马艳苗[1]2013年在《风湿宁胶囊对胶原诱导性关节炎大鼠的治疗作用及机制研究》文中研究指明类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以滑膜炎症、骨骼和软骨破坏及滑膜组织增殖为特征的自身免疫性疾病。RA的发病机制不仅涉及T淋巴细胞活化,而且与机体的氧化应激状态及线粒体功能失活参与调控细胞凋亡进程密切相关。近年来的研究表明活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在RA的防治中发挥着重要的作用。在许多组织中,ROS引发的氧化应激破坏线粒体呼吸链,损伤线粒体并导致细胞衰老和死亡。而对于RA类肿瘤样增生的滑膜组织而言,诱导ROS表达或生物活性的发挥,能够上调促凋亡蛋白的表达,促进线粒体通透性转运孔的开放,激活天冬氨酸特异的半胱氨酸酶(caspase),诱导过度增殖的滑膜细胞走向凋亡,这无疑将成为遏制RA病情发展的一个重要环节,有利于RA的防治。风湿宁胶囊(以下简称风湿宁,FSN)主要用于治疗寒湿兼瘀血阻络型痹症,经十余年临床应用证实其对RA疗效显著。前期已开展的实验研究表明,FSN具有抗炎、镇痛、免疫调节等药理作用,在抗RA方面具有良好的应用前景,但其发挥抗炎、免疫调节的分子机制尚未明了,特别是其抗RA的机制是否与诱导过度增殖的滑膜细胞凋亡有关目前尚未明确。为此,我们针对这一问题进行了一系列研究,探讨了FSN对免疫功能的调节及其促进滑膜细胞凋亡的分子机理,结果显示,FSN可调节炎症因子的分泌和恢复Th1/Th2、CD4+/CD8+平衡,而且能够通过升高体内活性氧的表达来诱导过度增殖的滑膜细胞经线粒体途径实现凋亡,而后者很可能是FSN抗RA的一个新机制。目的：以牛II型胶原诱导的大鼠为模型,从CIA大鼠的足肿胀度、关节指数、病理组织形态学改变、细胞因子、T淋巴细胞亚群等方面考察FSN的抗炎及免疫调节作用,阐明其可能的分子机制。观察风湿宁胶囊对CIA大鼠滑膜细胞是否具有促凋亡作用并从活性氧的生成、线粒体功能、Bcl-2、caspase等角度探讨其可能的作用机制。方法：大鼠足跖皮内注射弗氏完全佐剂诱发CIA模型；以FSN0.33.0.66、1.32g-kg-ig给药,持续30d,0.03g·kg-1雷公藤多苷为阳性对照。采用足容积法测量足肿胀度；利用关节炎指数对大鼠关节损伤程度进行评价；称重法测定大鼠体重、脾、胸腺的重量；光学显微镜下观察关节组织病理学变化；拍摄关节X线片；ELISA法检测血清TNF-α、IL-1、IFN-γ、IL-4、IL-10含量；流式细胞术检测T淋巴细胞亚群水平。透射电镜下观察大鼠滑膜细胞的超微结构；Fe2++H2O2系统检测羟自由基含量；紫外分光光度法检测滑膜ATP含量、caspase-3、caspase-9活性；ELISA法检测滑膜上清液中Cytc的水平；免疫组化法检测滑膜组织VEGF、Bcl-2、Bax的表达；RT-PCR检测凋亡相关基因caspase-3、caspase-9mRNA的表达水平；Bradford蛋白浓度法测定滑膜蛋白的浓度；Western blot法检测滑膜caspase-3、caspase-9p35、VDAC1、AIF蛋白表达变化。结果：1、FSN对CIA大鼠具有治疗作用,其抗炎及免疫调节作用与降低Thl细胞分泌的IL-1、TNF-α、IFN-γ等炎性细胞因子水平,升高Th2细胞分泌的抗炎细胞因子IL-4、IL-10含量及恢复CD4+/CD8+平衡密切相关。此外,在血管微环境方面,证实了CIA大鼠高表达的VEGF蛋白在FSN用药干预后表现出不同程度地降低趋势,血管翳的形成和滑膜细胞的生长得到抑制。FSN (0.66、1.32g-kg-1)能够明显抑制CIA大鼠足肿胀、减轻关节疼痛、多发性关节炎等症状,减缓CIA大鼠体重的下降；光镜下观察到关节滑膜组织轻度增生、炎细胞浸润及滑膜组织新生血管减少、血管翳减轻、偶见少量纤维增生、骨及软骨受损程度减轻；FSN能够不同程度地下调Thl细胞分泌的IL-1、TNF-α、IFN-γ水平,上调Th2细胞分泌的IL-4、IL-6、IL-10水平,并降低CIA大鼠的胸腺指数；流式结果也表明,FSN能恢复CIA大鼠CD4+/CD8+比值,降低CD4+T淋巴细胞的水平。2、FSN上调CIA大鼠滑膜组织ROS的表达CIA大鼠滑膜组织中ROS含量降低,FSN给药(0.33、0.66、1.32g·kg-1,ig,d30)后ROS的表达增高,而FSN升高CIA大鼠ROS水平是其调节线粒体膜通透性转运孔开放、滑膜细胞内ATP水平及线粒体跨膜电位、影响滑膜细胞凋亡进程、抑制免疫亢进、发挥其治疗作用的特点之一。3、FSN通过影响信号转导途径诱导滑膜细胞凋亡FSN体内给药后CLA大鼠滑膜细胞基本结构恢复正常且能够抑制间质胶原纤维的异常增生,改善线粒体的肿胀或空泡变性状态；Western-blot结果显示,FSN可促进VDAC1蛋白表达量升高；紫外分光光度法结果表明FSN用药组的ATP含量显著降低；而在滑膜组织匀浆的上清液中检测到FSN (0.66g-kg-1)的Cytc释放量明显增多；免疫组化结果表明,随着剂量的增大,FSN给药组滑膜细胞的Bcl-2阳性表达逐渐减少,呈下降趋势,Bax日性细胞的表达明显增多；经RT-PCR、Western-blot证实,FSN干预后的CIA滑膜组织中,caspase-3、caspase-9p35、AIF的表达明显上调；caspase酶活性试验数据也表明,caspase-3、caspase-9活性在FSN给药前后有显著差异。结论：1、FSN对CIA大鼠多发性关节炎症具有明显的改善作用。FSN抑制CIA大鼠体内炎性细胞因子IL-1、TNF-α、IFN-γ的分泌,促进抗炎细胞因子IL-4、IL-6、IL-10的生成,降低CD4+/CD8+及抑制VEGF蛋白表达,是其发挥调节CIA大鼠亢进的免疫功能效应的关键。2、FSN通过调节体内ROS的生成影响滑膜线粒体功能及Th细胞的分化,促进经caspase依赖性途径、AIF途径的细胞凋亡,抑制滑膜的过度增殖,从而发挥其治疗作用。3、线粒体功能改变导致滑膜细胞凋亡参与了FSN防治RA的病理生理改变,表现为：线粒体在ROS的刺激下,促进VDAC1通道开放,影响MPTP的开放及ATP等能量物质的逸出,造成线粒体呼吸链抑制、膜电位丧失,释放Cytc和AIF,引发细胞凋亡的两条途径：一条需要Bcl-2家族和caspase酶依赖性参与,激活caspase-9和下游的caspase-3,导致细胞凋亡；另一条是需要AIF调节的多聚聚合酶途径的参与。在这一过程中,抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax蛋白通过与VDAC1的结合,调节凋亡进程。因此,线粒体功能改变可能在滑膜细胞凋亡中发挥了重要作用。
魏禺[2]2014年在《脂联素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡影响的研究》文中提出第一部分脂联素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的影响目的：前期研究发现脂联素(Adiponectin, AD)在类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)滑液中高表达,且AD与RA滑膜炎症和骨侵蚀密切相关,机制尚不清楚。RA滑膜成纤维细胞(Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs)增殖异常,致滑膜增生,参与炎症和骨侵蚀。本研究将主要探讨AD对RASFs增殖的影响。方法：以不同浓度AD(0.1、1和10μg/ml)刺激RASFs,并以空白组为对照,培养72h后,采用CCK-8和显微镜直接计数法分别检测AD对RASFs增殖的影响。结果：CCK-8结果证实,AD10μg/ml组比空白组更显著促进RASFs增殖(OD：0.78±0.06vs0.59±0.067,p<0.01),且AD促增殖作用呈剂量依赖性。显微镜直接计数法结果也支持上述结论(53.75±2.13×104vs33.25±2.46×104,p<0.05)。结论：AD以剂量依赖方式促进RASFs增殖。第二部分脂联素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的影响目的：RASFs增殖异常和凋亡减少共同参与滑膜增生,我们已证实AD可促进RASFs增殖,然而,AD仅影响RASFs增殖,还是同时影响RASFs增殖和凋亡,尚未知。因此,本研究着重探讨AD对RASFs凋亡的影响。方法：体外培养RASFs,诱导凋亡,以不同浓度AD(0.1、1和10μg/ml)刺激RASFs,未加入AD组作为对照,流式检测AD对RASFs凋亡的影响。结果：AD10μg/ml组比空白组更显著抑制RASFs凋亡(11.33±3.65%vs23.34±5.21%,p<0.01),且AD抗凋亡作用呈剂量依赖性。结论：AD以剂量依赖方式抑制RASFs凋亡。第三部分脂联素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡和细胞周期相关基因表达的影响目的：通过前期的研究,我们已证实AD既能促进RASFs增殖,也能抑制RASFs凋亡,然而机制尚未知。因此,本研究着重探讨AD对RASFs凋亡和细胞周期相关基因表达的影响。方法：以不同浓度AD(0.1、1和10μg/ml)刺激RASFs,并以空白组为对照,培养72h后,采用Real-time PCR检测Bcl-2、Bax、p53、CDK4和PCNA mRNA表达情况。Western blot分析Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果：AD10μg/ml显著促进Bcl-2mRNA (p<0.01)和蛋白表达,抑制Bax mRNA(p<0.05)和蛋白表达,上调Bcl-2/Bax (p<0.05),同时抑制p53mRNA表达(p<0.05),促进细胞周期相关基因CDK4mRNA (p<0.05)和PCNA mRNA(p<0.05)的表达。结论：AD可能通过促进Bcl-2、CDK4和PCNA表达,抑制Bax、p53表达,上调Bcl-2/Bax,促进RASFs增殖和凋亡减少。第四部分脂联素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中IL-6、IL-8和MMP-3mRNA表达的影响目的：前期研究证实AD可同时促进RASFs增殖和凋亡减少,参与滑膜增生,为了明确AD对炎症和骨侵蚀的影响,本研究将探讨AD对RASFs中白介素(Interleukin, IL)-6、IL-8和基质金属蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3, MMP-3)表达的影响。方法：体外培养RASFs,以不同浓度AD(0.1、1和10μg/ml)刺激RASFs,并以空白组为对照,培养72h后,采用Real-time PCR检测IL-6、IL-8和MMP-3mRNA表达情况。结果：相较于空白组,AD10μg/ml能显著促进炎症因子IL-6mRNA (8.97±3.77倍,p<0.05)和IL-8mRNA(12.71±2.05倍,p<0.001)的表达,同时促进骨侵蚀相关因子MMP-3mRNA(4.99±1.12倍,p<0.001)的表达。结论：AD以剂量依赖方式促进炎症因子IL-6、IL-8mRNA和骨侵蚀相关因子MMP-3mRNA表达,提示AD参与RA的炎症和骨侵蚀过程。
接力刚[3]2011年在《复方丹参注射液治疗RA疗效及其干预CYR61对RA-FLS生物学行为的研究》文中研究指明类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是最常见和致残率最高的骨关节疾病之一,正侵袭着全球所有种族数以千万计的人口,造成个人、家庭和社会的巨大损失。迄今为止,虽然RA的发病机制还不十分明确,但是它的作用“终端”靶组织很明确,就是滑膜。滑膜组织中的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的类肿瘤样生长及其侵蚀性是关节破坏的主要因素。如果能够从RA滑膜入手去研究和治疗,就可以避开纷乱繁杂的细胞和分子网络,直达“病处”。因此,如果能寻找到抑制RA-FLS的增生和侵蚀性的关键分子和重要机制,可以为RA的有效治疗提供新的药物靶点。通过前期的研究发现,高半胱氨酸蛋白61 (cysteine-rich61, CYR61)在RA患者的滑膜组织、FLS和关节液中均高表达,并且能促进IL-17介导FLS增殖。CYR61能调控肿瘤细胞的增殖和侵袭力,而这些功能恰与RA-FLS增殖性和侵蚀性相似。RA属中医“痹证”范畴。中医药治疗痹证历史悠久,几千年来在风湿病的防治方面收到了一定的疗效,很多中药和中成药在治疗RA不仅有着非常好的疗效,而且副作用较少,费用较低。广州军区广州总医院沈鹰教授在国内首次将复方月参注射液用于治疗RA等风湿性疾病,取得明显的临床疗效。并通过动物实验,初步从自由基、血流变、滑膜病理、动物模型的滑膜细胞凋亡、细胞因子及基因表达等多角度阐述了复方月‘参注射液治疗RA的部分机制,但复方丹参注射液对于RA-FLS和RA关节软骨侵蚀方面的作用和机制尚不明确。因此亟待能够在基础方面进一步研究,明确复方丹参注射液在RA滑膜增生和软骨侵蚀中的作用,为中医药治疗RA等风湿病的临床推广和药物研发奠定基础。目的：本课题正是基于以上工作基础和背景进行立题,旨在研究复方丹参注射液治疗RA的临床疗效和其干预CYR61对于RA-FLS增殖、凋亡和侵袭力的生物学行为影响,旨在获得CYR61直接参与RA-FLS侵袭性的可靠证据及复方丹参注射液的干预机制,为复方丹参注射液治疗RA的应用和确立CYR61作为RA研究和治疗的新靶点提供科学依据。方法：1.应用随机对照方法观察了212例复方丹参注射液治疗活动期类风湿关节炎20天的临床疗效及安全性。2.获取RA和正常人滑膜的活组织,然后进行分离和培养,获得纯化的FLS,并应用流式细胞仪对细胞表面标志物进行鉴定。3.构建CYR61慢病毒载体,然后进行CYR61慢病毒载体的包装和FLS转染。同时应用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,合成CYR61特异性小干扰RNA(smallinterference RNA, siRNA)瞬时转染RA-FLS。观察以上转染效率和FLS中CYR61表达情况。4.应用MTS法检测各组FLS增殖率；5.应用Tunel法检测各组FLS凋亡率；6.应用Transwell法检测各组FLS侵袭能力,并应用ELISA检测各组细胞液中MMP-1,3,10,13水平；7.应用以上方法观察复方丹参注射液对RA-FLS中CYR61基因和蛋白表达以及RA-FLS增殖、凋亡和侵袭力的干预作用。结果：1.临床前瞻性研究结果显示,复方丹参注射液治疗组治疗后20天与治疗前比较,触痛关节数、肿胀关节数、晨僵时间、双手握力,患者疼痛程度评估、患者对疾病的总体评估、医生对疾病的总体评估、患者的躯体活动功能(HAQ)、28关节病情活动度评分(DAS28)、血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)和类风湿因子(RF)均有明显改善(P<0.05)。复方丹参注射液治疗组患者治疗后晨僵时间、双手握力、患者疼痛程度评估、患者对疾病的总体评估、医生对疾病的总体评估、DAS28和HAQ比常规治疗组患者均有明显的改善(P<0.05)；治疗组患者ACR20改善率(79.72%)明显高于对照组患者(59.43%)(P<0.05)；两组患者的不良反应及安全性指标无显著性差异(P>0.05)。2.本研究通过流式细胞仪对3代RA和正常人滑膜细胞表面标记物CD90和CD14表达阳性率检测,发现CD90的阳性率分别为93.43%和96.94%,CD14的阳性率分别是0.22%和0.13%。从检测的结果看滑膜细胞CD90的阳性率接近98%,获得了实验需要的FLS。3.FLS转染实验结果显示,两组转染效率都在90%以上。通过Q-PCR和Wosternb1ot检测来看,正常人FLS过表达CYR61后,CYR61在FLS中的mRNA和蛋白表达量均明显高于正常人FLS和RA-FLS(P<0.05);同时,通过CYR61-siRNA干扰RA-FLS后,RA-FLS表达CYR61的mRNA和蛋白非常微量,明显低于其他FLS(P<0.05),抑制效率达到89.14%。本研究对CYR61的过表达和低表达的转染效率均很高,为下一步的功能研究奠定了基础。4.各组FLS增殖情况结果显示,RA-FLS通过转染CYR61-siRNA第5天后,细胞增殖率明显低于正常RA-FLS(P<0.05)；正常FLS转染CYR61过表达载体5天后增殖率比正常FLS明显增加(P<0.05)。结果还显示,第5天的FLS细胞增殖率与细胞CYR61的mRNA和蛋白水平均呈正相关(P<0.01),这说明FLS的增殖与CYR61的mRNA和蛋白表达水平有关。5.本研究结果还显示,RA-FLS通过转染CYR61-siRNA后,细胞凋亡率明显高于于RA-FLS和空转染RA-FLS(P<0.05)；正常FLS转染CYR61过表达载体后,细胞凋亡率明显低于其他各组(P<0.05)。FLS细胞凋亡率与细胞CYR61的mRNA和蛋白水平均呈负相关(P<0.01),这说明FLS的凋亡与CYR61的mRNA和蛋白表达水平有关。6.各组FLS侵袭能力结果显示,RA-FLS侵袭力明显强于正常人FLS(P<0.05),RA-FLS通过转染CYR61-siRNA后,细胞侵袭力明显低于其他各组(P<0.05)；正常FLS转染CYR61过表达载体后,细胞侵袭力明显高于其他各组(P<0.05)。结果还显示,FLS细胞侵袭力与细胞CYR61的mRNA和蛋白水平均呈正相关(P<0.01)。同时,应用ELISA对各组细胞液中MMP-1,3,10,13水平进行检测,最后发现,MMP-3与CYR61表达水平和细胞侵袭力相关(P<0.05)7.本研究结果显示,与正常RA-FLS和小剂量复方丹参注射液比较,大剂量复方月参注射液能抑制RA-FLS增殖和CYR61mRNA和蛋白的表达,促进RA-FLS凋亡,并且具有明显抑制RA-FLS侵袭力(P<0.05)结论：1.复方丹参注射液在治疗活动期RA中,具有增效作用,无不良反应。2.CYR61可能是通过促进RA-FLS增殖、抗凋亡达到滑膜增生,再通过增进RA-FLS表达MMP-3增强其侵袭力达到破坏关节软骨的作用。3.大剂量复方丹参注射液丹参注射液能抑制RA-FLS增殖和CYR61表达,促进其凋亡,并且抑制RA-FLS侵袭力,着可能是复方丹参注射液通过这些作用能够起到抑制RA滑膜增生和关节软骨破坏的作用。本课题的特色和创新性：1.提出了CYR61对于RA-FLS侵袭行为影响的假说,通过慢病毒感染和RNA干扰技术,证明了CYR61基因能调控RA-FLS增殖、调亡和侵袭力,可能是RA研究和治疗的潜在靶点。2.本研究还发现复方丹参注射液注射液能抑制RA-FLS中CYR61表达,同时干预RA-FLS增殖、凋亡和侵袭力,这可能是复方丹参注射液治疗RA滑增生和软骨侵蚀的作用机制之一。本研究初步阐述了CYR61可能成为RA未来研究和治疗新的重要靶点,也为复方丹参注射液在保护RA关节方面的应用提供科学依据,在评价中药抗RA的药效及抑制软骨破坏机理研究提供了一个实验平台和参考模式,有助于进一步推广中医药在治疗RA等免疫疾病中的应用。
陈佩虹[4]2010年在《过山枫提取物抗类风湿关节炎有效部位筛选及药理药效学研究》文中指出1.目的与意义类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种原因不明的、慢性进行性的系统性炎症性疾病。其特点为滑膜增生和外周关节对称性、侵蚀性关节炎,但也可以导致全身系统性表现。RA为常见多发病,国外患病率为0.5%-3%,国内0.3%-0.5%,好发年龄20-45岁,男女发病率比率约为1：3。一般情况下,RA患者都会有持续的滑膜炎、进行性的关节破坏和功能障碍而致残障,长期的病程及最后关节损伤所致的功能障碍给患者及家庭造成极大的痛苦和负担。目前认为RA的病因与遗传、感染、随机和性激素等因素相关。RA的发病机制尚未有确切定论,在RA病程中贯穿了滑膜组织增生、炎症、骨及软骨降解和破坏、关节的进行性破坏、自身免疫等病理生理过程,而且它们之间相互作用、相互关联,形成一个错综复杂的网络。80年代有人提出RA是T细胞介导的自身免疫性疾病,CD4T细胞尤其在RA慢性炎症的启动及持续过程中起主要作用,调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)更是近年对RA的发生发展及机制方面的研究热点。同时越来越多证据显示关节滑膜成纤维样滑膜细胞(RA synovial fibroblasts, RA-SF)对RA发病和迁延具有重要的影响,参与关节软骨和骨破坏；RA-SF具有转化特征,且发生不可逆的转变,在RA进展中,RA-SF既是被动反应又是主动参与；有研究认为RA-SF的大量增殖与细胞周期(增殖、凋亡)失调有关。临床上,用于RA治疗的常用药物主要包括非类固醇抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAID)、缓解疾病的抗风湿性药物(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARD)、激素、针对不同靶向的生物制剂。尽早应用DMARD已成为医学界的共识,甲氨蝶呤、羟氯喹、来氟米特等均是常用药物；而外周血干细胞移植和基因治疗都是RA治疗的发展方向。传统抗RA药的毒副作用较大,而新兴的生物治疗、基因治疗价格昂贵,患者长期服用依从性差,不利于疾病控制。因此研制开发有效、毒副作用小的抗RA药物势在必行。类风湿关节炎属中医的疑难杂症,在长期的中医临床实践中,中药临床治疗效果显著,因此,对临床治疗有效的中药单味药及复方的开发具有重要的意义。过山枫[Celastrus aculeatus Merr]属卫矛科南蛇藤属植物,具有祛风除湿、行气活血、消肿解毒等功效,中国民间常用该药的水煎剂或外敷来治疗风湿痹症,临床上常用于治疗RA并取得良效。研究发现过山枫中主要成分有萜类、黄酮类、醇类等。有研究证实：过山枫乙醇提取物对Ⅱ胶原诱发的RA炎症有显著抑制作用；过山枫乙醇提取物可抑制淋巴细胞增生,同时能使淋巴细胞移动减慢、诱导人T淋巴细胞株CEM-6T细胞凋亡；过山枫乙醇提取物可以显著抑制关节软骨内MMP-3、TMIP-1和MMP-3/TMIP-1的表达,提示过山枫乙醇提取物抗炎、调节免疫作用与调节基质金属蛋白酶作用相关。本课题组前期研究结果证明过山枫乙醇提取物对炎症动物模型具有显著抗炎镇痛作用,对热杀死结核分支杆菌H37Ra (Mycobacterium tuberculosis H37Ra,Mtb)诱导的佐剂性关节炎模型(adjuvant-induced arthritis,AA)的关节炎症及病情进展有显著抑制作用。在医学与药物的研究中,实验动物模型的建立是非常重要的。目前在RA研究中常用的实验动物模型有：Ⅱ型胶原性关节炎(collagenⅡ-induced arthritis,CIA)、AA模型。AA模型症状直观,且炎症是T细胞依赖性,因此常用于关节炎新药筛选和RA自身免疫机制的研究。本课题组前期研究建立了以Mtb诱导SD大鼠AA模型,与临床RA表现症状有较大的相似性,其病情表现及进程与临床类风湿关节炎相近,同时该模型制作方法简单,成模率高,经济实用。过山枫的抗炎及免疫调节作用可能是其治疗RA的重要基础,但是关于过山枫抗RA的药理作用研究和化学成分研究目前国内外报道并不多见。基于上述研究背景,本论文主要工作是采用体外T淋巴细胞增殖实验筛选过山枫效应成分,并观察对细胞凋亡的影响；通过建立合理有效的大鼠RA模型,观察效应成分对RA动物模型抗炎作用及相关药理机制；全面评价过山枫治疗RA的物质基础及作用机制,为临床上开发治疗RA的中药新药提供科学依据。2.实验方法2.1过山枫提取物有效部位的体外筛选及诱导T细胞凋亡实验采用化学提取法对过山枫乙醇提取物进行分离,以体外培养小鼠淋巴细胞增殖实验及MTT比色法对乙醇提取物乙酸乙酯(GSF-A)、三氯甲烷(GSF-B)、石油醚部位(GSF-C)进行活性筛选；采用柱层析分离技术,对筛选的活性部位再进一步分离,得到GSFY-A、GSFY-B、GSFY-C部位。通过体外培养ConA诱导的T淋巴细胞抑制实验,采用T淋巴细胞Annexin V-PI双标记流式细胞术检测淋巴细胞凋亡率。2.2 Mtb诱导SD大鼠AA模型建立采用热杀死结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Ra, Mtb),诱导SD大鼠佐剂性关节炎,并对模型进行客观评价。SPF级雄性SD大鼠24只,随机分为两组,对照组、模型组,模型组大鼠尾根部一次性皮下注射Mtb-矿物油诱导剂,定期记录两组大鼠的一般体征、体重、足容积、关节炎症、外周血液常规、血液流变学、外周血调节性T细胞、关节滑膜细胞凋亡、关节滑膜病理等指标,评价Mtb诱导SD大鼠AA模型的特点,综合评价该模型的合理性、有效性。2.3过山枫乙酸乙酯部位对AA模型大鼠的抑制作用及相关机制研究SPF级雄性SD大鼠60只,随机分为五组,空白组、模型组、MTX组、过山枫低剂量组、过山枫高剂量组,除空白组以外,其余各组大鼠均在尾根部一次性皮下注射Mtb-矿物油诱导剂,定期记录五组大鼠的一般体征、体重、足容积、关节炎症、外周血液常规、血液流变学、外周血调节性T细胞、关节滑膜细胞凋亡、关节滑膜病理等指标改变,观察过山枫对Mtb诱导SD大鼠AA模型的抗炎、免疫调节作用。3.实验结果3.1过山枫不同提取部位对淋巴细胞增殖抑制作用及对T细胞凋亡的影响过山枫不同极性部位GSF-A、GSF-B、GSF-C及MTX对小鼠脾淋巴细胞增殖有显著抑制作用,各药物组抑制率与ConA对照组比较均有统计学意义(P<0.05)；其中以GSF-A部位对淋巴细胞增殖抑制作用最显著。以GSF-A部位进行柱层析分离,得到的分离部位GSFY-A、GSFY-B、GSFY-C及MTX对小鼠脾淋巴细胞增殖有显著抑制作用,各药物组抑制率与ConA对照组比较有统计学意义(P<0.05)；其中以GSFY-B的作用最显著。淋巴细胞凋亡实验结果表明,过山枫既可诱导早期凋亡,也可诱导晚期凋亡,但诱导晚期凋亡更明显。过山枫乙酸乙酯部位及其柱层析分离物均能诱导淋巴细胞凋亡,与ConA组比较差异显著(P<0.05), GSFY-B诱导淋巴细胞凋亡的作用尤其显著。过山枫对T淋巴细胞增殖的抑制及诱导凋亡作用一致,提示过山枫诱导凋亡是其抑制T淋巴细胞增殖的机制之一。3.2 Mtb诱导SD大鼠AA模型评价模型组大鼠在Mtb免疫初期一般状态与正常组大鼠无异,在第10-13天逐渐出现炎症信号,在第16-25天四肢炎症逐步达到峰值,肢体行动不灵活,尤其是后足关节及足趾严重肿胀并到后期逐步硬化,甚至跛行。模型组大鼠免疫后从21天开始,体重呈下降趋势；在整个实验周期内模型组体重与正常组比较差异显著(P<0.05)。模型组大鼠免疫后从第10天开始,足趾、足垫、踝关节等部位出现红肿,在25天足部肿胀度达到峰值,并出现关节僵化致残。到后期由于出现肢体障碍的大鼠数量增多,炎症评分达到最高值；模型组大鼠足部肿胀度及关节炎症评分与正常组比较差异显著(均P<0.05)模型组大鼠Mtb免疫后16天,外周血淋巴细胞凋亡率呈倍数升高。在第28天外周血淋巴细胞凋亡率明显下降；血红蛋白含量降低,血小板总数、红细胞压积、全血粘度、血浆粘度均升高,与正常组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。调节性T淋巴细胞测定结果表明,模型组大鼠免疫后28天,外周血CD4+CD25+FOXP3+T细胞占CD4+T细胞的比例、CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例均下降,与正常组比较差异显著(均P<0.05)。模型组大鼠免疫后第16、28天,关节滑膜细胞凋亡减少,与正常组比较差异有统计学意义(均P<0.05)病理切片镜下观察可见：模型组大鼠关节滑膜组织大多数出现典型的病理改变,滑膜有6-10层甚至20层滑膜细胞,呈轻度到中度变性、中度到极重度异常增生不等,呈短绒毛状或指突状；滑膜有大量炎性细胞浸润,并有肉芽组织形成。3.3过山枫乙酸乙酯部位对AA模型大鼠关节炎症的抑制作用及相关机制研究SD大鼠免疫Mtb后,MTX、过山枫药物组大鼠均出现病程中相关炎症表现,但均较模型组症状轻。Mtb免疫后从第21天开始,模型组及各药物组大鼠体重未见增长反而下降；与模型组大鼠比较,过山枫高剂量组体重下降程度较小(P>0.05)。在实验周期内,模型组大鼠关节肿胀度及炎症评分呈明显上升趋势,平均肿胀度及炎症评分均高于其他各组,并且两者的改变趋势基本一致；MTX、过山枫低、高剂量在各个时间点对RA模型多关节炎症及病变程度均有抑制作用。模型组大鼠免疫后16天外周血淋巴细胞凋亡率呈倍数升高。第28天外周血淋巴细胞凋亡率明显下降,MTX、过山枫低、高剂量均能显著促进淋巴细胞凋亡；模型组大鼠外周血血红蛋白含量降低,血小板总数、红细胞压积、全血粘度、血浆粘度均升高,MTX、过山枫低、高剂量能显著改善RA模型大鼠血液常规及血液流变学各项指标；模型组大鼠外周的调节性T细胞比例水平低下,MTX、过山枫低、高剂量能显著提高RA模型大鼠外周的调节性T细胞比例。在实验周期内,RA模型大鼠关节滑膜细胞呈现凋亡缺陷,MTX、过山枫低、高剂量能显著促进RA模型关节滑膜细胞凋亡。模型组大鼠免疫后,关节滑膜组织大多数出现典型的病理改变,包括滑膜衬里层细胞增生、炎性细胞大量浸润、肉芽组织形成等,MTX、过山枫低、高剂量对RA模型大鼠关节滑膜具有保护作用,病理状况得到明显改善。4.结论过山枫不同极性部位对小鼠淋巴细胞增殖有抑制作用,其中乙酸乙酯部位及乙酸乙酯柱层析分离物对T淋巴细胞增殖有显著抑制作用,同时乙酸乙酯部位及其柱层析分离物均对T淋巴细胞凋亡有诱导作用；提示过山枫诱导细胞凋亡的作用是其抑制T淋巴细胞增殖的机制之一。Mtb诱导SD大鼠的佐剂性关节炎模型：该模型材料容易获得,对SD大鼠有较高敏感性,制作方法简单,可重复性强,成功率高；关节炎症及临床表现持续时间长；临床表现与组织学改变与人RA相似；模型的免疫学指标存在明显的细胞免疫异常。该模型可以用于RA的医学研究及抗RA新药筛选研究。体内实验证明,过山枫能够控制AA大鼠炎症进展,抑制AA炎症发展过程中关节滑膜增生、炎性细胞浸润,减轻关节炎症症状,降低炎症严重程度,同时具有免疫调节维持机体免疫稳态的作用,因此对大鼠RA的发生和发展具有明显的抑制作用。过山枫的免疫调节作用可能是其治疗RA的药理作用机制之一。
张珊[5]2017年在《丹参酮ⅡA通过调节中性粒细胞活性治疗类风湿关节炎的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)以关节滑膜炎症为主要病理表现,是一种慢性、系统性和破坏性的自身免疫性关节疾病,其发病机制至今尚未完全阐明。在RA的疾病发生过程中,中性粒细胞发挥着重要的作用:中性粒细胞渗出血管并聚集到关节部位;中性粒细胞可通过释放细胞因子、蛋白水解酶等引起机体正常组织的损伤并可能延缓炎症反应的解决过程;细胞凋亡是中性粒细胞从RA炎症组织中清除并及时解决炎症必不可少的条件;中性粒细胞胞外诱捕网可促进瓜氨酸化自身抗原的产生,而抗-瓜氨酸蛋白抗原导致RA炎症的持续存在,并预示着疾病的更快进展和不良预后。因此,中性粒细胞是RA治疗的重要靶标。目前,临床常用的RA治疗药物主要是非甾体类抗炎药和改善病情的抗风湿药,如双氯芬酸、萘丁美酮、甲氨蝶呤、来氟米特等。中药制剂研究也较多,并且如雷公藤多苷在RA的临床治疗上也有显著疗效。丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TⅡA),作为一种从中药丹参中提取的菲醌衍生物,在临床上用于很多疾病的治疗,如心绞痛、心肌梗死和脑卒中等。丹参酮ⅡA能够抑制多种组织和细胞的炎症反应,在无菌损伤诱导的斑马鱼验证模型中,丹参酮ⅡA可通过诱导中性粒细胞的凋亡并促进中性粒细胞的逆向迁移从而促进炎症的解决。但是丹参酮ⅡA是否能够通过调节中性粒细胞的活性治疗RA目前尚缺乏研究。目的:本研究用弗氏完全佐剂诱导小鼠关节炎模型,评价丹参酮ⅡA对佐剂诱导的RA小鼠的治疗作用及对体内中性粒细胞的调节作用,并检测丹参酮ⅡA对中性粒细胞功能的影响,为丹参酮ⅡA可以作为治疗RA的一个有效药物成分和日后的研究与临床应用提供实验依据。方法:(1)通过弗氏完全佐剂诱导的小鼠关节炎模型探讨丹参酮ⅡA对RA的治疗作用。(2)用免疫组织化学法检测RA小鼠踝关节髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的表达。(3)用小鼠气囊炎实验评价丹参酮ⅡA对中性粒细胞迁移的影响。(4)用实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附实验以及免疫印迹实验检测促炎细胞因子 TNF-α、IL-6、iNOS 水平。(5)用Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax和cleaved caspase-3的表达水平。用Annexin V/PI双染检测细胞凋亡。(6)用免疫荧光和共聚焦显微镜评估中性粒细胞胞外诱捕网的形成,髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的释放。结果:(1)丹参酮ⅡA可以缓解RA小鼠的症状:我们应用弗氏完全佐剂诱导小鼠关节炎模型检测丹参酮ⅡA是否可以抑制关节炎症。弗氏完全佐剂诱导的模型组小鼠与正常对照组小鼠相比,踝关节肿胀程度、踝关节直径和关节炎评分均明显增高。腹腔注射丹参酮ⅡA的治疗组小鼠关节肿胀程度明显减轻,踝关节直径和关节炎评分则显著下降(P<0.01)。(2)RA小鼠踝关节组织学分析:我们发现弗氏完全佐剂诱导RA模型组小鼠踝关节与正常对照组相比出现典型的炎症表现,如软骨的损伤、滑膜增生和大量的炎性细胞浸润。丹参酮ⅡA治疗组小鼠的关节病理变化则得到明显改善,软骨的损伤、滑膜增生得到缓解,炎性细胞浸润减少。(3)丹参酮ⅡA对RA小鼠血清中TNF-a和IL-6分泌的影响:经ELISA法检测,小鼠血清中的TNF-a和IL-6的含量,RA小鼠与正常对照组相比有明显升高。而经丹参酮ⅡA治疗后,其含量显著降低(P<0.05)。(4)丹参酮ⅡA对小鼠踝关节中MPO和NE表达的影响:经免疫组织化学分析,RA小鼠踝关节中MPO和NE的表达与正常组小鼠相比明显增多。然而,丹参酮Ⅱ治疗组MPO和NE的表达与RA模型组小鼠相比则明显减少。(5)丹参酮ⅡA对小鼠中性粒细胞募集的影响:通过小鼠气囊炎实验,收集气囊灌洗液,经细胞计数,我们发现LPS刺激组的白细胞总数和中性粒细胞数量与PBS组相比显著增多(P<0.01),而经丹参酮ⅡA处理后白细胞总数和中性粒细胞数量与LPS刺激组相比则明显减少(P<0.01)。(6)丹参酮ⅡA对中性粒细胞TNF-α、IL-6的影响:用实时荧光定量qPCR和ELISA法分析丹参酮ⅡA是否能够降低经LPS激活的中性粒细胞中TNF-α、IL-6的表达。我们发现,不同浓度(5μM、10μM、25μM)的丹参酮ⅡA处理组与LPS刺激组相比,TNF-α、IL-6的表达均呈有一定程度的抑制,并且随丹参酮ⅡA应用浓度增大,抑制作用更明显,其中浓度为10μM和25μM时具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。(7)丹参酮ⅡA对中性粒细胞iNOS的影响:分别用实时荧光定量qPCR和Western Blot检测了丹参酮ⅡA对经LPS激活的中性粒细胞中iNOS mRNA和蛋白的表达。我们发现,丹参酮ⅡA处理组与LPS刺激组相比,iNOS mRNA和蛋白的表达均被抑制,并且具有统计学意义(P<0.05)。(8)丹参酮ⅡA对中性粒细胞凋亡的影响:用Western Blot检测了 Bcl-2,Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达情况,我们发现丹参酮ⅡA处理组与LPS 激组相比,可以明显增加Bax和cleaved caspase-3的表达(P<0.05)。但Bcl-2作为典型的抑制细胞凋亡的信号,丹参酮ⅡA可以使其表达明显减少(P<0.05)。流式结果同样证明了丹参酮ⅡA可以促进中性粒细胞的凋亡。(9)丹参酮ⅡA对中性粒细胞NETs形成和MPO、NE释放的影响:通过间接免疫荧光染色后,用激光共聚焦显微镜观察,我们发现,与PMA刺激组相比,丹参酮ⅡA可以明显抑制中性粒细胞NETs的形成以及MPO、NE的释放。结论:(1)丹参酮ⅡA可以抑制中性粒细胞向RA炎症部位的迁移和聚集。(2)丹参酮ⅡA可以减少TNF-α、IL-6、iNOS的表达,从而抑制中性粒细胞活化。(3)丹参酮ⅡA可以促进活化的中性粒细胞适时地凋亡,以促进RA炎症的解决。(4)丹参酮ⅡA可以抑制NETs的形成和NETs的形成过程中MPO、NE的释放,从而减轻RA的炎症反应和组织损伤。这些结果表明丹参酮ⅡA可以作为治疗RA的一个有效的药物成分,并且为日后的研究与临床应用提供实验依据。
高洁[6]2016年在《microRNA-126靶向PIK3R2调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的机制研究》文中提出背景类风湿关节炎(RA)是以关节滑膜细胞增生,新生血管形成血管翳,炎性细胞浸润以及软骨和骨结构破坏为病理特征的自身免疫性疾病。其发病机制尚不清楚。滑膜成纤维细胞(SFs)在RA滑膜增生、关节炎症、软骨和骨的侵蚀破坏方面起着关键作用。近来研究发现磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路广泛存在于SFs中,表现为异常活化的状态,从而产生SFs的增殖和凋亡失衡。磷脂酰肌醇-3激酶调节亚单位2(PIK3R2)是PI3K/AKT信号通路的负性调控因子,是微小RNA-126(miR-126)的靶基因。目前越来越多的证据表明,microRNA是一种微调节器,在细胞增殖、分化和凋亡中起关键作用。miR-126,由表皮生长因子样结构域7基因内含子编码(EGFL7),是一种重要的血管生成信号调节因子,可以调节血管功能,维持血管的完整性;同时也发现其参与增殖、侵袭、迁移、耐药。近来microRNA与RA的相关研究成为热点,目前尚无miR-126作用于RASFs相关机制的研究。目的探讨microRNA-126靶向PIK3R2基因通过PI3K/AKT信号通路对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASFs)增殖和凋亡的影响。研究方法1、收取29例RA组行膝关节手术的RA患者和27例对照组行膝关节手术的健康创伤患者的膝关节滑膜组织标本,体外培养滑膜成纤维细胞。采用实时定量聚合酶链反应(RT-q PCR)检测RA组和对照组滑膜组织miR-126和PIK3R2 m RNA的表达;并用Western blot检测RA组和对照组滑膜组织中PIK3R2蛋白的表达。2、应用生物信息Target Scan预测并应用双荧光素酶报告系统确认PIK3R2是miR-126直接作用的靶基因。3、用电穿孔法转染对数生长中期RASFs细胞,分成5组:空白对照组,miR-126模拟组,miR-126模拟对照组,miR-126抑制剂组和miR-126抑制剂对照组。应用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测miR-126对RASFs细胞增殖的影响,应用流式细胞仪检测miR-126对RASFs细胞凋亡的影响,应用Western blot方法检测PIK3R2蛋白及PI3K/AKT信号通路中PI3K、Akt和p-Akt蛋白的变化。结果1、与对照组相比,RA组滑膜组织miR-126表达增加,而PIK3R2 m RNA的表达减低(miR-126:1.93±0.45 vs 0.89±0.22;t=3.596,P=0.023;PIK3R2 m RNA:0.76±0.16 vs 1.43±0.27;t=3.698,P=0.021)。Western blot结果显示,与对照组相比,RA组患者滑膜组织PIK3R2蛋白的表达减少(0.61±0.13 vs 1.27±0.31;t=3.401,P=0.027)。Pearson相关分析表明RA组患者滑膜组织miR-126与PIK3R2 mRNA表达呈负相关(r=-0.742,P<0.001)。2、通过在线microRNA预测网站Target Scan对靶基因进行预测。预测结果表明,PIK3R2是miR-126的靶基因。与共转染control和pMIR/PIK3R2报告基因载体相比较,共转染miR-126 minics和p MIR/PIK3R2报告基因载体后,荧光素酶(Firefly Luciferase)活性明显降低(P<0.05);而共转染inhibitor和pMIR/PIK3R2报告基因载体后,荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。3、CCK结果显示:随着时间的变化,空白对照组、miR-126模拟对照组、miR-126抑制剂对照组3组之间转染RASFs后的细胞增殖率无显著性差异(均P>0.05)。与空白对照组相比,miR-126模拟组和miR-126抑制组在转染后24h细胞增殖率差异无显著性;然而转染48h后,miR-126模拟组细胞增殖率较空白对照组显著增加,而miR-126抑制剂组较空白对照组降低(P均<0.05)。4、流式细胞仪检测结果显示:空白对照组、miR-126模拟对照组、miR-126抑制剂对照组3组之间的RASFs细胞周期比例和细胞凋亡率无显著差异(P均>0.05)。分别与空白对照组相比,miR-126模拟组S期和G2/M期RASFs细胞比例增加,而细胞凋亡率降低;miR-126抑制剂组G0/G1期和G2/M细胞比例增加,而细胞凋亡率增加(P均<0.05)。表明miR-126抑制RASFs细胞凋亡,作用于RASFs细胞周期G0/G1期到S期。5、RT-qPCR结果显示:与空白对照组比较,miR-126模拟组miR-126的表达增加,PIK3R2 mRNA的表达降低;而miR-126抑制剂组miR-126表达降低,PIK3R2 mRNA的表达增加(P均<0.05),提示miR-126靶向PIK3R2并抑制其mRNA的表达。6、Western-Blot结果显示,miR-126模拟对照组、抑制对照组和空白对照组PIK3R2和PI3K/AKT通路相关蛋白(PI3K、Akt和p-Akt)的表达无显著性差异(均P>0.05)。与空白对照组比较,miR-126模拟组PIK3R2蛋白的表达下降(P<0.05),PI3K和p-Akt的表达增高(P均<0.05),Akt的表达稍增高(P>0.05);而miR-126抑制剂组PIK3R2表达增加(P<0.05),PI3K和p-Akt蛋白表达下降(P均<0.05),Akt的表达稍降低(P>0.05)。这些结果提示miR-126能通过抑制PIK3R2蛋白的表达上调PI3K/AKT通路。结论:我们的研究表明,miR-126在RA滑膜组织中过表达。miR-126靶向PIK3R2通过调节PI3K/AKT信号通路促进RASFs的增殖并抑制其凋亡。因此,抑制miR-126可能改善RASFs增殖与凋亡之间的失衡,为治疗RA提供新理论和新武器。
黄珊珊[7]2016年在《钙网织蛋白通过调节c-FLIP表达促进类风湿关节炎滑膜增生的分子机制研究》文中研究表明目的类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜组织增生及慢性关节滑膜炎症浸润为主要病理特征的系统性自身免疫病,关节滑膜成纤维细胞的异常增殖及凋亡减少是滑膜组织增生的重要发病机制之一。已有研究报道钙网织蛋白(Calreticulin,CRT)可能与RA的发病有关。本课题组前期研究亦发现,CRT在RA患者血清、滑膜及关节液中均呈现高表达,血清CRT表达量与RA患者的疾病活动度评分DAS28正相关,且CRT可通过NO途径参与RA滑膜血管翳的形成。有研究报道CRT可抑制胞外死亡受体途径之一的Fas-Fas L介导的T细胞凋亡进而参与RA的发病机制。本课题拟探讨CRT通过调节抗凋亡蛋白c-FLIP表达进而抑制胞外死亡受体途径介导的RA滑膜成纤维细胞凋亡,进而参与RA滑膜增生及炎症浸润的发病机制,为临床RA滑膜炎症的靶向治疗提供新的理论依据和实验基础。方法1.于2014年1月至2015年5月收集行关节镜及膝关节置换术患者的标本进行实验研究。关节滑液标本包括:RA患者32例,OA患者37例。滑膜组织标本包括:RA患者14例,OA患者19例。2.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RA及OA患者关节滑液中CRT的含量。3.采用免疫组织化学方法分析CRT和c-FLIP蛋白在RA及OA滑膜组织中的表达和定位并对结果进行半定量分析;同时对CRT及c-FLIP的表达量进行相关性分析。4.采用联合酶消化法分离RA及OA滑膜成纤维细胞并进行培养,观察分析RA及OA滑膜成纤维细胞在体外生长的特性。5.采用CCK-8试验分析CRT对RA滑膜成纤维细胞增殖能力的影响。6.采用流式细胞技术分析CRT对TRAIL诱导的RA滑膜成纤维细胞凋亡的影响。7.采用细胞免疫荧光方法检测RA滑膜成纤维细胞中CRT及c-FLIP蛋白的表达及细胞定位。8.采用免疫印迹法(Western Blot)及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测RA滑膜成纤维细胞中c-FLIP蛋白及m RNA的表达,分析外源性CRT对滑膜成纤维细胞表达c-FLIP的影响并评估CRT介导的c-FLIP表达在NF-κB信号通路活化中的作用。9.采用SPSS 20.0软件包进行统计学分析。计量资料以(?)±s表示。分别采用t检验、SNK-q检验、Pearson线性相关性分析等进行相关的统计学处理。检验水准为双侧α=0.05。结果1.ELISA结果显示,RA患者关节滑液中CRT含量[(7.2±3.0)ng/ml]显著高于OA患者[(3.8±0.6)ng/ml](t=6.724,P<0.01)。2.免疫组织化学结果显示,RA关节滑膜组织CRT和c-FLIP均呈高表达,滑膜组织的衬里层和衬里下层、炎性细胞及血管周围有较多阳性染色。相较而言,OA滑膜中CRT和c-FLIP仅在衬里层及血管周围有极少量的表达。RA滑膜组织中CRT的表达量与c-FLIP呈正相关。3.两组刚贴壁的细胞呈圆形,后逐渐延伸为长梭形或纺锤形。RA患者滑膜成纤维细胞原代细胞在接种后12~24h即开始贴壁,4~5天后铺满瓶底,OA患者滑膜成纤维细胞原代细胞贴壁生长缓慢,接种后24~48h开始贴壁,直至7~8天后达到融合状态。传代后细胞生长变快,RA组细胞每2~3天即可传代1次,而OA组细胞传代需培养3~4天。4.CCK-8结果显示,CRT具有促进RA滑膜成纤维细胞增殖的作用。5.CRT对凋亡诱导剂TRAIL诱导的RA滑膜成纤维细胞凋亡具有抑制作用。6.qRT-PCR、Western Blot以及细胞免疫荧光检测结果均表明,与OA患者的滑膜成纤维细胞相比,RA患者滑膜成纤维细胞中CRT和c-FLIP的m RNA及蛋白表达水平均明显升高。7.q RT-PCR和Western Blot的检测结果显示,不同剂量的人重组CRT作用后,RA滑膜成纤维细胞中c-FLIP的m RNA表达水平和蛋白表达水平均升高,且c-FLIP表达水平的升高呈CRT浓度依赖性。8.在CRT的作用下,RA滑膜成纤维细胞中p-NF-κB表达水平明显升高,而总NF-κB蛋白表达水平没有明显的改变。应用NF-κB信号通路抑制剂后,CRT上调RA滑膜成纤维细胞中c-FLIP表达的作用被抑制。结论1.CRT与c-FLIP在RA患者滑膜组织中的表达量均升高,且CRT与c-FLIP在RA患者滑膜组织中表达量呈正相关2.体外实验中发现,RA滑膜成纤维细胞中,CRT与c-FLIP均呈高表达,CRT可上调RA滑膜成纤维细胞c-FLIP的表达,且具有剂量依赖性。3.CRT可能通过调节RA滑膜成纤维细胞中抗凋亡蛋白c-FLIP的表达激活NF-κB通路进而参与RA滑膜组织增生及炎症持续过程。本课题研究结果提示RA患者滑膜成纤维细胞CRT及抗凋亡蛋白c-FLIP表达增加,且CRT可能通过调控c-FLIP的表达使得滑膜成纤维细胞凋亡减少,且可能通过对c-FLIP的调节激活NF-κB信号通路,进而促进RA滑膜组织增生及炎症反应,参与RA病理机制。
刘存, 董金波[8]2009年在《Fas/FasL系统与类风湿关节炎发病机制的研究进展》文中指出类风湿关节炎是机体对自身滑膜发生免疫反应的疾病,其主要病理特征是滑膜增生和多种炎症细胞的浸润。滑膜增生的有关机制仍不清楚,目前认为可能是滑膜细胞和炎症浸润细胞数量增加及凋亡相对减少,即细胞凋亡程度不及增殖程度所致。Fas/FasL系统是细胞凋亡的重要途径之一,通过影响滑膜细胞的Fas/FasL表达可以诱导其凋亡。本文对Fas/FasL的性质、结构、功能、Fas/FasL与RA发病机制及RA治疗的关系进行综述。
潘东梅[9]2018年在《山柰酚诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和周期阻滞作用的研究》文中进行了进一步梳理研究背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是指以滑膜关节中的慢性炎症为特征的,慢性和系统性自身免疫性疾病。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)在软骨破坏中发挥重要作用。激活的RA FLSs与肿瘤细胞具有多种生物学特性,并通过积极增殖和抗凋亡而在血管翳形成中发挥重要作用,最终导致关节骨和软骨的破坏。因此,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞在RA中发挥治疗作用。断藤益母汤是导师治疗RA系列经验方之一,在临床抗RA治疗中有确切疗效,但其物质基础尚未阐明。课题组前期已采用UFLC-Q-TOF-MS/MS技术结合血清药物化学方法分析断藤益母汤的活性成分,初步筛选出山柰酚(Kaempferol)为可能活性成分之一。山柰酚是一种黄酮类化合物,既往研究表明其具有抗癌、抗炎、抗氧化等多种药理学作用,但对于诱导RA FLSs凋亡和周期阻滞作用的研究,至今国内外尚未见报道。由于山柰酚对于肿瘤、骨关节炎以及其抗菌活性及其涉及的调节机制与炎症及免疫调节密切相关,因此本研究推测:山柰酚对RA异常生物学行为也具有调控作用。为此,该论文选择断藤益母汤中抗炎活性成分较好的山柰酚进行深入研究,分别在类风湿关节炎细胞模型和动物模型上系统的考察了药物的疗效,并从分子水平上阐明了药物作用的机制,确定了药物作用的靶点,这不仅为山柰酚治疗RA提供理论支持和实验依据,还将为断藤益母汤的“多成分—多靶点—多途径”整合机制研究,为其临床应用,为中药复方研究的现代化提供科学依据,为研发RA创新药物奠定基础。一、山柰酚诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和周期阻滞作用的研究目的:1.培养和鉴定RA FLSs。2.研究山柰酚对RA FLSs生长形态、生存率及增殖率的影响3.研究山柰酚诱导RA FLSs凋亡和周期阻滞的作用。方法:收集符合美国ACR 1987年RA诊断标准的9例患者,通过膝关节镜下滑膜切除术或膝关节置换手术后取得其滑膜组织,采用组织块培养法进一步分离培养成滑膜成纤维细胞(RA FLSs)。采用光学显微镜观察体外分离培养的细胞形态。采用细胞免疫荧光法对FLS中特异表达的vimentin蛋白进行鉴定。用不同浓度的山柰酚处理细胞后,采用CCK-8法检测山柰酚对RA FLSs细胞生存率的影响,倒置显微镜下观察细胞形态变化,采用EdU法检测细胞增殖率,采用流式细胞术检测细胞的凋亡率及周期阻滞情况。结果:光学显微镜下观察体外分离培养的原代细胞,组织贴壁后5-7天可见细长型细胞从组织边缘爬出,逐渐增多呈放射状。3～4周后渐覆盖瓶底70%～80%。3代后细胞类型逐渐纯化,细胞呈长梭型,胞核卵圆形居中,形态与FLSs相符。采用细胞免疫荧光实验显示细胞表达vimentin高表达,根据以上结果,本研究认为本研究培养的细胞为RA FLSs。CCK-8实验结果显示:使用25μM、50μM、100μM、200μM山柰酚和20μMMTX处理RA FLSs 24h,细胞活力下降。和空白对照组比较,山柰酚组(100μM、200μM)和MTX组RA FLSs的细胞活力显著下降(P<0.05或P<0.01),故后续应用100μM、200μM的山柰酚和20μM MTX干预RA FLSs研究。EdU法实验结果显示:经过100μM、200μM的山柰酚和20μMMTX干预后,RA FLSs增殖率相对于空白对照组显著下降(P<0.05或P<0.01),且呈浓度依赖性,提示山柰酚和MTX可抑制RA FLSs的增殖。凋亡检测结果显示:与空白对照组比较,山柰酚组和MTX组凋亡率增加(P<0.05或P<0.01),提示山柰酚和MTX可诱导RA FLSs发生凋亡。细胞周期检测结果显示:与空白对照组比较,山柰酚组和MTX组的G0/G1期细胞比例上升(P<0.05或P<0.01),S期的细胞比例无显著变化(P>0.05),而G2/M期细胞比例显著下降(P<0.05或P<0.01)。其中,在山柰酚200μM高剂量干预组中,G0/G1期的细胞增加约34%和G2/M期的细胞减少约32%。提示山柰酚和MTX可诱导G0/G1期的RA FLSs生长阻滞。结论:山柰酚抑制类风湿关节炎纤维细胞样滑膜细胞的增殖,诱导RA FLSs凋亡和周期阻滞。因此,山柰酚可能具有治疗RA的治疗潜力。二、山柰酚诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和周期阻滞的分子机制研究目的:研究山柰酚诱导RA FLSs凋亡和周期阻滞的分子信号机制。方法:取培养至3-5代并经过鉴定的RA FLSs进行实验。采用免疫印迹法检测细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4表达水平和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9表达水平以及,以及PI3K、Akt及其磷酸化水平。免疫印迹法检测PI3K抑制剂(LY294002)对RA FLSs周期相关蛋白和凋亡相关蛋白表达的影响。流式细胞术检测PI3K抑制剂(LY294002)对细胞凋亡和周期阻滞的影响。结果:免疫印迹法显示,山柰酚干预组中,凋亡相关蛋白Bcl-2及PI3K和Akt蛋白磷酸化表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01),Bax、Cleaved Caspase 3和Cleaved Caspase 9表达水平上升(P<0.05或P<0.01)。PI3K蛋白抑制剂(LY294002)干扰后增强了山柰酚对RA FLSs的作用:与山柰酚组比较,LY294002联合山柰酚组细胞活力和凋亡率均下降;Bcl-2及Akt蛋白磷酸化表达水平明显降低(P<0.05),Bax、CleavedCaspase3和Cleaved Caspase 9表达水平上升(P<0.05)。免疫印迹法显示,山柰酚干预组中,细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin dependent kinase,CDK4)表达水平下降(P<0.05或P<0.01)。PI3K蛋白抑制剂(LY294002)干扰后增强了山柰酚对RA FLSs的作用:与山柰酚组比较,LY294002联合山柰酚组或者G0/G 1期的细胞比例上升,而G2/M期的细胞比例显著下降(P<0.05);Cyclin D1和CDK4表达水平均下降(P<0.05)。结论:山柰酚可以通过PI3K/Akt信号通路诱导RA FLSs凋亡和周期阻滞。三、山奈酚对小鼠胶原诱导性关节炎的治疗作用目的:观察山柰酚对CIA小鼠关节炎模型的治疗作用。方法:48只SPF级DBA/1雄性小鼠,7-8周龄,实验分组:模型组,山柰酚(高、中、低剂量)组,甲氨蝶呤组(MTX)。以正常小鼠作为正常对照组,以MTX为阳性对照。每组样本量为8只。应用经典的RA模型—胶原诱导性关节炎(CIA)模型,实验各组在RA小鼠模型第二次免疫时即在造模第21天开始给予相应的处理,山柰酚(高、中、低剂量)组,分别给予山柰酚200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg,每天灌胃1次,连续28天。甲氨蝶吟(MTX)组,参照文献方法,给予2mg/Kg,每3天灌胃1次,连续9次。模型组和正常对照组给予等体积溶媒,每天灌胃1次,连续28天。每4天观察检测小鼠一般情况,并进行小鼠关节炎评分。检测指标:计算脾指数、踩关节采用HE染色观察其病理变化和采用荧光Tunel法检测滑膜细胞的凋亡情况、ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达量。结果:动态评估小鼠关节炎严重程度:与模型组比较,给药9天后山柰酚高剂量组小鼠关节炎得分显著下降(P<0.05或P<0.01),给药13天后山柰酚中剂量组和MTX组小鼠关节炎得分亦明显下降(P<0.05),山柰酚低剂量组小鼠关节炎得分虽有下降趋势,但无统计学意义(P>0.05)。脾指数:与正常组比较,模型组小鼠脾指数有升高趋势(P<0.01),与模型组比较,各治疗组小鼠脾指数有下降趋势,且山柰酚高剂量和MTX组具有统计学意义(P<0.05)。实验各组小鼠血清炎症因子改变:造模后,模型组较正常组IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显上升(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,各治疗组IL-1β、IL-6、TNF-α表达降低,山柰酚高、中剂量组和MTX组IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著降低具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。实验各组小鼠踝关节HE染色病理学:模型组滑膜细胞增生显著、排列杂乱,大量炎性细胞浸润,关节软骨和骨质破坏;各治疗组小鼠关节滑膜增生减轻,炎性细胞浸润减少,骨质破坏范围缩小,部分关节结构有所修复。与模型组比较,各治疗组小鼠病理学评分有下降趋势,山柰酚高、中剂量组和MTX组病理学评分显著下降具有统计学差异(P<0.05)。实验各组小鼠踝关节TUNEL染色病理学:与模型组比较,各治疗组小鼠滑膜细胞凋亡率有上升趋势,山柰酚高、中剂量组和MTX组滑膜细胞凋亡率显著上升具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)结论:山柰酚能有效缓解CIA小鼠关节炎症状,抑制滑膜炎症、关节软骨及骨质破坏。山柰酚对RA的滑膜炎症以及随后的关节破坏均有一定的治疗作用。
张薇, 丁景春, 丁汉飞, 王世捷, 郭雄[10]2007年在《类风湿关节炎滑膜细胞凋亡及相关基因Fas表达的研究》文中研究说明目的:研究类风湿关节炎(RheumatoidArthritis,RA)患者滑膜组织中细胞凋亡及相关基因蛋白Fas的表达和意义。方法:采用免疫组织化学方法,对9例患者及8例正常对照滑膜组织中凋亡细胞及Fas的表达进行检测。结果:RA患者滑膜组织中细胞凋亡率明显低于对照组,而Fas阳性的细胞百分比却明显高于对照组。结论:RA患者滑膜组织中细胞凋亡的减少可能是导致滑膜过度增生进而关节功能丧失的原因之一,Fas表达虽增多但不能直接诱导细胞凋亡。
参考文献：
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[10]. 类风湿关节炎滑膜细胞凋亡及相关基因Fas表达的研究[J]. 张薇, 丁景春, 丁汉飞, 王世捷, 郭雄. 实用医技杂志. 2007
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