黑龙江省佳木斯市妇幼保健院 154002
摘要：目的 研究并探讨儿童遗传性耳聋基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA基因直接测序异常结果。方法 分析48例GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA直接测序法的异常结果。结果 GJB2基因发现4个突变位点，包括：79G>A、341A>G、109G>A和235delC，12sRNA发现三个突变位点，即：1382 A>C、1438A>G、1555A>G，SLC26A4和GJB3基因均未见突变；突变频率最高的突变位点是GJB2 79G>A和12sRNA 1438 A>G，其次是GJB2 341A>G。结论 GJB2和12sRNA基因可能是黑龙江省最常见的致聋基因，两个基因的热点突变与国内其它地方报道的有差异。
关键词：遗传性耳聋；测序；GJB2；SLC26A4；GJB3；12srRNA
Objective to study and explore the abnormal results of genetic direct deafness gene GJB2，SLC26A4，GJB3 and 12srRNA genes in children's hereditary deafness genes. Methods the abnormal results of 48 cases of direct sequencing of GJB2，SLC26A4，GJB3 and 12srRNA were analyzed. Results the GJB2 gene found 4 mutations，including：79G>A，341A>G，109G>A and 235delC，12sRNA found three mutations，namely：1382 A>C，1438A>G，1555A>G，SLC26A4 and GJB3 genes have no mutation；mutation mutation is the highest frequency of GJB2 79G>A and 12sRNA 1438 A>G，followed by GJB2 341A>G. Conclusion GJB2 and 12sRNA genes may be the most common deafness genes in Heilongjiang province. The hot spot mutation of the two genes is different from that in other places in China.
[Key words] hereditary deafness；sequencing；GJB2；SLC26A4；GJB3；12srRNA
耳聋是人类最常见的感觉神经系统缺陷。我国2008-2010年先天性障碍发病率分别为1.99‰、2.15‰和2.19‰，呈上升趋势。超过50%的儿童耳聋为遗传基因缺陷所致，在遗传性耳聋中70%以上为非综合征耳聋[1]。研究表明中国人的大部分非综合征性耳聋由几个主要基因的突变引起[2]，如GJB2、SLC26A4、12srRNA，新一代高通量测序技术的出现，提供了以数据为导向的新的遗传性疾病研究模式。然而耳聋基因突变有一定的地域和种群差异，我们利用直接测序法筛选中国人常见的4个耳聋候选基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA对48例儿童非综合性耳聋做了分析。
一、资料与方法
1.1.病例资料
此次研究的对象是选择48例听力障碍儿童，来自佳木斯市妇幼保健院耳鼻喉门诊，且在黑龙江省听力诊断中心诊断为听力障碍患儿。年龄1-14岁，平均年龄5.3岁，男28例，女20例。所有病例通过病史调查（包括家族史、耳聋史及耳毒性药物的使用情况等）和听力学检测证实为非综合性耳聋。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆听力损失程度根据纯听力图，分别计算双耳气导0.5KHz、1 KHz、2 KHz、4 KHz处的平均听阈，按WH O 标准进行分类：听力正常：≤25dBHL；轻度听力损失：26～40 dBHL；中度听力损失：41～70 dBHL；重度听力损失：71 ～90 dBHL；极重度听力损失：>90 dBHL。所有患者家长均签署知情同意。
1.2.研究方法
1.2.1.试剂与仪器
血液基因组DNA提取试剂盒及测序试剂均来自深圳华大基因医学有限公司，定性PCR仪为BIO-RAD C1000 型；凝胶扫描仪为UVP EC3Imaging System；电泳仪为Bio-Rad产品；遗传分析仪AB3500型。
1.2.2.利用primer5.0和oligo7.0设计引物，引物经上海生工合，Page纯化。
1.2.3.标本采集与基因组DNA提取
采集静脉全血5ml，EDTA-K2抗凝，所有血样用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，保存于-20℃备用。
1.2.4.PCR扩增
PCR反应体系为：PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.75 μL，10pmol/μL引物各0.8μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板2 μL，加水至25 μL；PCR扩增条件：94 ℃ 2 min；94℃20 s，57℃ 20 s，72℃ 30 s，35 个循环；72℃ 5 min；4℃保存。
1.2.5.DNA测序
PCR 产物4μL 在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外观察为清晰明亮的目的扩增条带（无杂带），扩增片段用上、下游引物正反向分别测序。
二、研究结果
2.1测序结果突变类型
GJB2基因发现4个突变位点，包括：79G>A、341A>G、109G>A；12sRNA发现三个突变位点，即：1382 A>C、1438A>G、1555A>G。SLC26A4和GJB3基因均未发现突变。
2.2. 突变基因型、临床表型及突变频率
48例测序发现最常见的突变12sRNA 1438 A>G，和GJB2基因79G>A，其突变频率都达25.68%，其次是GJB2 341A>G，突变频率为18.92%，发现1例GJB2 79G>A、341A>G和12sRNA 1438 A>G复合突变。
三、讨论
随着人类基因组计划的实施和完成，耳聋致病基因的发现和克隆也取得了很大的进展，遗传性耳聋的致病基因及同一基因的突变位点在不同种族，甚至同一种族不同地区的人群中不尽相同，有很强的种族特异性。全国性耳聋分子流行病学调查显示我国感音神经性聋患者由几个主要基因主几热点突变引起，包括：GJB2基因（35delG、176del16、235delC、299delAT）、SLC26A4基因（2168A>G、IVS7-2A>G）、GJB3 基因（538C>T）以及12sRNA（1494C>T、1555A>G）等。我们设计合成的5对引物其PCR扩增片段包含了以上4个基因的热点突变位点。GJB2 基因是最常见的致聋基因，高达21. 01%的耳聋患者携带该基因突变；其次是大前庭水管综合征的责任基因SLC26A4，其在耳聋人群中的检出率占15% 以上；另外，对氨基糖苷类抗生素异常敏感而至聋的12sRNA 1555A>G 和1494C>T检出率分别3. 43% 和1. 03%。本文48例耳聋基因测序结果异常但临床表型正常的有4例，为先证者的兄弟（或姐妹），实际临床患有耳聋为42例，GJB2基因检出率为69.05%（29/42）；12sRNA检测出率为52.38%（12/22）。这和全国的调查结果有差异。
本文检出的GJB2 79G>A和341 A>G导致编码的第27 位和114位分别从缬氨酸突变为异亮氨酸和谷氨酸转变为甘氨酸，尽管有6例GJB2 79G>A和341 A>G临床表现为正常，但它和其它耳聋基因突变组成复合突变时临床表现中度或轻度听力损失，表明携带GJB2 79G>A和341 A>G突变对遗传性非综合征性耳聋的发生具有密切的相关性，对于非综合征性耳聋发病有较高风险，这与文献报道一致。
本文发现的GJB2 109G>A，12sRNA 1382A>C国内文献报道不明。GJB2 109G>A为突变杂合子，导致第37位缬氨酸突变为异亮氨酸，临床上表现中度听力损失，提示该位点突变为该病例的关键因素，其致病机制需要更进一步研究。12sRNA 1382A>C检出2例突变，其中1例与12sRNA 1555A>G组合成复合突变，临床上表现重度耳聋，2例均有氨基糖苷类抗生素用药史，提示该位点亦是导致药物性耳聋的作用靶点。
参考文献：
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论文作者:勾晶,严铁明,彭菲
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第28期
论文发表时间:2018/3/14
标签：突变论文; 基因论文; 听力论文; 遗传性论文; 综合征论文; 引物论文; 发现论文; 《中国误诊学杂志》2017年第28期论文;