刘路盟[1]2017年在《酮还原酶基因的克隆表达和质粒依赖系统的构建》文中研究表明(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是合成众多血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的关键手性仲醇。利用酮还原酶制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯具有一定优势,受到了很多研究者的青睐。酮还原酶催化还原酮类化合物需要辅酶还原态的NAD(P)H提供氢。在生产上,为了使酮还原酶催化反应顺利进行降低生产成本,目前主要是将酮还原酶与脱氢酶进行共表达,构建共表达系统。本论文以光滑假丝酵母的酮还原酶CgKR2基因和巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶BmGDH基因作为实验对象,先克隆了两个目标基因,通过基因定向克隆技术,构建了原核表达载体pET17b-TC-CgKR2和pET17b-TC-BmGDH;设计了“T7promoter-T7 RBS-CgKR2-T7 RBS-BmGDH-T7 terminator”双顺反子结构,通过重迭延伸PCR、基因定向克隆等技术构建成表达载体pET17b-TC-CgKR2-BmGDH。经过诱导表达,重组菌BL21-pET17b-TC-CgKR2-BmGDH、BL21-pET17b-TC-C gKR2均高效表达出目的蛋白,表达条带分子量大小与预期一致。上述研究验证了定向克隆的可行性,并为后续的催化活性研究奠定了基础。为了提高发酵工程菌中质粒的稳定性,使CgKR2基因高效稳定表达,本论文设计了质粒依赖系统。将大肠杆菌基因组中条件必须基因敲除,然后将功能正常的基因转移到表达质粒上,这样菌的生长就与质粒形成一种依赖关系。在质粒改造阶段,本论文选择了磷酸丙糖异构酶(tpiA)和葡萄糖胺合酶的基因(glmS)作为质粒依赖系统中所需敲除的条件必须基因。从大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中克隆了tpiA、glmS两个基因。在重组质粒pUCm-tpi A和pET17b-TC质粒的基础上构建了最终的互补表达质粒。论文选用了温敏型质粒pMAK705来进行宿主菌的基因敲除。首先克隆待敲除基因tpiA、glmS前后同源区PCR-T3、PCR-T5、PCR-G3、PCR-G5,对应上下游片段两两重迭延伸,然后连接到温敏型质粒pMAK705中,构建成功tpiA、glmS基因敲除的灭活质粒pMAK705-tpiA和pMAK705-glmS,为CgKR2基因质粒依赖系统的建立奠定了基础。
张一平[2]2017年在《来源于雷氏乳杆菌的醇脱氢酶基因的挖掘及其在不对称合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用研究》文中指出手性醇作为一种重要的手性砌块,被广泛运用于手性药物、农药物和精细化学品的合成当中。与传统化学方法制备手性醇相比,生物催化不对称还原法反应条件温和、立体选择性高和转化率高,因此成为合成手性醇的有效途径。(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(R)-CHBE]是一种非常有价值的手性中间体,被广泛应用于L-肉毒碱、阿法替尼和大环内酯A等手性药物的合成当中。因此,本研究的主要内容为从课题组筛选到的Lactobacilluscurieae S1L19(雷氏乳杆菌)中挖掘新型的醇脱氢酶基因,并将其应用于(R)-CHBE的不对称合成中,最终成功建立了(R)-CHBE的高效酶法制备工艺。具体研究内容如下:1.从Lactobacilluscurieae S1L19中挖掘得到了五种假定醇脱氢酶基因(LCRI、LCRⅡ、LCRⅢ、LCRⅣV和LCRV),并成功对其进行了克隆及目的蛋白的可溶性表达。通过多序列比对分析发现,LCRⅡ和LCRⅢ属于短链脱氢酶家族,LCRI,LCRⅣV和LCRV与奎宁氧化还原酶家族高度相似,属于中链脱氢酶家族。五种醇脱氢酶均对底物4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)显示出了催化活力,其中LCRⅢ显示出了最高的催化活力以及立体选择性(R构型,ee>99%)。因此选定醇脱氢酶LCRⅢ作进一步的研究。2.LCRⅢ的酶学性质研究。结果显示:LCRⅢ的最适pH为6.0,于中性偏酸的环境中较稳定;最适温度为35℃,在30℃和40℃的时候较稳定;金属离子Li+对酶有较高的激活作用,在7 mM的Li+存在时相对酶活为218%;LCRⅢ具有广泛的底物谱,对αα-、β-酮酯类以及芳香酮类等均显示出了催化活性。其中LCRⅢ对丙酮酸甲酯的催化活性最高,为284.2 U/mg;动力学分析发现LCRⅢ对COBE有较高的亲和力以及催化活力,Km 值为 4.28mM,Vmax 为 10.8U/mg。3.辅酶再生循环共表达系统的构建。昂贵的辅酶价格是阻碍醇脱氢酶工业化应用的重要限制性因素,为了降低反应成本,本研究将醇脱氢酶LCRⅢ与来源于枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)同时构建到质粒pET-28a(+)上,并实现了两种酶在大肠杆菌中的异源共表达。通过分析发现,共表达菌株中两种酶均表现出了较高的催化活力。LCRⅢ和BsGDH的干菌体活力分别为113.46 U/g和454.2 U/g。与双菌催化反应相比,共表达反应系统有更高的传质速率。4.不对称催化还原工艺的建立。为了建立一种经济可行、高效催化合成(R)-CHBE的方案,分别对反应参数:底物浓度(0.5-1.5M)、辅酶用量(0-0.5 mM)、催化剂用量(30-50 g/L)和金属离子用量(0-0.7 mM)进行优化。实验结果表明,在单水相体系中,最优反应条件(0 mM辅酶、0.7 mM Li+和40 g/L干菌)下,1.5 M(246.8 g/L)的COBE在6 h内能够完全转化,时空产率达到980 g/L/d。整个反应实现了无辅酶添加下的高浓度底物的完全转化,降低了反应成本,展现出了极高的工业化应用潜质。
李玉新[3]2004年在《酶法合成光学活性化合物》文中研究指明综述了手性药物的发展近况及光学活性化合物的制备方法,重点介绍了酶催化过程的特点,结合实例介绍了脂肪酶催化拆分和酶催化不对称合成的方法,展望了酶催化的工业化应用前景。
参考文献：
[1]. 酮还原酶基因的克隆表达和质粒依赖系统的构建[D]. 刘路盟. 河北大学. 2017
[2]. 来源于雷氏乳杆菌的醇脱氢酶基因的挖掘及其在不对称合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用研究[D]. 张一平. 华东理工大学. 2017
[3]. 酶法合成光学活性化合物[J]. 李玉新. 精细化工中间体. 2004