程坚[1]2001年在《表达和共表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒》文中研究说明H9亚型禽流感病毒（AIV）近年在我国部分地区广泛流行，给养禽业造成了严重的经济损失。油乳剂全病毒灭活苗虽对该亚型禽流感的控制发挥了重要作用，但由于其存在干扰免疫监测及成本较高等缺点，使用受到了限制。为了研制新型禽流感疫苗以克服上述缺点，我们对H9亚型AIV中国分离株的血凝素（HA）基因和鸡Ⅱ型干扰素基因（IFN-Ⅱ）进行了克隆、测序和分析，构建了表达HA基因及共表达HA基因和鸡IFN-Ⅱ基因的两种重组鸡痘病毒（rFPV-HA、rFPV-HA-IFN-Ⅱ），并测定了它们的免疫效力。1 H9亚型AIV中国分离株HA基因cDNA的克隆及序列初步分析 以酚-SDS法提取H9N2亚型AIV中国分离株A/Chicken/China/F/1998（简称F株）的基因组RNA，以此为模板，采用cDNA合成法及反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增到长度分别为1.1Kb和0.8Kb的两段HA基因片段。测序结果表明，这两个片段覆盖了HA基因的完整阅读框架，且在它们的重迭区有单一的PstⅠ酶切位点。利用这一酶切位点，将这两个片段连接成插入在质粒pUC18的HindⅢ和SalⅠ位点之间的全长HA基因，得重组质粒pUCHA。测定pUCHA位于HindⅢ和SalⅠ位点之间外源片段的核苷酸序列。 本研究获得的HA基因片段共有1708个核苷酸，包含了HA完整的阅读区的1680个核苷酸，推测其编码560个氨基酸，其中前18个氨基酸为信号肽序列，其余542个氨基酸组成的前体蛋白在第320位氨基酸处被切割为HA1和HA2多肽。F株HA裂解位点的氨基酸序列为RSSR↓GLF，不含连续的碱性氨基酸，具有低致病性AIV HA裂解位点的特征。F株与H9亚型AIV原型毒株A/Turkey/Wisconsin/1/66（H9N2）的HA基因的同源性较低，氨基酸和核苷酸的同源性分别为84.1％和82.9％。n 扬州大学博士学位论文 以 HAI CDNA的 55－1004 n酸为基元，建立 1992－1999年间 HgNZ亚型 AIV中国及绷边国家和地区分离株的遗传发生树。结果表明，近年来在这一地区流行的HgNZ亚型AJV招可敞为叁憎系，同一谱系内，毒株间HA艄酸的同源性在95％以上。F株与髓地区的部分俯株及94年北京分离株的亲龈系较近，形成谱系卜 香港地区的另一些分离株和巴基斯坦分离株形成谱系2，它们与某些南美分离株的亲缘关系很近；与谱系1的亲缘关系也较近，它们之间HA核昔酸的同源性在 gi％R右；韩国分离株形成的谱系 3，该谱系与谱系 1、二的亲缘关系很远，它们之间HA核昔酸的同源性只有83％左右。2 表达HA辜因的直组鸡痘病霉的构巨 以 Hnd皿及 Sal消化PUCHA，得到 1．7Kb的 HA基因片段，将n向插人FPV插入载体 11 75的 Hnd Ill和 Sal位点之间，使之处于痘苗病商启动子 P7．5的下游，得到转移删 11 75HA。按常规的B眠脓染方法将其转染至已感染 FPV中国疫酣282E4（Wt郴）的鸡胚成纤测胞（CEF），通过筛选蓝色的病毒腑获得并纯化重组鸡痘病毒uV－HA。以PCR ＄＄1；ill实，dq，v－HA基因组中插有HA基因：以间接兔疫荧光肌实，fPV－HA感染的C扭釉了HA。3 表达鸡IFN－H羹因的匣组鸡痘病羹的钩 来达产物的生物活性 根据已发表的鸡 WN0基因序列，设计一对5！物，以 RTPCR方法从经 Con A刺激的鸡脾脏细胞中扩增出全长的鸡IFN二基因的cDNA序列。将扩增的基因片段定向插人质粒 AF09的 Sal和 Hnd IH位点之间，使其位于痘苗病毒早晚期启动子PEI的下游。 根据启动子 P肌的序列设计上游引物，鸡 IFNl基因的 cDNA 3 M列设计．下游5！物，以PCR法扩增包含痘苗病毒早晚期启动子PM在内的鸡IFN刁的基因片段。经一系列步骤，将扩增片段定向插人 FPV JWA载体 11 75中，得到转移载体1175IFN，用以转染已感染tFPV的CEF，并按上述重组病毒的构建和纯化方法，获得插谰 rw－n基因的靴重赈毒 ev－r：w－11。在 rrnv－lrx－11中，rw－11基因处于PDe的转录调控下。 以细胞病鲫制W侧－IFNI感染的CEF越了具有抗水泡性口炎病毒（VSV）活性的鸡IFN刁。fPV－mI（M．O．H．m）感染CEF 72小时后，培养上清中 IFN刁的表达量为 1280 U／ITl。动物硼表明，接种 rFPV－IFN刁 天或14天后，其表达的 IFNJ可显着减轻载体鸡痘病毒对 1日龄 SPF tills｛＄重增长的 程坚：表达和共表达Hg亚型肖流感病毒HA基因和鸡！FN坝基因的重组鸡痘病毒 ＊ 抑制作用。 4A表达HA墓因和鸡HN－11基因的直组鸡扈清羹的构建 经一系列步骤，将IFN－11的基因及其上游的启动子PM插人含全长HAcDNA 的质粒pUCm中，得重组质粒PHAIFN。在PHAJFN中，HA基因和IFN刁基因 的3’糊邻。将串联在一起的HA基因和IFNJ基因（包含上游启动子Py）片 段切下，将其定向插人 FPV e载体 11 75中，得到转移狲 11 75HAIFN。在 11 75HAff：N中，HA基因和 IFN。11基因分别处于启动子 P7．5和 PWh的转录控制下， 且转录方向正好相对。在IFN－11基因3’端有一痘苗病毒转录终止子，可避免这两 个基?
陈素娟[2]2005年在《用不同鸡痘病毒载体构建单表达或双表达抗H5和H9亚型禽流感的重组疫苗及其免疫效力》文中指出禽流感(AI)和鸡痘是禽类感染疾病中比较严重的两种疾病,给养禽业造成了严重的经济损失。AI是由A型流感病毒(AIV)引起的一种禽类疾病,分为高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感(MPAI),近年来在我国部分地区广泛流行,对我国的养禽业危害严重。当前我国对禽流感的控制主要依赖常规疫苗的免疫接种,但常规疫苗的使用存在一些难以克服的缺陷,如影响疫情监测、生产成本高等。因此,我们构建了单表达H5N1亚型AIV血凝素(HA)基因的重组病毒、双表达H5N1亚型AIV的HA和神经氨酸酶(NA)基因的重组病毒及双表达H5N1和H9N2亚型AIV的血凝素基因(HA)的重组病毒。鸡痘病毒(FPV)基因组庞大,有严格的宿主范围,许多学者利用FPV不同的非必需区构建载体表达外源基因,在SPF鸡上都能得到较好的实验结果,但在很多种情况下在有母源抗体的商品鸡上实验效果不佳。为比较从两种不同非必需区的FPV载体得到的重组病毒在抵抗母源抗体干扰能力方面的差异,同时比较从不同毒力的鸡痘疫苗为亲本病毒得到的重组病毒在抵抗母源抗体干扰能力方面的差异,本研究分别利用含不同非必需区的两种FPV载体p11S和p12LS(复制非必需区分别为FPV7S和FPV1-2)以及282E4和大空斑两种亲本FPV构建重组病毒,在SPF鸡和商品鸡进行免疫保护试验,旨在筛选出在母源抗体阳性商品鸡群仍能提供有效保护的重组鸡痘病毒H5和H9亚型禽流感疫苗。 1.表达H5亚型AIV HA基因的重组FPV的获得及其遗传稳定性 以质粒pTH5A为模板,用PCR扩增出约为1.7kb的H5A基因。将其插入载体p11S和p12LS,获得转移载体p11SH5A和p12LSH5A。用GeneJammer~(TM)转染试剂将转移载体分别与wt-FPV_(LP)或wt-FPV_(282E4)共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),蓝斑筛选纯化得3个重组病毒rFPV_(Ly)-11 SH5A、rFPV_(Lp)-12LSH5A和rFPV_(282E4)-12LSH5A。以间接免疫荧光(IFA)证实,重组病毒能正确表达H5A蛋白。rFPVs在CEF上连续传10代,经蓝斑检测和PCR检测,表明所得的rFPVs均具有良好的遗传稳定性。
程坚, 刘秀梵, 彭大新, 刘红旗, 吴艳涛[3]2003年在《共表达H_9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力》文中研究说明为了构建更为安全有效的抗低致病性H9亚型禽流行性感冒 (流感 )的基因工程疫苗 ,将包含有H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素 (HA)基因、鸡Ⅱ型干扰素 (IFN Ⅱ )全长cDNA序列及调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子 (PE/L)的基因片段 ,定向插入鸡痘病毒转移载体 1175的痘苗病毒启动子P7.5的下游 ,得到HA和IFN Ⅱ基因分别处于P7.5及PE/L转录调控下的重组转移载体 1175HAIFN。以脂质体转染法将 1175HAIFN转染至已感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株 (wt FPV)的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中。 1175HAIFN与wt FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV HA IFN Ⅱ。通过在含X gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rF PV HA IFN Ⅱ。以间接免疫荧光法和细胞病变抑制试验证实 ,纯化的rFPV HA IFN Ⅱ感染的CEF能以非融合的方式同时表达HA和具有抗VSV活性的鸡IFN Ⅱ。动物试验表明 ,rFPV HA IFN Ⅱ能显着抑制静脉攻毒后 1日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒 ,且能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒 (rFPV HA)抑制 1日龄SPF雏鸡增重的副作用。
韦栋平[4]2004年在《共表达新城疫病毒融合蛋白基因和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力》文中指出新城疫是由副粘病毒科的新城疫病毒(Newcastle diseae virus，NDV)引起的一种烈性家禽传染病，它对我国养禽业的危害最为严重。低致病性H9亚型禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)是目前影响我国养禽业的主要AIV亚型，它对我国养禽业也已造成了严重的经济损失。当前我国对ND和H9亚型AI的控制主要应用常规疫苗的免疫接种。但是作为我国目前控制ND和H9亚型AI流行的重要手段，常规疫苗的免疫接种会干扰现有技术条件下的免疫监测和流行病学调查。而且油乳剂灭活疫苗使用后会引起严重应激，并且生产成本偏高等。为了研制一种可以克服上述缺点的新型载体联合疫苗，本研究用鸡痘病毒(Fowlpox viros，FPV)作为表达载体，构建了能够同时表达NDV融合蛋白(Fusion protein，F)基因和H9亚型AIV血凝素(Hemagglutinin，HA)基因的重组鸡痘病毒，并对其免疫效力进行了评估。 1．共表达NDV F基因和H9亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒的构建及其生物学特性鉴定 以酚-氯仿提纯NDV F48E8株的基因组RNA作为反转录聚合酶链反应(RT-PCR)模板，扩增出长度约为1.7Kb的NDV F基因片段，将其克隆入pGEM-Teasy载体，构建重组质粒pGEM-TF并进行测序确证；以质粒pUCHA为模板，用PCR扩增出约为1.7Kb的H9亚型AIV HA基因片段，将其克隆入pGEM-T easy载体，构建重组质粒pGEM-THA并进行测序确证。分别从pGEM-TF和pGEM-THA切下F基因和HA基因，通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的FPV基因组复制非必需片段，并使分别调控F基因和HA基因转录的鸡痘病毒启动子P_(E／L)和合成启动子P_S以反向方式连接，重组质粒命名为p7SHF。最后将P11-LacZ报告基因表达盒插入到质粒p7SHF中，获得转移载体pFPVHF，用以转扬州大学博士学位论文染经预先感染FPV 282E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞(CEF).通过在含有X.Gal的营养琼脂上挑选蓝色病毒蚀斑，经过多次蓝斑筛选和克隆纯化后，获得稳定生长的重组鸡痘病毒(rFPv一F一HA)。PCR和Southem一blot检测证实了F基因和HA基因已成功插入到FPV的基因组:间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。 比较rFPv一F一HA和wt一FPv在CEF上的繁殖滴度，结果发现两者在CEF中的繁殖滴度无显性着差异，提示载体病毒的复制能力并未因外源基因的插入而下降。将rFPV一F一HA在CEF上连续传代培养20代次后，蓝色空斑试验和PCR检测结果表明插入的F基因和HA基因均能够在病毒的传代过程中稳定遗传;间接免疫荧光试验证实第20代次的重组鸡痘病毒仍然能够正确表达F和HA蛋白，进一步表明了rFPv一F一HA具有良好的遗传稳定性。2.NOV「蛋白抗体的间接ELISA检测方法的建立及评估 用经过充分灭活的NDV F48E8株作为包被抗原，建立了检测由FPV载体介导表达的NDVF蛋白的抗体的间接ELJSA方法，并用动物试验进行了初步评估。以方阵滴定法确定抗原的最佳包被浓度为355n留孔，待检血清最佳稀释度为1:40。通过交叉试验、阻断试验和重复性试验证实所建立的间接ELisA方法具有高度的特异性和良好的可重复性。用该间接EUSA方法测定了20份阳性血清样品的P加值，并通过对该20份阳性血清的P/N值与ELisA抗体效价(ELISA titer， ET)的自然对数值(InET)的线性回归分析，获得了回归方程1 nET=0 .201 XP/N+4 .632，通过测定待检血清在l:40稀释度的P/N值，用方程直接求出血清的ELISA抗体滴度，可以实现定量检测。应用该间接ELISA方法对表达NDVF基因的重组鸡痘病毒免疫鸡群进行了血清抗体检测，结果表明，血清的间接ELISA抗体效价与中和试验所测定相应血清的中和抗体效价高度相关(P<0 .01)。攻毒保护试验结果显示，间接ELISA抗体效价和机体保护力之间表现一定程度的相关性。该方法的建立为后续试验评估表达NDVF基因的重组鸡痘病毒免疫鸡群的免疫效果提供了一种可靠的血清学方法。3.共表达NDVF基因和H9亚型AIVHA基因的重组鸡痘病毒的免疫效 力试验3.1试验鸡接种rFPv一F一HA后抵抗H9亚型Alv感染的免疫保护作用 7日龄SPF雏鸡随机分为4组，分别于颈部皮下接种rFPv一F一HA(104PFU/羽)、韦栋平:共表达NDVF基因和H9亚型AlvHA基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力iiirFPv一队(lo4PFu/羽)、wt一FPv(一o4PFu/羽)和Hg亚型Al油乳剂灭活疫苗(0.ZmL/羽)。免疫后7~21天，除wt一FPv外，各种疫苗均可诱生针对H9亚型Alv的特异性HI抗体。其中以油乳剂灭活疫苗诱生的HI抗体效价最高，而rFPv一F一HA诱生的Hl抗体效价与单表达队基因的rFPV一队诱生的HI抗体效价差异不显着。免疫后21天，各组试验鸡用剂量为107ELDS丫羽的Hg亚型川vF株滴鼻攻毒，并于攻毒后5天采集试验鸡的口腔棉拭子，按照常规方法处理后，接种10日龄SPF鸡胚作病毒分离试验。结果显示各组试验鸡的口腔排毒率为:wt一FPV免疫组(100%)、rFPV一F一HA免疫组(16.7%)、rFPV一队免疫组(16.7%)和油乳剂灭活疫苗免疫组 (16.7%)。 用含有残余抗NDV和H9亚型AIV母源抗体的26日龄商品蛋鸡进行免疫效力试验，结果发现，尽管由于母源抗体的干扰，rFPV一F一HA及rFPV一HA在商品蛋鸡体内诱生的HI抗体效价远低于?
刘益新[5]2010年在《表达虎源H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组犬2型腺病毒的构建与鉴定》文中研究说明[目的]目前,禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)在世界范围内多种动物中广泛流行,每一次严重的暴发都会造成巨大的经济损失。尤其是高致病性禽流感可导致高达100%发病率和较高的死亡率,且其可直接感染人并致人以死亡。其在生态学和公共卫生学方面的意义已引起全世界人们的广泛关注。禽流感(Avian Influenza,AI)在我国很多地区普遍存在,并造成了严重的危害。为了减少损失,为我国在禽流感疫苗方面的进一步研究提供有力的基础,本研究构建能够表达虎源H5N1亚型流感病毒HA蛋白的重组犬2型腺病毒(canine type 2 adenovirus,CAV-2),其可以作为常规免疫,降低禽流感疫情的发生,增强我国禽流感的防控能力。[方法]应用常规分子生物学方法,构建能够表达A/Tiger/Harbin/132/2007 HA基因的真核表达载体pCAGGS-HA;运用间接ELISA和间接免疫荧光的方法检测其在哺乳动物细胞BHK-21中的瞬时表达情况；将pCAGGS-HA中含有HA表达盒的片段定向克隆入犬2型腺病毒载体pPoly2-CAV2的E3缺失区,获得在E3区缺失处插入HA表达盒的重组质粒pCAV-2-HA。利用脂质体介导的转染方法,将重组质粒pCAV-2-HA导入DK细胞中；观察细胞的变化,待培养细胞出现典型的腺病毒样细胞病变时,对重组的病毒采用电镜进行形态学鉴定,利用血凝实验检测重组病毒的血凝性,应用RT-PCR的方法检测重组病毒在繁殖的过程中HA基因片段是否发生缺失以及能否正确转录HA基因的mRNA,采用间接免疫荧光和间接ELASA的方法检测HA基因在DK细胞中的表达情况和重组病毒体外遗传稳定性。[结果]成功构建了真核表达质粒pCAGGS-HA并且能在哺乳动物细胞BHK-21中表达具有生物活性的HA蛋白；CAV-2-HA重组病毒具有典型的CAV-2形态特征和血凝特性,并且能够转录HA基因的]mRNA,间接ELISA和间接免疫荧光检测表明所构建的重组病毒能够正确表达HA蛋白,且在体外具有良好的遗传稳定性。[结论]该实验成功构建了A/Tiger/Harbin/132/2007 HA基因重组犬2型腺病毒的载体pCAV-2-HA;转染出了能在哺乳动物细胞中表达具有生物活性的HA蛋白的重组病毒CAV-2-HA。
参考文献：
[1]. 表达和共表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒[D]. 程坚. 扬州大学. 2001
[2]. 用不同鸡痘病毒载体构建单表达或双表达抗H5和H9亚型禽流感的重组疫苗及其免疫效力[D]. 陈素娟. 扬州大学. 2005
[3]. 共表达H_9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力[J]. 程坚, 刘秀梵, 彭大新, 刘红旗, 吴艳涛. 病毒学报. 2003
[4]. 共表达新城疫病毒融合蛋白基因和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力[D]. 韦栋平. 扬州大学. 2004
[5]. 表达虎源H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组犬2型腺病毒的构建与鉴定[D]. 刘益新. 四川农业大学. 2010