浸润能力成正相关。Masayuki[9]等报道在食管鳞状细胞癌中miR-145、miR-133a、miR-133b起到抑癌基因作用并可共同对FSCN1进行调节，进而对细胞增殖、细胞浸润产生作用，并认为FSCN1与食管癌发生密切相关。
研究证明FSCN1蛋白在正常结肠上皮细胞不表达，而在结、直肠腺癌中上调。将FSCN1基因转染至分化程度高且FSCN1基因低表达的结肠癌细胞系swl222中，结果伴随着FSCN1基因表达的增加，同时还会出现细胞膜表面突起增多，细胞分化程度降低、细胞增殖旺盛、肌动蛋白骨架重建、细胞运动性增强和在三维基质中细胞侵袭能力增加2～5倍等系列改变，提示FSCN1可能通过参与细胞突起形成来促进结肠癌细胞的侵袭及转移[10]。本次实验中转染miR-145 mimics组FSCN1蛋白水平较阴性对照、空白对照组明显下降，同组细胞的侵袭能力亦有明显下降，表明miR-145可能通过对FSCN1的表达调控从而对肿瘤侵袭力能力产生影响。
本研究结果表明，转染 miR-145 mimics 后，上调了结肠癌细胞系SW480 miR-145 的表达，miR-145可能通过调节FSCN1使得肿瘤细胞侵袭能力下降，进而抑制肿瘤转移。本次系列实验发现的miR-145的靶标FSCN1，可能在肿瘤细胞侵袭中起到了重要作用，为揭示结肠癌发生发展中的网络调控机制又给出了新的线索，并为临床治疗结肠癌侵袭转移提供了新的方法和靶点，具有一定运用价值。
参考文献
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论文作者:王健,张晓雨,王明考,朱晋国
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期
论文发表时间:2016/7/18
标签：转染论文; 细胞论文; 肿瘤论文; 对照组论文; 阴性论文; 蛋白论文; 能力论文; 《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期论文;