（柳州市妇幼保健院医学遗传科/柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室 广西 柳州 545001）
【摘要】 目的：对曾经生育脊髓性肌萎缩症(SMA)患儿家系及正常产检夫妇筛查同为SMA携带者的孕妇进行产前诊断。方法：5个曾生育过SMA患儿的家系和1对SMN1基因筛查拷贝数为1的夫妇，抽取夫妇双方外周血及分离羊水细胞提取DNA，采用多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术检测夫妇双方及胎儿的运动神经元生存基因(SMN1)拷贝数。结果：6个家系的父母双方SMN1基因7、8外显子均为杂合性缺失，为SMA携带者。5个家系的胎儿SMN1基因7、8外显子拷贝数与父母相同，为SMA携带者；1个家系的胎儿SMN1基因7、8外显子拷贝数为0，为SMA患者。结论：MLPA技术为一快速而可靠的基因检测及定量分析方法，可准确检测SMN基因及脊髓性肌萎缩症修饰基因的缺失突变并分析基因拷贝数，适用于脊髓性肌萎缩症患者、携带者的基因诊断及产前诊断。
【关键词】 脊髓性肌萎缩；SMN基因；多重连接依赖性探针扩增；产前诊断
【中图分类号】R714.55 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）27-0048-03
prenatal diagnosis of spinal muscular atrophy by multiplex ligation dependent probe amplification
Tan Jianqiang, Luo Shiqiang,Wang Yuanliu, Yang Fanghua, Liu bailing, Cai Ren.
Liuzhou Maternal and Child Health Hospital, Liuzhou, Guangxi 545001, China
【Abstract】 Objective To investigate the value of multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA) method in the prenatal diagnosis of spinal muscular atrophy (SMA).Methods Six SMA pedigrees, which included 12 parents and 6 fetuses. MLPA was used to detect the survival motor neuron (SMN) and other modifier genes, according to steps of hybridization, ligation, PCR reaction, fragment separation by capillary electrophoresis and peak pattern evaluation. The DNA samples of fetuses were collected by centrifuging the amniotic fluid as well as derived from amniotic cell culture. Results According to MLPA, 6 fetuses were detected to carry homozygous deletion of survival motor neuron 1 (SMN1) gene.In addition, 12 parents and 5 fetuses carried one copy of SMN1 gene，and 1 fetus not carried copy of SMN1 gene .Conclusion MLPA can detect the deletion and quantify the copy numbers of SMN and other modifier genes, improving the efficiency and stability of genetic diagnosis. It is adequate for detecting patients and carriers of SMA, as well as providing reliable evidence for genetic counseling.
【Key words】Spinal muscular atrophy;SMN gene;Multiplex ligation dependent probe amplification;Prenatal diagnosis
脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一种常染色体隐性遗传性疾病，儿童型发病率约为1/6000～1/10000，致病基因携带率为1/35～1/80，居儿童致死性常染色体遗传病的第二位[1]。该病是以脊髓前角细胞变性导致肢体近端对称性、进行性肌无力和萎缩为表现的一种神经肌肉疾病。SMA属常染色体隐性遗传，其致病基因运动神经元生存(survival motor neuron，SMN)基因有2个高度同源拷贝SMN1和SMN2。SMN1是SMA的致病基因，是主要功能基因，SMN1基因纯合缺失是该病的主要原因；SMN2为修饰基因，影响病情严重程度。研究表明90%以上的患者外显子7、8纯合缺失，其余为杂合缺失、点突变或SMN1基因转化为SMN2基因[2-4]。大部分健康人SMN1拷贝为2(每条5q13上各一个，即1+1型)，杂合缺失的患者SMN1拷贝数为1，纯合缺失的患者SMN1拷贝数为0。本研究采用多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)，对脊髓性肌萎缩症6个家系胎儿进行SMN1基因拷贝数检测，评估生育患儿的遗传风险，通过产前诊断降低SMA患儿的出生率。
1.对象与方法
1.1 对象
收集2014—2016年在柳州市妇幼保健院医学遗传科门诊就诊的6个脊髓性肌萎缩症家系，包括12名父母、6例胎儿的临床资料。其中，家系1～5均曾生育1例患者，家系6未生育患儿，但夫妇双方筛查为SMN1基因7号外显子杂合缺失携带者。
1.2 方法
1.2.1 DNA制备 根据知情同意原则，采集患儿父母的外周静脉血2ml EDTA抗凝处理，孕妇于19～22周进行羊膜腔穿刺术取羊水10ml，分取羊水细胞常规酚氯法提取DNA。
1.2.2多重连接依赖性探针扩增分析 （1）多重连接依赖性探针扩增及检测：MLPA P021试剂盒（荷兰MRC-Holland公司）共包含37对探针，可以特异性检测SMN1与SMN2基因第7、8号外显子，SMN基因第1、4、6号外显子，以及SMN基因邻近基因如NAIP、BTF2p44和H4F5基因；此外，还包括21对内对照物探针[5]操作方法参照文献[6]进行。（2）MLPA数据分析：采用Genemapper3.0软件分析毛细管电泳分离结果，并导出图型及数据计算拷贝数。根据荷兰MRC-Holland公司官方网站（http://www.mlpa.com）提供的拷贝数分析[7]，拷贝数比值范围在0.30～0.80为1拷贝，0.80～ 1.24为2拷贝，1.24～1.60为3拷贝。若某一片段无峰信号即代表该片段缺失。当拷贝数比值临近波动范围边界时，进行重复验证以确保结果准确。
2.结果
2.1 STR分析排除羊水母血DNA污染。
2.2 MLPA 检测结果
家系1～5父母双方SMN1基因7、8外显子相对拷贝数比值小于0.7，表明父母双方SMN1基因7、8外显子杂合性缺失，为SMA携带者；羊水细胞检测结果显示胎儿SMN1基因7、8外显子杂合性缺失，胎儿为SMA携带者。家系6的父母双方SMN1基因相对拷贝数比值小于0.7，表明家系2父母双方均为SMA携带者；羊水检测结果显示胎儿SMN1基因7、8外显子杂合性缺失，为SMA患者。部分家系MLPA检测结果见图1。
2.3 妊娠干预及随访
6个家系中1例胎儿为SMN1 基因纯合缺失，其结果表明家系Ⅳ中的胎儿亦为脊髓性肌萎缩症患者，家属选择终止妊娠。其余5例胎儿SMN1基因拷贝数均为1，为脊髓性肌萎缩症携带者，由于携带者无任何临床症状，其家属选择继续妊娠并分娩，出生后随访至今未出现临床症状。
3.讨论
脊髓性肌萎缩症是一种由于脊髓前角细胞变性引起肌无力和肌萎缩的神经退行性疾病，属常染色体隐性遗传。目前，SMA无有效治疗方法，因而携带者的筛查尤为重要。传统方法诊断SMA主要依靠临床表现、肌电图、病理检查等。近年来，随着分子生物学研究的深入，目前对该病的诊断已深入到基因水平。1995年Lefebvre S等[8]在5q13上分离克隆出SMN基因，目前已明确SMN1为该病的致病基因，SMNl纯合缺失是引起脊髓性肌萎缩症的主要原因。脊髓性肌萎缩症为严重致残致死性神经系统遗传性疾病，目前临床上尚无肯定而有效的治疗方法，因此产前诊断成为一种有效的预防干预手段。研究报道表明，MLPA技术能够准确地检测SMN1基因缺失情况，而且通过毛细管电泳检测后获得的峰型图可直观判断SMN1基因缺失情况，MLPA技术用于产前诊断可为脊髓性肌萎缩症家系提供准确而可靠的遗传咨询和优生优育指导。相比传统技术，MLPA有以下优点：（1）MLPA仅利用一对通用引物，在同一反应管中可同时扩增脊髓性肌萎缩症相关的多个基因[9]，有利于明确基因缺失的具体范围，在探讨基因型与临床表型的关系中具有明显优势。此外，还明显减少了DNA模板用量，从而提高了实验效率。（2）MLPA能对脊髓性肌萎缩症的致病基因进行定量分析，可准确诊断脊髓性肌萎缩症患者、检测携带者，在产前诊断中也具有明显的优势。（3）MLPA含有众多内对照探针，包括脊髓性肌萎缩症相关基因内及基因外的对照序列，对DNA模板不需精确定量，实验结果准确性高、可重复性良好。
本研究利用MLPA方法共分析6个脊髓性肌萎缩症家系成员SMN基因，研究结果显示，5例胎儿为脊髓性肌萎缩症携带者，其将来的后代患病风险明显高于普通人群，有必要对其进行长期随访并为其成年后的婚育提供遗传学指导。6个家系中的父母SMN1基因定量分析，发现其中一个家系父亲SMN1基因拷贝数为1，母亲SMN1基因拷贝数为2，但曾生育过SMA患儿，患儿基因型为SMN1基因7、8号纯合缺失，推测母亲应为“2+0”型的脊髓性肌萎缩症携带者，即1条染色体含2个拷贝SMN1基因，另1条缺失SMN1基因。文献报道，约4%人群为1条染色体上有2个拷贝的SMN1基因[10]。有文献报道，SMN1基因缺失可向SMN2基因转化，此时SMN2基因拷贝数相应增加，由于在SMN1基因缺失的情况下SMN2可表达部分全长蛋白以代偿SMN1基因的功能，因此临床症状相对较轻[11]。在我们前期的4931例正常产检孕妇SMA携带者筛查中发现61例SMA携带者，SMNl缺失产生的携带者为47例，占携带者总数的77%；SMN1转换产生的携带者为14例，占携带者总数的23%。目前SMN2基因已被普遍认为是SMA的修饰基因，其拷贝数的多少与SMA的病情严重程度及发病时间显著相关[12]。因此，SMNl和SMN2的拷贝数关系可为今后的遗传咨询工作提供理论依据，也为探讨致病的分子机制提供有力的依据[19]。
综上所述，MLPA技术简便、可靠,不仅能快速地检测出SMN基因外显子的缺失、重复情况，还能进行半定量分析，以对患者进行诊断，对携带者进行筛查,有效地降低了SMA患儿的出生率，对出生缺陷预防和人口优生优育有着十分重要的意义。
图1 ①②箭头所指示父母为SMN1基因7、8外显子杂合缺失③箭头所指示胎儿SMN1基因7、8外显子纯合缺失④⑤箭头所指示父母为SMN1基因7、8外显子杂合缺失⑥箭头所指示胎儿SMN1基因7、8外显子杂合缺失
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基金项目：柳州市科学研究与技术开发计划课题（2014J030420），柳州市科学研究与技术开发计划项目研究成果资助（2014G020404）
论文作者:谭建强,罗世强 王远流,杨芳华 刘百灵,蔡稔（通讯作者
论文发表刊物:《医药前沿》2017年9月第27期
论文发表时间:2017/9/21
标签：基因论文; 脊髓论文; 携带者论文; 家系论文; 缺失论文; 肌萎缩论文; 胎儿论文; 《医药前沿》2017年9月第27期论文;