张玉成[1]2008年在《核心蛋白聚糖（decorin）真核表达载体的构建及其对肝癌细胞（HepG2）作用机制的实验研究》文中研究说明核心蛋白聚糖(decorin,DCN)属于分泌型、小分子、富含亮氨酸多糖基因扩展家族成员之一,主要存在于结缔组织中并且是一种与胶原纤维相关的蛋白多糖,研究发现它能抑制细胞增殖和抗纤维化,具有抗肿瘤的作用。目前国内外还没有decorin基因转染到肝癌细胞HepG2中以及研究decorin抗肝癌机制的报道,本实验采用体外基因重组技术构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,并且转染到肝癌细胞HepG2中,探讨其对肝癌细胞的作用机理。本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,并转染到肝癌细胞HepG2中;结果发现decorin能够抑制肝癌细胞HepG2生长,FCM方法检测细胞周期发现pcDNA3.1-dec-HepG2组G0/G1期细胞比pcDNA3.1-HepG2组G0/G1期细胞明显升高、S期细胞显著降低,细胞生长停滞在G0/G1期; Caspase-3、Caspase-8活性检测发现pcDNA3.1-dec-HepG2组细胞比pcDNA3.1-HepG2组细胞显著升高,RT-PCR和western blot方法显示pcDNA3.1-dec-HepG2组细胞周期依赖激酶抑制剂P21 mRNA和蛋白质比pcDNA3.1-HepG2组细胞显著升高, RT-PCR方法显示pcDNA3.1-dec-HepG2组细胞转化生长因子TGF-β1比pcDNA3.1-HepG2组细胞显著降低。上述结果为进一步研究decorin抗肿瘤的作用机制奠定了基础,同时也为decorin的临床应用提供了理论依据。
马锐[2]2013年在《核心蛋白聚糖在小鼠肝纤维化形成及纤维化肝部分切除后余肝再生中作用的研究》文中提出第一部分核心蛋白聚糖在小鼠肝纤维化形成中作用的实验研究目的：建立四氯化碳(CC14)小鼠肝纤维化模型,注射CC14后予小鼠尾静脉注射小鼠外源性核心蛋白聚糖decorin (DCN),观察DCN对纤维化形成是否有缓解作用,同时分析肝组织中TGF-β1, SMA、TNF-α、HGF以及Caspase3等基因以及蛋白表达情况,探讨DCN干预小鼠肝纤维化形成的机理。方法：(1)20只5周龄Balb/c小鼠,腹腔注射CCl45周建立肝纤维化模型,注射剂量为1ml/kg(CC14体积：橄榄油体积=1：1),每2天注射1次。检测肝标本中肝纤维化相关分子表达情况。(2)腹腔注射CC14三周后,将存活小鼠随机分为2组,实验组(DCN组)以及纤维化对照组。每天两次予实验组注入250ug/kg核心蛋白聚糖DCN,对照组注射等量的PBS和NS混合液(体积比为1：!)。DCN注射2周后,取下两组肝脏标本。取下方叶并将其分成两部分：一部分切成多个小块用于提取组织RNA,检测相关基因表达情况；另外一部分放入福尔马林中用于HE染色、Masson染色以及免疫组化检测相关指标。结果：外源性小鼠DCN蛋白可缓解四氯化碳诱导的肝纤维化。实验组较对照组肝纤维化程度明显减轻,胶原纤维量明显低于对照组。结论：本部分实验以小鼠肝纤维化模型为实验对象,自3周开始向实验组注射DCN蛋白,结果表明外源性DCN可以抑制纤维化相关分子的表达,缓解肝纤维化形成。第二部分核心蛋白聚糖在纤维化肝部分切除后余肝再生中作用的研究目的：建立纤维化70%肝切除再生模型。尾静脉注射外源性小鼠DCN蛋白,观察DCN对纤维化肝部分切除后余肝再生是否有促进作用。方法：46只5周龄Balb/c小鼠,其中6只注射橄榄油,剩余40只注射CC14建立5周肝纤维化模型。予存活肝纤维化小鼠实施70%肝切除术,术后将小鼠随机分为3组：实验组(DCN组)、橄榄油对照组以及纤维化组。术后向实验组注射外源性小鼠DCN蛋白。用肝脏体重比率、RT-PCR以及免疫组化等方法检测肝再生相关指标,以明确外源性DCN蛋白对肝纤维化小鼠部分肝切除后余肝再生是否有促进作用。结果：DCN组TGF-β1和α-SMA等分子表达下调,而肝脏体重比率较对照组升高(P<0.05),差异有统计学意义。结论：外源性小鼠DCN蛋白可促进小鼠纤维化肝部分肝切除后余肝再生。
王桂琴[3]2000年在《核心蛋白聚糖DECORIN在肝纤维化形成机制中的作用》文中提出肝纤维化是多种慢性肝病共有的病理改变。近年来关于肝纤维化发生、发 展的机制及其治疗己从整体、细胞和分子水平进行了大量的研究，资料表明肝 细胞和肝星形细胞（hepatic stellate cell,HSC）是肝纤维化发生、发展中最重要 的细胞，肝细胞损伤是肝纤维化的重要启动因素，肝星形细胞激活是肝纤维化 发生的中心环节。肝纤维化是肝脏以胶原为主的细胞外基质合成和降解失衡的 结果。许多病因可以造成肝损伤，我国以病毒性肝炎为主要原因，当前对原发 病变仍无有效根治的措施，因此减轻和阻止纤维化反应是十分重要的治疗目 标。 Decorin主要由成纤维细胞合成，属于分泌型、小分子、富含亮氨酸蛋白 多糖（small，leucine－rich proteoglycans，SLRPs）基因扩展家族成员之一，在调 节细胞粘附、迁徙、增殖及胶原纤维形成中起重要作用。研究表明decorin在 防止肾小球、肺等组织纤维化中起作用，decorin cDNA最近被用作一种新的基 因治疗工具来治疗由TGF β增高引起的纤维性疾病。Decorin能够使Bleomycin 诱发仓鼠肺纤维化的各项病理指标显著降低，提示decorin在抗肺纤维化中的药 理作用。Decorin与肝纤维化的关系，国外学者通过免疫组化和原位杂交等技 术仅作了不同生理病理状态下decorin在肝脏各种细胞的定性定位研究。国内 关于decorin的研究很少，有关decorin与肝纤维化的研究尚属空白。我们进行 decorin对肝细胞和肝星形细胞影响以及细胞因子对decorin表达影响的体外研 究，以大鼠肝星形细胞株（HSC-T6）细胞和正常人肝细胞株（L-02）细胞为研 究靶细胞，从细胞和基因水平了解decorin在体外对肝脏细胞的调控作用，同时 选择 IFNγ、PDGF等细胞因子与 HSC-T6细胞作用，观察细胞因子对 decorin 表达的调节作用。旨在为探讨decorin在肝纤维化形成机制中的作用提供理论 依据，为肝纤维化治疗提供新思路。 一．Decorin对L-02和HSC-T6体外增殖的影响 互 中文纷召 Decorin是一种与生长抑制活性密切相关的蛋白多糖分子，能够控制多种 来源的细胞增殖。对肝脏组织细胞的作用尚未见报道。我们通过decorin与正 常人肝细胞株（L心2）及大鼠肝星形细胞株（HSC＊6）体外共孵育，进行细 胞计数和心掺入量测定，观察decorin对这些细胞分裂增殖的影响，通过流式 细胞仪分析 DNA含量观察其对细胞周期的影响。结果表明 5叶 卜g／ml decorin 作用4—6天后，与对照组相比在相同培养条件下细胞增殖数量及速度降低，以 10 pg／ffil作用更强，并且随作用时间延长而明显（P＜0刀1人作用48小时可使 细胞’＊－＊dR掺入量比对照组减少18．29％（P＜O．05），’＊－Leu掺入量无明显改 变，提示对细胞DNA合成有影响。Decorin作用后，G／G；期细胞百分率比对 照增加19石3％和29．08％（P＜0刀1）石期细胞百分率比对照降低18．45％和Zo．98 ％（P＜0刀1X G。／M期细胞减少甚至消失。细胞经20ug／ml decorin作用 6天， 台盼蓝染料排斥实验表明细胞活力在 90％以上，说明 decorin在测试条件下对 所用细胞无细胞毒性作用，其细胞数量低于对照是由于细胞受decorin作用所 致。结果表明decorin能够抑制肝细胞和肝星形细胞的体外增殖，可能与细胞 G；期阻滞以及抑制细胞DNA合成有关。Decorin对细胞生长有负反馈调节作 用。 二．Decorin诱导L心2细胞和HSC16细胞词亡的研究 肝组织损伤启动HSC 由一种静止的富含维生素A的表型转化为活化的 肌纤维母细胞样（MFBLC），与静止状态细胞相比，后者具有更高的增殖活力 并能大量合成细胞外基质。逆转HSC的活化表型或减少HSC的数量可以减少 ECM成分的过度沉积。我们以decorin为诱导剂，观察decorin在体外对L．02 细胞和HSC16细胞凋亡的诱导作用。 我们的实验从多方面表明 decorin在 20－40卜g／ml浓度作用后可使 HSC16 和L－02细胞发生凋亡。Decorin与L－02和HSC16细胞体外共同孵育后，细 胞出现了凋亡特征性改变，贴壁细胞变圆、缩小、脱落，台盼蓝染料排斥试验 表明这些细胞是活细胞；染色质浓缩，聚集呈新月形或马蹄形，形成凋亡小体；
上官建营[4]2010年在《核心蛋白聚糖在肝细胞肝癌中的表达及作用机制研究》文中研究指明肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,预后差,通常患者在6-20个月内死亡。目前治疗原则是以外科手术治疗为主的综合治疗,非手术治疗包括局部肿瘤治疗、放射治疗、化学治疗和生物治疗,肝移植技术逐渐走向成熟,但也主要适用于早期肝癌患者,晚期患者预后不佳,加之费用昂贵、供体紧缺,不能广泛造福于患者。人们一直在探寻更为有效的治疗肝癌的药物和方法。核心蛋白聚糖(Decorin,DCN)是机体重要的细胞外基质成分之一,属于富含小型亮氨酸蛋白聚糖基因家族(SLRP)的成员。有大量体外研究证实DCN能够抑制多种肿瘤细胞的增殖。其抑制肿瘤细胞的机制主要有:(1)结合并抑制TGF–β生物活性,减少肿瘤发生和转移。(2)DCN可以调整细胞周期,使G1期细胞数增加,S期细胞数显著降低,抑制肿瘤细胞增殖。(3)DCN可诱导肿瘤细胞凋亡。因此,DCN可能作为肝细胞肝癌一种新的治疗靶点。深入的了解DCN,对于肝癌预防和治疗都具有重要的意义。目的研究核心蛋白聚糖在肝细胞肝癌组织中的表达情况及其对HuH7细胞系体外增殖的影响。探讨揭示DCN与原发性肝癌发生、发展的关系,为肝癌新基因治疗靶点选择提供理论依据。方法1.以免疫组织化学(SP法)分别检测16例正常肝组织、20例肝硬化组织、30例肝癌及癌旁组织中DCN的表达,采用阳性表达率及光密度值,进行半定量及定量分析。2.加入含不同浓度(0、25、50、75、100、125、150、200ng/ml)DCN的培养液培养HuH7细胞系不同时间(12、24、48、72、96h、2W),用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法及克隆实验测定细胞增殖速度和活力,流式细胞技术测定细胞周期和凋亡情况。结果1. DCN在肝硬化及癌旁组织中呈强阳性表达,阳性表达率(55%、73.3%)、平均光密度值(OD)(0.2357±0.0396、0.2983±0.1990)与正常肝组织及肝癌组织阳性表达率(0、10%)、平均OD(0.1394±0.0072、0.1589±0.0115)比较,表达有显著性差异。结果提示DCN在癌旁及肝硬化组织中呈阳性表达,在肝癌及正常肝组织中为弱阳性表达。2. DCN对HuH7细胞增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性。DCN可以调整细胞周期,使G1期细胞数增多,S期减少,G2期无变化,提示DCN可抑制肿瘤细胞由G1/S转化。DCN作用HuH7细胞后,HuH7凋亡率升高。结论DCN可能作为一种负性调控蛋白参与肝癌的发生发展。体外培养HuH7细胞随DCN浓度增加及作用时间延长,细胞增殖速度减慢、活力减低,G1期细胞增多,凋亡增加。通过调节细胞周期,促进细胞凋亡,抑制肝癌细胞的增殖。DCN将可能成为一种理想的肝癌基因靶向治疗药物。
王桂琴, 郭彩虹, 孔宪涛, 仲人前, 李莉[5]2000年在《核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响》文中研究指明目的 :探讨核心蛋白聚糖 (decorin)在肝纤维化形成机制中的作用。方法 :在正常人肝细胞株 L - 0 2及大鼠肝星形细胞株 HSC- T6体外培养体系中 ,分别加入不同质量浓度 (0 .0 1,5 ,10μg/ m l) decorin共培养不同时间后 ,进行细胞计数以及 3H- Td R和 3H- L eu掺入量测定。结果 :实验组经 0 .0 1μg/ m l decorin作用 4d或 6 d后 ,HSC- T6和 L- 0 2细胞增殖数量以及 3H- Td R和 3H- L eu掺入量均显著高于对照组 (P<0 .0 1,P<0 .0 5 )。而 5 ,10μg/ m l decorin作用 4d或 6 d后 ,HSC- T6和 L -0 2细胞增殖数量以及 3H- Td R掺入量均显著低于对照组 (P<0 .0 1,P<0 .0 5 )。 结论 :decorin对细胞体外增殖有双重调节作用 ;它可能通过抑制细胞增殖而阻止肝纤维化的发生
王桂琴, 李莉, 张玲珍, 孔宪涛, 王红蓓[6]2002年在《核心蛋白聚糖诱导L-02和HSC-T6细胞凋亡的初步观察》文中研究指明目的 探讨核心蛋白聚糖 (decorin)对正常肝细胞和肝星形细胞诱导凋亡的作用。方法 以正常人肝细胞株 (L 0 2细胞 )和大鼠肝星形细胞株 (HSC T6细胞 )为研究靶细胞 ,通过HE染色、流式细胞仪分析、TUNEL标记和电镜观察等方法证实decorin对肝细胞和肝星形细胞凋亡的诱导作用。结果 Decorin能够诱导两种靶细胞出现典型的凋亡细胞特征 ,细胞核浓缩、边聚 ,胞膜皱褶 ,凋亡小体形成。而且其诱导凋亡作用呈现剂量和时间效应。结论 Decorin能够诱导肝细胞和肝星形细胞凋亡 ,提示可以通过凋亡途径减少因损伤刺激而过度增生的细胞 ,以利于肝纤维化治疗
袁媛, 周静, 姜政[7]2011年在《核心蛋白聚糖生物学的研究进展》文中认为核心蛋白聚糖(DCN)属富含亮氨酸小分子蛋白多糖家族成员之一。转化生长因子β(TGF-β)与其受体结合后导致细胞外基质过度沉积,DCN通过与TGF-β结合并将其中和以产生抗纤维化和抑制瘢痕形成的作用。同时DCN亦通过激活表皮生长因子受体(EGFR)/促分裂原活化蛋白激酶/p21信号通路和抑制EGF-EGFR介导的促细胞增殖信号通路等机制来抑制肿瘤细胞增殖与转移。基于DCN以上两方面的生物活性,加之源于人体自身产生,所以重组产品免疫原性较低,提示DCN对于慢性纤维化和肿瘤等疾病的防治具有潜在的药用开发价值。
操海萍[8]2004年在《核心蛋白聚糖（decorin）在肿瘤组织中的表达及基因重组decorin的克隆与表达的研究》文中研究表明核心蛋白聚糖（decorin）是细胞外基质的组成成分，属于蛋白聚糖的一种，是SLRPs家族成员之一。它可抑制胶原纤维形成，参与调控细胞增殖、粘附。近年研究发现decorin可抑制细胞增殖，具有潜在抗肿瘤治疗应用前景。大量研究显示decorin可抑制各种组织来源的肿瘤细胞的增殖，在体内外均可抑制肿瘤细胞生长。Decorin基因转染的肿瘤细胞在重度免疫缺陷小鼠体内不能形成肿瘤。国内外研究资料显示，Decorin基因及蛋白分子在不同肿瘤组织中表达是多样化的。关于decorin抗肿瘤作用机制国外也进行了一些研究，目前认为其抗肿瘤作用机制主要为：（1）Decorin是TGF－?的天然抑制剂，可能通过抑制TGF－?的生物学活性，进而抑制肿瘤的发生及转移。（2）Decorin可激活内皮细胞生长因子受体(EGFR),使其形成二聚体而发生自身磷酸化，引起丝裂原激活蛋白激酶（MAP）激活，导致细胞内钙离子增多，从而上调强效抑制性细胞周期蛋白p21，最终导致细胞生长抑制。（3）Decorin可能通过抑制肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤作用。（4）Decorin可与细胞外基质中的其他分子相互作用，影响细胞间粘附及迁移，可能对肿瘤发生、发展具有一定作用。目前国内尚无联合研究decorin mRNA及蛋白分子在肿瘤组织中表达的报道，尚未进行基因重组人decorin在真核细胞中表达的研究。本实<WP=86>验从基因转录和翻译水平研究了decorin在乳腺癌和结直肠癌中的表达，并采用基因工程技术进行rhdecorin表达的研究，进一步探讨rhdecorin对肿瘤细胞的作用。研究取得如下进展：1、Decorin mRNA在乳腺癌和结直肠癌中的表达本实验采用原位杂交技术，分别检测decorin mRNA在25例乳腺癌、9例相对正常乳腺、10例结直肠癌、9例相对正常大肠组织中的表达。实验结果显示：乳腺癌癌细胞中可见decorin mRNA表达，阳性信号定位于胞浆和（或）胞核内，呈黄色，乳腺癌癌细胞内decorin mRNA表达总阳性率为88％（22／25）。远离乳腺癌的相对正常乳腺腺细胞内无decorin mRNA表达，其差别具有非常显著性（P<0.01）。统计分析结果显示在不同病理类型的乳腺癌中decorin mRNA表达阳性率的差别无显著性(P>0.05)。结直肠癌癌细胞及相对正常大肠腺细胞内均可见decorin mRNA表达，其差别无显著性（P>0.05）。实验结果提示decorin mRNA在不同肿瘤组织中表达不同。2、Decorin蛋白分子在乳腺癌和结直肠癌中的表达实验采用免疫组织化学方法分别检测decorin蛋白分子在38例乳腺癌、9例相对正常乳腺、10例结直肠癌、9例相对正常大肠组织中的表达。研究发现decorin蛋白分子主要表达于乳腺癌癌细胞胞浆内，相对正常乳腺腺细胞内未见decorin蛋白分子阳性表达，Decorin蛋白分子在乳腺癌癌细胞中表达阳性率高于相对正常乳腺腺细胞，其差别具有非常显著性（P<0.01）。统计分析结果显示，在各种不同病理类型的乳腺癌中，Decorin蛋白分子表达阳性率差别无统计学意义（P>0.05）。Decorin蛋白分子在乳腺癌间质及相对正常乳腺组织中均有大量表达，紧邻乳腺癌的间质中decorin蛋白表达较相对正常乳腺腺体周围间质高，其差别具有非常显著性（P<0.01）。在10例结直肠癌，9例相对正常大肠标本中，均未见结直肠癌癌细胞及相对正常大肠腺细胞内有decorin蛋白表达。实验结果表明decorin蛋白在不同肿瘤组织中的表达是多样化的。<WP=87>3、rhdecorin表达载体的构建PCR方法从质粒中调取人decorin基因全长，将decorin基因定向克隆至表达载体pcDNA3.1，成功构建基因重组真核表达载体pcDNA-dec。经酶切鉴定、DNA序列分析，结果表明重组真核表达载体pcDNA-dec中插入的目的基因与文献报道人decorin基因顺序基本相同。这表明rhdecorin表达载体已成功构建。4、rhdecorin在CHO细胞中的表达脂质体介导的重组真核表达载体pcDNA-dec稳定转染CHO细胞，经G418筛选两个半月，建立稳定转染decorin的CHO细胞株。对稳定转染的细胞进行免疫组织化学检测，发现在稳定转染的细胞胞浆内有decorin蛋白表达。5、rhdecorin转染HCT／8细胞及其对HCT／8细胞作用的研究脂质体介导的基因重组真核表达载体pcDNA-dec稳定转染HCT／8细胞，经G418筛选近两个月，建立稳定转染decorin的HCT／8细胞株。对稳定转染的细胞进行免疫组织化学检测，发现在稳定转染的细胞胞浆内有decorin蛋白的表达。采用MTT法检测稳定转染肿瘤细胞增殖活力，发现稳定转染decorin基因的HCT／8细胞生长受抑制。未发现稳定转染decorin基因影响HCT／8细胞的细胞周期及诱导HCT／8细胞凋亡。本研究结果提示decorin在不同组织来源的肿瘤细胞中表达是不同的，同时肿瘤间质细胞可大量表达decorin，推测decorin在肿瘤发生、发展中的作用比较复杂。Decorin基因转染可抑制肿瘤细胞HCT／8细胞的生长，这证明decorin具有抑制肿瘤细胞增殖的能力，其作用机制尚需进一步研究。实验成功地进行了基因重组人decorin在CHO细胞中的表达，为进一步研究decorin的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。
胡小军[9]2011年在《核心蛋白聚糖抑制淋巴细胞增殖及皮肤移植免疫排斥反应的研究》文中提出器官移植是目前终末期器官功能衰竭患者的唯一根治性治疗手段。移植术后患者必须常规接受免疫抑制剂治疗,免疫抑制药物的应用能够降低急性排斥反应发生,免疫抑制剂的发展推动了器官移植向前发展。经过半个多世纪的历程,免疫抑制剂在器官移植领域取得了显著成就,在人类科学发展史上迈出了巨大的一步。20世纪60年代临床可用免疫抑制剂十分有限,只有皮质激素及硫唑嘌呤。到70年代出现了抗淋巴细胞球蛋白(多克隆抗体)。80年代初环孢素问世,90年代吗替麦考酚酯及他克莫司相继应用于临床,近年来多个新型免疫抑制剂不断进入临床并能有效控制器官移植免疫排斥反应发生。虽然这些新型免疫抑制剂虽然在肝、肾毒性、神经毒性和胃肠道毒性等方面有了很大改善,但是免疫抑制药物仍存在一些不同不良反应及不尽人意之处,我国是肝癌大国,肝癌病人多,部分病人需要接受肝移植手术,肝癌肝移植术后应用免疫抑制剂,降低免疫排斥反应同时可能会诱发肝癌复发和感染。解决以上这些问题是器官移植界当务之急若能寻找一种新型免疫抑制剂,克服以上不良反应及不足,将给医生及患者带来福音。雷帕霉素和索拉非尼经证实具有抗肿瘤和抗免疫排斥双重作用。核心蛋白聚糖(decorin, DCN)研究已表明具有抗肿瘤作用,本实验欲证实DCN是否具有抗免疫排斥作用。核心蛋白聚糖(DCN)是细胞外基质的重要组分之一,具有多种生物活性。其已被大量体外研究证实能够抑制多种肿瘤细胞的增殖。其抑制肿瘤细胞的机制主要有:①DCN可以作用影响细胞周期,使G1期细胞数增加而S期细胞数显著降低,起到抑制肿瘤细胞增殖作用。②抑制TGF–β生物活性,减少肿瘤发生和转移。③DCN可以诱导肿瘤细胞凋亡。我们既往研究证实DCN具有抗肝癌作用,其机制主要是调节肝癌细胞周期,促进细胞凋亡,抑制肝癌细胞的增殖。DCN在免疫排斥方面文献报道较少,Mark Stegall[1]研究报道,大鼠心脏移植术,测受体鼠术后3 d、5 d、7 d体内DCN含量变化,结果发现:同种异体移植组大鼠体内DCN随时间延长DCN含量降低,急性排斥反应明显,而同种同基因大鼠体内DCN含量则无明显变化。这一研究表明,DCN可能与免疫排斥反应有关。目的:观察DCN对小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖影响;DCN作用于受体小鼠体内Th1和Th2细胞因子变化;DCN对皮肤移植模型术后免疫排斥反应的影响。方法以Ficoll密度梯度离心法提取C57BL/6J脾脏淋巴细胞,96孔板接种后,各孔加入25μg刀豆蛋白A。将细胞分为5组,分别加入0、25、50、75、100μg/L的DCN,同时设立仅含细胞悬液阴性对照组和培养液空白对照组。各组细胞培养24、48、72、96、120 h后,以MTT法检测各组淋巴细胞增殖率,并以流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。以24只健康成年BALB/c小鼠为供体,30只健康成年C57BL/6J小鼠为受体,将受体随机分为5组,建立背部皮肤移植模型。A组为阴性对照组,术后腹腔注射生理盐水1 mL;B组、C组、D组受体小鼠于术后分别腹腔注射50、100、150μg的DCN。同时设立E组,为C57BL/6J对C57BL/6J的同种同基因移植对照组。移植术后第7天ELISA方法检测外周血Th1和Th2细胞因子含量变化,重复以上建立移植模型步骤,建立相同组别小鼠皮肤移植模型,术后腹腔给予同样DCN,观察各组受体移植皮片的存活时间和急性排斥反应发生时间。术后第7天,每组各取1只受体小鼠的移植皮片行病理学检查。结果各组不同浓度DCN对小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖均有抑制作用,并可诱导淋巴细胞凋亡,随DCN浓度升高对淋巴细胞增殖抑制作用更强,100μg/L组抑制作用最明显,细胞凋亡率为77.6%,与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05);术后7天检测受体内细胞因子,结果如下:Th1细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α含量在A、B、C、D、E组依次呈下降趋势,生理盐水A组细胞因子含量最高,如IL-2(45.1±1.8 pg/L),同种同基因移植E组含量最低,如IL-2(15.4±1.7 pg/L),而TH2细胞因子IL-4、IL-10含量在A、B、C、D、E组依次呈上升趋势,生理盐水A组含量最低,如IL-4(60.9±2.6 pg/L),同种同基因移植E组含量最高,如IL-4(88.3±1.4 pg/L)但各组IL-6含量未见明显变化。经方差分析,IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10细胞因子不同组别间存在统计学意义(P<0.05)而IL-6不同组别间无统计学意义(P>0.05)。术后14天检测上述细胞因子,各组IL-6细胞因子含量无明显变化,A、B和E组细胞因子也无明显变化,而C、D组中IL-2、IFN-γ、TNF-α较术后7天相对应组别细胞因子含量升高,而IL-4、IL-10却是降低的,经方差分析,同一组别术后7天和术后14天受体体内细胞因子含量存在统计学意义(P<0.05)。DCN具有抑制皮肤移植免疫排斥反应及延长移植皮片存活时间,150μg组皮片存活时间最长,平均为(16.6±2.4)天,与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。且随剂量增大抑制作用明显,移植皮肤急性排斥反应轻。结论DCN具有抑制淋巴细胞增殖作用,可能通过诱导活化的淋巴细胞凋亡发挥作用;DCN既能够抑制Th1细胞因子分泌又能够促进Th2细胞因子分泌,且具有量效关系,促进Th1/Th2细胞因子比例向Th2型偏移;DCN能够抑制小鼠皮肤移植术后急性排斥反应发生,并延长移植皮片的存活时间。
刘飞[10]2008年在《Decorin对SAH后柔脑膜纤维化的干预》文中研究指明目的:蛛网膜下腔出血(SAH)是神经内、外科的常见疾病,慢性脑积水是SAH后的常见慢性并发症。柔脑膜(leptomeninges)是蛛网膜、软脑膜及两者之间的蛛网膜下腔的统称,其蛛网膜细胞是特化的成纤维细胞。转化生长因子-β_1(TGF-β_1)具有促进成纤维细胞增殖和分泌的作用。SAH后脑脊液中的TGF-β_1升高,能使柔脑膜的蛛网膜和蛛网膜下腔、以及蛛网膜颗粒等部位的纤维增生,导致慢性脑积水。核心蛋白聚糖(Deeorin DCN)被认为是TGF-β_1的天然拮抗剂,具有抗纤维化作用。利用DCN拮抗TGF—β_1,减轻柔脑膜的蛛网膜和蛛网膜下腔、以及蛛网膜颗粒等部位的纤维增生,来预防SAH后慢性脑积水的发生,具有一定的现实意义。目前对此尚无研究报道,本研究旨在此做初步探索,研究DCN对SAH后柔脑膜纤维化的干预。方法:首先,我们将80只SD大鼠随机分为空白组(20只)、生理盐水Ⅰ组(NSⅠ组30只)和模型Ⅰ组(SAHⅠ组30只),采用枕大池两次注血法建立鼠实验性SAH动物模型。分别在第3、6、10、14、21天处死大鼠,在第3天取脑观察蛛网膜下腔的积血;在所有时间点均取脑脊液检测TGF-β_1、PICP的浓度观察其动态变化;在第21天取脑观察柔脑膜的纤维化程度。然后,将40只SD大鼠随机分为实验组、对照组、模型Ⅱ组(SAHⅡ组)、生理盐水Ⅱ组(NSⅡ组),每组各10只,实验组和对照组在第2、10天分别给予外源性DCN。在第21天检测脑脊液的TGF-β_1、PICP浓度和柔脑膜的纤维化程度。柔脑膜纤维化的检测方法包括:胶原纤维MASSON染色、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠColⅠ)mRNA、结缔组织生长因子(CTGF)mRNA的RT-PCR法检测及其蛋白的Western blot法检测。结果:1、SAH动物模型的制作:①造模第3天,在大脑半球及脑底的蛛网膜下腔(或脑池)可见散在的小血凝块,切片染色显示在硬脑膜与脑组织之间柔脑膜内可见红细胞,构模成功;②SAHⅠ组脑脊液中的TGF-β_1较NSⅠ组明显升高并呈双时相(P＜0.01):③SAHⅠ组脑脊液中的PICP浓度逐渐升高,第6天开始显著高于NSⅠ组(P＜0.01);④MASSON染色显示SAHⅠ组柔脑膜的灰度值显著低于NSⅠ组、厚度显著高于NSⅠ组(P＜0.01);⑤SAHⅠ组的ColⅠmRNA、CTGF mRNA及蛋白的表达量均显著高于NSⅠ组(P＜0.05);⑥空白组与NSⅠ组间的各指标均无显著性差异(P＞0.05)。2、DCN的干预:①实验组与SAHⅡ组比较:实验组的TGF-β_1。稍低但无显著性(P＞0.05)、PICP显著降低(P＜0.05);MASSON染色显示实验组柔脑膜的厚度稍低但无显著性(P＞0.05)、灰度值显著升高(P＜0.05);实验组ColⅠmRNA表达量明显减少(P＜0.05)、CTGFmRNA表达量稍减少但无显著性(P＞0.05);实验组的ColⅠ和CTGF的表达量均明显减少(P＜0.05);②实验组与NSⅡ组比较:实验组的TGF—β_1、PICP显著增高(P＜0.05);MASSON染色显示实验组柔脑膜的厚度明显增大、灰度值明显降低(P＜0.05);实验组ColⅠmRNA、CTGF mRNA及蛋白的表达量均明显增高(P＜0.05);③对照组与NSⅡ组间的各指标均无显著性差异(P＞0.05)。结论:1、SAH发生后出现脑脊液中的TGF-β_1升高,并呈双时相;2、SAH发生后的第21天,存在柔脑膜的纤维化;3、SAH发生后,给予DCN可以减轻柔脑膜的纤维化程度。
参考文献：
[1]. 核心蛋白聚糖（decorin）真核表达载体的构建及其对肝癌细胞（HepG2）作用机制的实验研究[D]. 张玉成. 吉林大学. 2008
[2]. 核心蛋白聚糖在小鼠肝纤维化形成及纤维化肝部分切除后余肝再生中作用的研究[D]. 马锐. 浙江大学. 2013
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[4]. 核心蛋白聚糖在肝细胞肝癌中的表达及作用机制研究[D]. 上官建营. 第四军医大学. 2010
[5]. 核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响[J]. 王桂琴, 郭彩虹, 孔宪涛, 仲人前, 李莉. 第二军医大学学报. 2000
[6]. 核心蛋白聚糖诱导L-02和HSC-T6细胞凋亡的初步观察[J]. 王桂琴, 李莉, 张玲珍, 孔宪涛, 王红蓓. 中国药物与临床. 2002
[7]. 核心蛋白聚糖生物学的研究进展[J]. 袁媛, 周静, 姜政. 医学综述. 2011
[8]. 核心蛋白聚糖（decorin）在肿瘤组织中的表达及基因重组decorin的克隆与表达的研究[D]. 操海萍. 吉林大学. 2004
[9]. 核心蛋白聚糖抑制淋巴细胞增殖及皮肤移植免疫排斥反应的研究[D]. 胡小军. 第四军医大学. 2011
[10]. Decorin对SAH后柔脑膜纤维化的干预[D]. 刘飞. 中南大学. 2008
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