向梅春[1]2003年在《食线虫菌物被毛孢种内形态、致病性及遗传变异研究》文中指出植物寄生线虫是重要的植物病原物，对农业生产造成巨大损失，线虫的生物防治受到人们的极大关注，食线虫被毛孢是重要的线虫内寄生真菌，因其在自然条件下对线虫寄生率高，是线虫生物防治的重要资源。目前发现寄生线虫的被毛孢包括洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)和明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis)2个种，洛斯里被毛孢具有广泛的寄主范围，不同来源的被毛孢菌株在形态学和致病性上都有一定的差异，为了更好地利用被毛孢防治有害线虫，有必要对被毛孢的种内形态、致病性及遗传变异进行研究。 本研究通过对16个洛斯里被毛孢菌株、5个明尼苏达被毛孢菌株、2个未鉴定菌株以及1个汤普森被毛孢菌株进行了比较形态学研究以及对大豆孢囊线虫、燕麦胞囊线虫、根结线虫、松材线虫和昆虫病原线虫(2个种)的致病性测定，并对19株洛斯里被毛孢、7株明尼苏达被毛孢、2个未鉴定菌株以及1株汤普森被毛孢进行了ITS序列分析。 形态学研究结果表明不同种的被毛孢形态区别明显，而种内菌株间存在一定的差异，洛斯里被毛孢各菌株分生孢子梗的长度有较大的差异，与寄主来源和地理分布关系不明显，而来源于甜菜胞囊线虫的ARSEF2789菌株的菌落为白色，与洛斯里被毛孢相同，但分生孢子梗较短，分生孢子近球形，与明尼苏达被毛孢接近，ITS序列分析表明该菌株与洛斯里被毛孢聚类在一起，但单独一支。 寄主专化性研究结果表明，洛斯里被毛孢中来自腐生线虫的WT29-2、来自Heterodera humili的ARSEF2894、来自短体线虫的ARSEF3755以及明尼苏达被毛孢中来源于弹尾目昆虫的ARSEF2799和汤普森被毛孢对所有供试的6种线虫寄生率较低或不寄生；来源于大豆胞囊线虫的明尼苏达被毛孢对胞囊线虫寄生性强，对根结线虫及其它线虫寄生性很弱。其它菌株对6种线虫均有一定的寄生性，表明同一来源的菌株对不同线虫的寄生性有差异，同一菌株对不同线虫的寄生性也有很大差异，说明不同来源的被毛孢菌株对不同线虫有不同的致病性分化，但未能找出明显的分化趋势。 对不同来源供试菌株进行系统发育学研究结果表明，3个种分别聚为了3类，洛斯里被毛孢来自腐生线虫的2个菌株WT29-2和JA16-1聚为一类，与其它菌株明显区分，形态比较特殊的ARSEF2789也单独聚为一类，其余菌株没有明显规律；明尼苏达被毛孢则与地理分布有关，来自中国的菌株和来自美国的菌株分别各聚为1类， 表明被毛泡菌株存在一定程度的致病性分化和地理分化。 2个未鉴定菌株ARS2799和 ARS2795的形态分别与明尼苏达被毛抱、洛斯里被 毛抱形态特征相似。ITS序列分析结果ARS2799 与明尼苏达被毛抱聚在一起， ARS2795与洛斯里被毛抱聚在一起。尽管ARSEF2795在形态上与来自线虫上的洛斯 里被毛抱存在一些差异，ARS2799对6种线虫的寄生率不高或不寄生与明尼苏达被 毛抱有一定的差异，但从形态学和分子系统学的结果综合分析，将ARS2795鉴定为 洛斯里被毛抱，ARSEF2799鉴定为明尼苏达被毛抱。
钱洪利[2]2009年在《明尼苏达被毛孢对大豆胞囊线虫作用的研究》文中研究说明明尼苏达被毛孢是大豆胞囊线虫幼虫专性寄生真菌,是一类具有潜力的线虫生防资源。为了探讨明尼苏达被毛孢对大豆胞囊线虫的生防作用机制,实验室条件下,研究了明尼苏达被毛孢1-10代谢物原液及不同稀释液对大豆胞囊线虫卵孵化和二龄幼虫(J2)活性的影响,研究了J2对1-10代谢物、大豆根浸出液和大豆根的趋性;温室条件下,研究了明尼苏达被毛孢不同菌株及不同接菌量对大豆胞囊线虫数量及分布的影响和大豆生长的影响。明尼苏达被毛孢1-10代谢物对大豆胞囊线虫卵的9呼化和J2活性具有较强的抑制作用。1-10代谢物原液对卵孵化的相对抑制率最高,达到100%;5×、10×、20×和50×代谢物稀释液对大豆胞囊线虫卵孵化的抑制率分别下降至45.2%、26.6%、21.7%和17.7%。24h后1-10代谢物原液、5×、10×、20×和50×对J2致死率分别为91%、75%、50%、36%和31%,远高于无菌水对照致死率7.2%,且差异显着,说明1-10代谢物具有很强的杀虫活性;尤其是原液在48h后J2致死率达到100%,强烈地抑杀了J2。J2在距1-10代谢物原液最近处0～1cm区间分布率最低,最远处2～3cm区间分布率最高,表明J2朝1-10代谢物方向运动缓慢,对1-10代谢物存在显着的趋避性;J2在距根浸出液原液0～1cm区间分布率最高,最远处2～3cm区间分布率最低,表明J2朝大豆根浸出液方向运动迅速,对根浸出液存在着一定的趋向性;J2在根浸出液/1-10代谢物混合液的0～1cm区间分布率低于无菌水对照,2～3cm区间分布率高于无菌水对照,表明J2对混合液的趋避性仍然十分明显。大豆幼根蘸1-10代谢物的处理与根浸出液处理结果相同,表明1-10代谢物能够降低大豆胞囊线虫对大豆的亲和性。在温室条件下进行盆栽试验,每盆湿热灭菌土中分别接种0.4g明尼苏达被毛孢菌丝体和9000个大豆胞囊线虫卵。接种35d后调查结果表明,与灭菌土壤对照相比,在灭菌土中接种明尼苏达被毛孢1-10和HLJ07-21-3均能显着促进大豆生长,地上、地下鲜重均有所增加,鲜重总增重率分别为30.90%和27.72%;与灭菌土壤接种SCN相比,在接种SCN的灭菌土壤中接种明尼苏达被毛孢,能有效地减少SCN群体数量,尤其是卵的数量;明尼苏达被毛孢显着影响SCN的分布,尤其是根上雌虫和土中胞囊数量分布;与HLJ07-21-3相比,1-10对SCN群体数量影响更为显着,降低线虫总数达43.6%。在温室条件下进行盆栽试验,每盆湿热灭菌土中明尼苏达被毛孢1-10接种水平分别为0.2、0.4和0.8g菌丝体,接种35d后进行调查。与灭菌土壤对照相比,1-10叁个接种水平均能显着促进大豆生长,鲜重总增重率分别为21.12%、29.20%和27.27%,大豆株高增长达到显着水平;与灭菌土接种SCN对照相比,只有接种SCN和0.8g 1-10处理鲜重总重增加达到显着水平。与灭菌土壤接种SCN相比,在接种SCN的灭菌土壤中1-10叁个接种水平能有效地减少SCN群体数量,尤其是卵的数量;而且显着影响SCN的分布,尤其是根上雌虫和土中胞囊数量分布;与SCN对照相比,接种SCN和0.2、0.4和0.8g 1-10均显着降低线虫总数分别达30.2%,40.9%和39.2%;接种SCN和0.4g1-10对SCN群体数量影响最为显着。
韩燕峰[3]2007年在《中国拟青霉属的系统学及部分菌株的致病性研究》文中研究指明拟青霉Paecilomyces Bain.的许多种是重要的昆虫病原真菌，其中一些种是虫草(Cordyceps)的无性型(anamorph)。作为一类寄生于昆虫的真菌资源，它们不仅在有害生物的控制上发挥着重要的作用，而且在医药卫生、功能食品、环境污染和治理以及基因工程等方面也有重要作用。本论文对我国拟青霉属真菌在以下方面取得了有新意的研究结果：1．中国拟青霉资源调查及经典分类鉴定结果[1]通过对全世界已发表的125种拟青霉进行研究整理，作者认定拟青霉属现仅包含64个有效分类单元，寄生昆虫的种为34个，占了该属成员的53.1％。[2]研编了以微观特征和培养性状为主的拟青霉属已知种Access检索数据库。实践结果表明，这个数据库对待定种的初步鉴定方便、快捷和有效。[3]对我国拟青霉进行了调查和分类研究。从全国32个省市采集的975份土样和164份罹病昆虫标本中分离到大量真菌菌株，经初步鉴定，共获得298株拟青霉，加上贵州大学真菌资源研究所保存的标本和菌种，作者共观察研究了313株拟青霉。在以表型特征为主的基础上，描述我国拟青霉39种，占了全球拟青霉总数的63％，这表明我国拟青霉具有丰富的物种多样性。在这39种拟青霉中，包括已知种20个，新纪录种3个，新组合1个和新种15个。此外还分离到拟青霉相近属的4个中国新纪录种：丽玛利亚霉鲜红变种Mariannaea elegans(Corda)Samson var.punicea Samson、印度金孢Chrysosporium indicum(H.S.Randhawa& R.S.Sandhu)Garg、裂叶金孢Chrysosporium lobatum Scharapov和高山弯颈霉Tolypocladium nubicola Bissett。对分离得到的一些拟青霉和相近属的中间类型菌株如P.sp A7-1、P. sp A17-2、P. spA18-1、P. sp A19-3、P. sp A40-1、P. sp A43、P. sp A62-1、P. sp DH3-1、P. sp LN2-9、P. sp 3'29-1和P. sp D23-1结合分子生物学方法进行了分类鉴定。[4]初步统计显示，中国拟青霉的地理分布面非常广。其生存范围涉及各种土壤、植物和多种罹病昆虫。寄主昆虫范围有鳞翅目、膜翅目、同翅目、半翅目和鞘翅目等昆虫的成虫、若虫和蛹，还可寄生其他动物如线虫、蜘蛛等。但不同种的分布范围有明显差异。如淡紫拟青霉和马昆德拟青霉几乎能从各个省市土样中分离到；而念珠藻状拟青霉和一些耐热的单瓶梗拟青霉的出现频率较低，分布面较窄。以秦岭——淮河为南北方划分界线发现，南方拟青霉菌株的检出率比北方要高，尤其是罹病昆虫上拟青霉的数量更为明显。从采集的各种生境和寄主看，土样中发现拟青霉的频率和种类最多，大多数拟青霉新种(23.9％)都来自土壤。2．Delta专家分类系统在我国虫生拟青霉种间的应用研究[1]在以经典分类时建立的Access检索数据库的基础上，构建了我国24种虫生拟青霉种的DELTA数据库。该数据库是实现如下功能扩展的基础。[2]中国虫生拟青霉种检索表的自动生成；中国虫生拟青霉的自然语言描述；中国虫生拟青霉种的距离矩阵及聚类树系图(Phenetic tree)和拟青霉种间的交互式自动鉴定。3．中国拟青霉的分子系统学研究[1]部分拟青霉菌株的分子鉴定。用测得的ITS区域rDNA序列，在GenBank经Blast比对后，下载与其相似性最大的一些近缘种和表型特征相近的种共同建树进行分析。在表型特征鉴定的基础上，得到分子系统发育树支持作为新种成立的拟青霉有：纤姿拟青霉P. tenuis；紫拟青霉P. purpurseus；轮生拟青霉P. verticillatus；柱孢拟青霉P. cylindricosporus；花溪拟青霉P.huaxiensis和小孢拟青霉P.parvosporus。[2]一些单瓶梗拟青霉分类地位的确定——戴氏霉新属的建立。基于ITS1-5.8S-ITS2 rDNA和18S rRNA序列拟青霉和一些近缘种的分子系统发育树分析表明，8个单瓶梗拟青霉与粪壳菌目有密切的亲缘关系。表型特征和分子系统发育综合分析，支持这些单瓶梗种作为一个新属成立。此属包括11个成员，其中3个新种，8个新组合。[3]环链拟青霉菌株间的遗传多样性。作者对收集到的16个菌株测定了ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列和从Genbank得到的3株共19株环链拟青霉序列进行比对，构建了系统发育树。结果表明，19株环链拟青霉表现出了极高的遗传多样性，ITS1-5.8S-ITS2序列能较好地反应种内遗传差异。环链拟青霉菌株间遗传差异与地域有一定相关性。[4]中国拟青霉菌株间的分子系统学分析。基于61株拟青霉和相关菌的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列构建的中国拟青霉的系统发育树表明，拟青霉属的种类在演化上是多源发生的，交叉于肉座菌目和散囊菌目，涉及了其中多个科。[5]中间类型种的分子鉴定。用93株拟青霉以及属于散囊菌目中青霉属Penicillium，篮状霉属Talaromyces，衣丝霉属Byssochlamys和隐囊菌属Aphanoascus中的相关菌株构建了系统发育树，结果支持了之前已报道的3个新种的成立；发现待定菌株A18.1应是拟青霉的一个新种；菌株A62.1应是青霉属中的一个成员。待定菌株LN2.9，A40.1，A19.3和H3.1与所用的4个青霉都能明显区分开，与拟青霉聚在一起，且各自为一小分支，作者暂时把它们作为拟青霉属中的新分类单元。4．部分拟青霉菌株对小菜蛾致病性的初步研究本研究采用从土壤和罹病昆虫得到的部分拟青霉菌株和白僵菌共30株14种采用浸液法进行试验，得到如下结果：[1]感染症状表现。小菜蛾幼虫受所试白僵菌JYT12感染后，皮肤逐渐失去光泽，变为黄褐色。而受拟青霉菌株感染，死亡时虫体颜色不发生明显变化。这些受感染死虫若继续在25℃下保湿培养，整个虫体被白色菌丝和孢子粉覆盖；[2]不同供试菌株对小菜蛾的致病性差异。结果表明不同菌株间的致病性有明显差异，其中所试的25个菌株(83.33％)对小菜蛾有致病性。玫烟色拟青霉、环链拟青霉和球孢白僵菌是感染致死小菜蛾效果较好的叁种昆虫病原真菌。拟青霉同种不同菌株对小菜蛾的致病性也表现出很大差异。如环链拟青霉中的SL.8、SL.7、XS.1和XS.2四个菌株的效果最好，在所试条件下达到了100％的致死率；环链拟青霉8.02菌株效果最差，死亡率小于＜10％。来自土壤的菌株对小菜蛾无致病性或仅具微弱致病性。[3]不同菌株的环链拟青霉产孢量差别非常大。产孢量最高的环链拟青霉XS-1菌株(4.91×10~8／cm~2)比产孢量最低的环链拟青霉XSXY-4菌株(0.45×10~8／cm~2)高出11倍之多。产孢量与致病性之间有一定的正相关，产孢量高的致病性相对较高，而产孢量低的其对小菜蛾的致病率也较低。[4]环链拟青霉不同菌株的菌落形态大致可归纳为叁大类：[1]菌落隆起；[2]菌落表面花瓣状；和[3]菌落平展。初步观察说明各菌株间培养性状差异与其地理来源无明显相关性。不同菌株的菌落形态与产孢量有一定关系，菌落花瓣状，产孢量最大；对小菜蛾致病效果最好。菌落隆起次之；菌落平展的为最少。[5]菌落特征、产孢量和对小菜蛾的致病性在基于ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列构建的系统发育树中能表现出一定的相关性。
向梅春[4]2006年在《明尼苏达被毛孢（Hirsutella minnesotensis）相关种分类及其分子生态学研究》文中提出植物寄生线虫是重要的植物病原物，给农业生产造成巨大的损失，生物防治是控制植物寄生线虫的有效途径之一。但是，植物寄生线虫生防菌剂的研发和应用受到了一定程度的限制，主要原因是缺乏高效的生防资源、对生防菌剂的生态学缺乏了解等。大豆胞囊线虫病是大豆生产上最重要的病害，造成的损失几乎等于其它病害损失之和，洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)和明尼苏达被毛孢(H.minnesotensis)是目前发现的两种重要的线虫内寄生菌，不仅在自然条件下对大豆胞囊线虫起着重要的控制作用，而且是具有广泛应用前景的生防资源。本研究对食线虫被毛孢及其相关种进行了分类研究；建立了明尼苏达被毛孢实时荧光定量PCR检测体系；将实时荧光定量PCR检测方法应用于田间土样明尼苏达被毛孢的检测；实时荧光定量PCR结合寄生率测定方法，研究土壤因子对明尼苏达被毛孢在土壤中的定殖和寄生活性。 线虫内寄生被毛孢及其相关种的分类。线虫内寄生被毛孢不同种及菌株间存在着形态、致病性和遗传多样性，明尼苏达被毛孢与寄生螨类的汤普森被毛孢(H.thompsonii)在形态上极为相似，针对这些问题进行了形态学和rDNA ITS和MAPK基因分析研究，发现寄生腐生线虫的被毛孢新种--线虫被毛孢(Hirsutella vermicola sp.nov.)。该新种与洛斯里被毛孢的区别主要是产孢细胞顶部呈螺旋状，对植物寄生线虫不寄生或寄生性很弱。同时证明汤普森被毛孢的叁个变种划分不成立，修订了汤普森被毛孢种的特征，进一步证明明尼苏达被毛孢与汤普森被毛孢是完全不同的种。 明尼苏达被毛孢实时荧光定量PCR体系。明尼苏达被毛孢是我国大豆胞囊线虫幼虫最重要的寄生菌，可能是我国大豆胞囊线虫自然衰退的主要生防因子，通过对明尼苏达被毛孢rDNA ITS区分析，设计出特异性的上游引物5’-GGGAGGCCCGGTGGA-3’和下游引物5’-TGATCCGAGGTCAACTTCTGAA-3’以及TaqMan探针5’-CGTCCGCCGTAAAACGCCCAAC-3’，通过PCR反应体系优化、专化性和孢子灵敏度测定，建立了特异性的对土壤中明尼苏达被毛孢定量测定的实时荧光定量PCR体系，并且理论上能够检测到4个孢子／g土。 实时荧光定量PCR方法对田间土样的检测。利用建立的实时荧光定量PCR方法结合幼虫寄生率分析，对采自黑龙江省大豆田的20份土样进行了研究，在9份土样中分离到明尼苏达被毛孢，3份土样既没有幼虫寄生也没有检测到明尼苏达被毛孢的DNA，在有真菌寄生的17份土样中，6份土样能够检测到明尼苏达被毛孢，包括了所有幼虫寄生率大于10％的5份土样。这些结果证明实时荧光定量PCR能够定量检测自然土壤样品中的明尼苏达被毛孢，与寄生率分析存在
任文彬[5]2007年在《淡紫拟青霉E2-4生防效果分析及其根癌农杆菌介导的遗传转化》文中研究指明目前随着化学农药的过度施用,给环境和人类健康带来极大的危害,因此开展生物防治的研究和应用,正受到世界各国的广泛重视。在开发的众多生防微生物中,生防真菌在生物防治,特别是植物病原物防治方面,起着十分重要的作用。生防真菌因其对环境和人、畜无毒等优点,有着化学农药不可取代的优势。淡紫拟青霉不仅是一类具有极大生防潜力的线虫寄生真菌,同时也是一种有效的昆虫病原真菌。为了充分的利用淡紫拟青霉这一生防资源,本实验通过遗传工程,对淡紫拟青霉E2-4进行了改良,获得了毒力效果有显着提高的工程菌株。具体的实验内容如下:以本实验室筛选和保存的淡紫拟青霉E2-4为原始出发菌株,首先对其进行了一系列的毒力试验。本文通过测定不同浓度的淡紫拟青霉E2-4孢子悬浮液对线虫卵囊孵化的影响发现,低浓度的孢子悬浮液(10~4个/mL)处理线虫卵囊后,线虫的孵出数还高于对照在清水的条件下所孵出的线虫数;随着孢子悬浮液浓度的增加,线虫卵囊孵化的线虫数开始有明显的减少趋势,孢子悬浮液浓度为10~5、10~6、10~7、10~8个/mL时对线虫卵囊的相对抑制率分别为21.72%、42.21%、49.19%和54.95%;孢子浓度为10~6、10~7、10~8个/mL时对线虫卵囊孵化的抑制作用与对照处理相比存在极显着差异。在体式显微镜下观察10~7个/mL孢子液处理的卵囊,可见在卵囊表面萌发出大量菌丝,将卵囊层层裹住,抑制了线虫的孵化。本研究采用液固两级发酵法,以大豆粉为液体培养基,以大米为主要固体基质制备了淡紫拟青霉E2-4的固体菌剂;并在此固体发酵的基础上研究了加入诱导物后对E2-4产孢量的影响;结果显示在大米中加入几丁质和壳聚糖这两种诱导物后孢子产量分别可增至4.15×10~9和2.37×10~9个/mL,均有利于提高E2-4的产孢量,使用制备的E2-4固体菌剂对番茄根结线虫病进行小量盆栽试验,发现E2-4对番茄根结线虫防治效果较好,与对照相比:长势明显优于对照,茎和叶变褐、枯萎等症状较少,且根部根结极少。同时,本实验还测试了E2-4对蚜虫的毒力,结果表明:不同孢子浓度对蚜虫的致死率存在一定的差异;孢子悬浮液浓度为10~4个/mL时对蚜虫的毒力不明显,与对照差别不大;孢子悬浮液浓度达到10~5、10~6、10~7和10~8个/mL后,毒力效果明显增强,尤其是高于10~5个/mL后的浓度,不但致死率高,而且死虫褐化程度也明显高于对照;从体式显微镜下观察死亡的虫体,可见用孢子悬浮液处理过的蚜虫体表长着一层绒毛状的菌丝。从光学显微镜下观察,触角等结节处可见有孢子和菌丝粘附在上面。通过研究试验表明:淡紫拟青霉E2-4对根结线虫和蚜虫均具有一定的生防能力。为进一步提高E2-4的毒力,使其更有效的应用于生防工作中,对其进行了农杆菌介导的遗传转化的改良。首先构建了含几丁质酶基因(chi)和GFP的淡紫拟青霉的表达载体。载体构建的方法为:在表达载体pCAMBIA 1302的基础上构建适合于淡紫拟青霉遗传转化的表达载体,先对pCAMBIA 1302的选择标记基因及其启动子进行第一步改造,构建pTBAR载体,然后再在这个载体的基础上插入外源基因(绿僵菌几丁质酶基因),构成pTBTCHI表达载体。构建的结果如下:通过PCR方法从pC30RG载体中扩增得到Trpc启动子,将适用于真菌表达的启动子Trpc替换pCAMBIA 1302中靠近左边界位于选择标记潮霉素基因上游的Camv 35S启动子;再根据设计的保守引物通过PCR方法从pBHt2载体中扩增获得bar基因替换选择标记潮霉素基因,构成载体pTBAR;然后从绿僵菌HN1中扩增chi基因的开放阅读框,利用套迭PCR的方法将Trpc启动子与chi基因连接起来,组成一表达元件trpc-chi;利用BamH ?和HindШ酶切位点插入载体pTBAR中,构建成功pTBTCHI表达载体。通过电击转化将pTBTCHI表达载体导入根癌农杆菌GV3103中,并成功转化了淡紫拟青霉,对转化效率进行了优化。结果表明:在AS加入量为200μg/mL,淡紫拟青霉E2-4孢子浓度为106个/mL的转化条件下,在根癌农杆菌生长浓度OD_(600)为0.2-0.3左右时,在抗性筛选培养基上所出现的抗性转化子个数最多。根癌农杆菌浓度过低(OD_(600)≤0.1)和过高(OD_(600)≥0.3)时,转化出的转化子数较少;将共培养条件设定为乙酰丁香酮(AS) 200μg/mL,根癌农杆菌生长浓度OD_(600)值为0.2;孢子浓度除10~6个/mL浓度外其它的浓度均没有得到抗性转化子。浓度为10~4个/mL和10~5个/mL的条件下,共培养6天后仍没有抗性转化子长出;而浓度达10~7个/mL和10~8个/mL时,抗性选择培养基上的卫星菌落多,生长背景杂;将根癌农杆菌生长浓度OD600值定为0.2;孢子浓度定为10~6个/mL条件下,加了AS的处理在选择培养平皿上长出的转化子个数较为稳定,平均在40个左右。而在没有加AS的处理中,只有少量的转化子长出或没有转化子,且PCR检测均为假阳性。本实验共获得含chi基因的抗性转化子53个,转化子中绝大部分菌落型态与原始菌相似,只有少数与之有稍微的差别。从中随机选取抗性转化子11个进行bar基因的PCR检测,其中有6个扩增得到目的片段。通过荧光显微镜检测,阳性转化子可发出绿色荧光。对抗性转化子进行的Southern blotting检测也证明含chi基因的T-DNA已插入淡紫拟青霉中。随机选取10个阳性转化子,分析其几丁质酶活力。经Duncan多重比较分析:阳性转化子tchi001、tchi002、tchi007、tchi009、tchi021和tchi030的几丁质酶活表达水平与E2-4存在差异极显着;此6个阳性转化子测得的总蛋白含量与E2-4之间的差异也很显着(a=0.05)。再对其中两个几丁质酶表达活力相对较高的抗性转化子进行毒力测试,结果表明: tchi001抑制线虫卵孵化的速度明显快于E2-4与tchi007,抑制线虫卵孵化的能力也强于E2-4和tchi007,相对抑制率可达62.11%;而tchi007抑制线虫卵囊孵化的能力虽高于原始菌株,但不存在显着差异。对线虫的致死率试验结果显示:这叁个菌株与对照处理间存在极显着差异。分析还表明阳性转化子tchi001和tchi007之间的毒力分析没有显着差异。但是阳性转化子tchi001和tchi007的总体毒力均明显高于原E2-4菌株,它们对线虫的校正致死率都超过了60%,分别为75.67%和65.67%。
金娜[6]2016年在《红灰链霉菌HDZ-9-47生产技术及对土壤生物群落的影响研究》文中指出根结线虫Meloidogyne spp.是一类固着型植物内寄生线虫,分布广泛且危害严重,是威胁农业生产的重要病原物。生物防治作为一种安全有效手段在根结线虫防治中得到了广泛的研究和应用。红灰链霉菌Streptomyces rubrogriseus HDZ-9-47分离自根结线虫的卵,可寄生南方根结线虫M. incongnita的卵,产生具有杀线活性的代谢产物；在温室及田间试验中对南方根结线虫都有良好防治效果,开发前景较好。本文初步研究了HDZ-9-47防治南方根结线虫的机制及其发酵滤液中杀线化合物的理化性质,重点研究HDZ-9-47的产业化生产、储存、田间应用技术及其对土壤微生物群落的影响,从而为其产业化奠定基础。1、首先在体外及盆栽试验中研究了红灰链霉菌HDZ-9-47防治南方根结线虫的机制。体外实验结果表明HDZ-9-47具有几丁质酶及蛋白酶活性,透射电镜观察发现HDZ-9-47可寄生南方根结线虫卵。盆栽实验结果表明红灰链霉菌HDZ-9-47的代谢产物和孢子在防治南方根结线虫上都发挥了重要的作用；此外施用红灰链霉菌HDZ-9-47可以促进番茄根部防御酶活性增加,进而诱导番茄产生抗性,并且可以提高番茄产量及果实中可溶性糖的含量。2、研究了红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液中杀线化合物的特点：分子量大于3 KDa、对蛋白酶敏感、对酸碱稳定,耐高温和紫外线照射；对不同属线虫的致死率不同；可有效地抑制小麦全蚀病菌的菌丝生长。在盆栽试验中,对小麦全蚀病的防效与化学农药立克秀的防效相当。3、用单因素和正交法优化了红灰链霉菌HDZ-9-47工业培养基组成,筛选出了适合其大规模生产,活性高,价格低廉的工业培养基SPR-2。将HDZ-9-47接种到SPR-2中在160 rpm,28。C培养3天后,发酵滤液稀释50倍后对南方根结线虫二龄幼虫的致死率达90%以上,发酵液中的孢子量达108/ml。在50 L发酵罐上小试发酵技术,并优化发酵参数。工作体积为30 L,接种量为3%,温度为28。C,罐压0.2 MPa,通气量2 L/min,起始转速300 rpm,溶氧>35%,发酵周期72 h。红灰链霉菌发酵滤液在稀释40倍时对南方根结线虫二龄幼虫的致死率达90%以上,孢子量可达1010/ml。4、红灰链霉菌HDZ-9-47孢子在以草炭灰为载体,常温、含水量5%的条件下储存12个月后,孢子量较初始菌量增加一个数量级,达108个/g。但是发酵滤液储存4个月后活性显着下降。5、田间试验表明,SPR-2培养的红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液可有效地防治番茄上的南方根结线虫病,防效达48%以上；HDZ-9-47发酵液和福气多结合施用可在作物生长前期提高HDZ-9-47防效,减少福气多用量,但是在作物生长后期,其防治效果和单独施用HDZ-9-47相当；虾壳可将HDZ-9-47的防效提高10%左右；HDZ-9-47与土壤生物熏蒸联合应用在防治南方根结线虫病上具有协同增效作用,两者联合应用的防效达67%以上,较单独施用提高19%,且其防效高于化学农药福气多：不同生物熏蒸材料和HDZ-9-47结合的防效相近。6、用平板培养法和变性梯度凝胶电泳PCR-DGGE法研究了红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液与土壤生物熏蒸联合施用对土壤微生物群落的影响。结果表明生物熏蒸后施用HDZ-9-47发酵液增加了土壤中有益细菌、真菌和放线菌的数量和种类,降低土壤中病原真菌的数量和种类,提高了土壤真菌多样性,从而有助于红灰链霉菌HDZ-9-47和生物熏蒸对南方根结线虫的防治。
赵海龙[7]2015年在《少孢节丛孢菌胞外蛋白酶基因的克隆、表达及生物学活性研究》文中指出动物寄生线虫病是一类给畜牧业造成严重危害的寄生虫病。长期以来,用化学药物驱虫是控制寄生虫危害的主要手段。然而,随着化学药物的长期使用,虫体的抗药性、药物残留及环境污染等弊端日益凸显,因此迫切需要寻找一种防控动物线虫病的新方法。利用线虫的天敌--食线虫真菌的生物拮抗作用来防控动物线虫倍受关注,其中食线虫真菌侵染线虫的分子机制是研究热点。目前,已经鉴定了食线虫真菌的多种侵染性分子(毒素、胞外酶、病原物激素、病原物胞外多糖等),其中胞外酶(丝氨酸蛋白酶、几丁质酶等)与致病性密切相关,该类酶在降解线虫体壁组分、摄取营养和消解线虫机械屏障中起重要作用。本研究对新疆伊犁采集来的土样进行捕食线虫性真菌的分离、培养和鉴定,并以具有强捕食线虫活性的少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1为研究对象,对捕食线虫性真菌侵染性胞外蛋白酶基因进行了克隆和生物信息学分析;将丝氨酸蛋白酶P186基因克隆入酵母表达载体中,在毕赤酵母系统诱导表达,对表达的重组蛋白酶开展了杀线虫活性分析。通过上述研究,初步揭示了少孢节丛孢菌XJ-A1株在侵染线虫过程中分泌的毒力因子P186的分子特征,分析了重组蛋白酶reP186酶学特性并测定了其杀线虫活性,为研制防控家畜消化道线虫病的新型蛋白酶生防制剂奠定了理论基础。研究方法和主要结果如下:1.少孢节丛孢菌的分离鉴定和侵染性胞外蛋白酶基因的克隆及分子特征分析采用玉米粉琼脂培养基(CMA)培养分离伊犁地区土壤中的捕食线虫性真菌,通过对纯化后菌株的形态学观察和分子生物学分析,鉴定出1株少孢节丛孢属真菌。对少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1丝氨酸蛋白酶家族基因P12、P186、P233和几丁质酶基因AO-483、AO-801进行了扩增、克隆及测序,对其编码蛋白信号肽、疏水性与亲水性、高级结构、功能域进行预测和分析。结果显示,3个不同的丝氨酸蛋白酶均含有信号肽和天冬氨酸(D)、组氨酸(H)和丝氨酸(S)叁个活性位点,表明它们均属于胞外分泌性Subtilase家族;同时,都含有2个潜在的N-糖基化位点及2个与底物结合的S1区。系统发生分析发现,P12、P186和P233与其他不同地域、不同种属的丝氨酸蛋白酶基因亲缘性较远。2个不同的几丁质酶均含有催化区保守序列SXGG和DGXDXDWE,属于几丁质酶糖苷水解酶18家族,无信号肽序列,表明这2个蛋白为非分泌型蛋白;二级结构以无规则卷曲、α螺旋和β折叠为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构。系统发育分析表明,几丁质酶AO-801和AO-483与昆虫病原真菌几丁质酶的的亲缘关系更为接近。2.少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶P186在毕赤酵母中的表达及鉴定通过RT-PCR方法从少孢节丛孢菌中扩增丝氨酸蛋白酶基因P186 cDNA序列,分别克隆至原核表达载体pET32a和真核表达载体pPIC9K中,并在大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115菌株中进行了表达。成功构建了重组表达质粒pPIC9K-P186,线性化后电击转化表达宿主毕赤酵母GS115。经过PCR、表型及G418抗性筛选,获得了具有G418抗性(2.0 mg/m L)且表型为His+Mut+的阳性重组酵母转化子,阳性转化子经1.5%甲醇诱导培养72h,重组蛋白酶(reP186)的酶活性达到最大(13151U/mg蛋白);在毕赤酵母中表达的重组蛋白酶P186分子量约为32kDa。用纯化的大肠杆菌表达产物免疫小鼠,制备了抗P186抗体来检测酵母表达的重组蛋白,Western blot分析显示在相应位置出现特异性印迹条带,表明丝氨酸蛋白酶P186在毕赤酵母中成功表达。3.重组丝氨酸蛋白酶的纯化和生物学活性研究重组毕赤酵母发酵液通过离心、超滤浓缩、His-Bind层析柱纯化等步骤分离获得纯化的重组蛋白酶reP186后进行了生物学活性研究。结果显示,该蛋白酶的底物范围较宽,专一性不强,对酪蛋白的水解活性较高,对BSA、明胶、变性胶原和线虫表皮的水解活性呈中度,对胶原的水解活性最低。在20~55℃范围内纯化蛋白酶水解底物的酶活性随温度递增而逐渐增加,在55℃时达到最大值,即最适反应温度为55℃,且温度在20~50℃之间酶的活性相对稳定,但重组蛋白酶在70℃孵育30min时几乎失活;重组蛋白酶P186在pH 6.0~10.0之间酶活性表现最稳定,且在pH 8.0时显示出最大酶活性;纯化的重组蛋白酶与金属离子螯合剂EDTA作用后,酶活性几乎没有受到影响,但对丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和SSI高度敏感。用重组丝氨酸蛋白酶P186分别处理C.elegans和H.contortus12h、24h、36h后,纯化的重组蛋白酶对C.elegans的杀灭率为62%、88%、100%,对H.contortus的杀灭率为52%、65%、84%。与对照组中相比,虫体死亡率差异显着。两虫经蛋白酶孵育12h后被固定,线虫角质层开始被降解;孵育24h后,线虫的体壁组织大部分被降解;孵育36h后,线虫的体壁和大部分体内组织被降解,而对照组线虫体壁无明显变化。
参考文献：
[1]. 食线虫菌物被毛孢种内形态、致病性及遗传变异研究[D]. 向梅春. 湖南农业大学. 2003
[2]. 明尼苏达被毛孢对大豆胞囊线虫作用的研究[D]. 钱洪利. 东北林业大学. 2009
[3]. 中国拟青霉属的系统学及部分菌株的致病性研究[D]. 韩燕峰. 贵州大学. 2007
[4]. 明尼苏达被毛孢（Hirsutella minnesotensis）相关种分类及其分子生态学研究[D]. 向梅春. 湖南农业大学. 2006
[5]. 淡紫拟青霉E2-4生防效果分析及其根癌农杆菌介导的遗传转化[D]. 任文彬. 华南热带农业大学. 2007
[6]. 红灰链霉菌HDZ-9-47生产技术及对土壤生物群落的影响研究[D]. 金娜. 中国农业大学. 2016
[7]. 少孢节丛孢菌胞外蛋白酶基因的克隆、表达及生物学活性研究[D]. 赵海龙. 石河子大学. 2015