杨小林[1]2003年在《高毒力Bt菌株筛选及其对甜菜夜蛾生长发育的影响》文中提出甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hbner)]是一种重要的世界性蔬菜害虫，对菊酯类和有机磷类化学农药产生了很高的抗性；而相比一些敏感昆虫而言，甜菜夜蛾对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称B.t.)不敏感，另一方面个别品系又产生了抗性。因此缺少高效有毒菌株是B.t.制剂广泛运用于甜菜夜蛾防治的严重制约因素，不断地寻找对甜菜夜蛾具有高毒力的B.t.菌株十分必要。此外，高效毒力B.t.菌株的筛选及其毒力特性的研究对合理轮换使用不同类型的菌株，以降低选择压力、延缓抗性的发展，也具有很重要的现实意义。 本研究首先从23株出发菌株中筛选出对甜菜夜蛾1日龄幼虫有较高毒力的菌株5株，经过多轮次摇瓶复筛，选出对甜菜夜蛾具有最高毒力的菌株YL-17，其48小时摇瓶发酵液对甜菜夜蛾1日龄幼虫的LC_(50)为1.57ul/ml。接着运用液体双相分离法，纯化YL-17的晶体与芽孢；取其发酵液及纯化晶体进行SDS-PAGE凝胶电泳，测定菌株的晶体含量、晶体蛋白的分子量，研究该菌株的晶体蛋白特性，其晶体含量为5.2ug／ul，晶体蛋白质的分子量分别为68.5kDa、76.3kDa、91.9kDa和130.8kDa。晶体、芽孢、及二者不同比例混合物对甜菜夜蛾1日龄幼虫的毒力研究表明该菌株的毒力主要来源于晶体，但其芽孢也有部分毒力；且芽孢与晶体在总浓度相同的情况下以不同比例相混合的实验结果表明，芽孢与晶体的比例为1：1时芽孢对杀虫晶体蛋白的毒力有很好的增效作用；纯化晶体、芽孢及孢晶混合物感染甜菜夜蛾1日龄幼虫后，其48小时的LC_(50)分别为：22.06ug/ml、230.18ug/ml、20.23ug／ml。 菌株YL-17对甜菜夜蛾生长发育的影响研究表明：该菌株的毒素对虫卵的孵化率无明显影响，但影响初孵幼虫的存活率；甜菜夜蛾幼虫的存活率随B.t.处理浓度的下降而上升；3龄幼虫的生长量随B.t.处理浓度的下降而呈上升趋势；处理组中除在60ug／ml和120ug／ml浓度下没有幼虫完成整个发育外，在30ug／ml、15ug／ml、7.5ug/ml、3.75ug／ml处理浓度下幼虫发育历期随浓度的增加而延长；除在3.75ug／ml处理浓度下，化蛹率、羽化率和成虫产卵量与对照没有显着差异外，处理组30ug／ml、15ug／ml、7.5ug/ml浓度与对照组有显着差异(P＜0.05)，且随浓度的增加化蛹率、羽化率有下降趋势；处理组(浓度3.75ug/ml)与对照组在成虫产卵量上的结果表明：B.t.药液对甜菜夜蛾雌虫的平均产卵量没有显着的影响，但对雌虫产卵高峰期的到来有一定的延迟作用；研究还表明B.t.毒素对甜菜夜蛾幼虫的雌雄性发育没有影响，雌性与雄性甜菜夜蛾对苏云金杆菌的敏感性无差异。 发酵上清液对菌株本身的毒力有很好的增效作用，未移走任何上清液时(上清液浓度为100％)，LC_(50)为1.63ul／ml，而移走全部上清液时(上清液浓度为0％)，即孢晶混合物的LC_(50)为4.1ul／ml。换而言之，即对同一标准品而言，含有全部上清液的发酵液的毒力是发酵液中上清液浓度为0％时毒力的2.52倍。菌株YL-17与几种化学农药单剂米满、毒死蜱、功夫、除尽分别混配的试验表明：与YL－17具有最好联合毒力作用的化学农药单剂是除尽，二者间的最佳混配比例为l．2：3，其72小时的LC。。为5．02mg／L。
李倩, 任相亮, 胡红岩, 姜伟丽, 马亚杰[2]2017年在《有效防治甜菜夜蛾的Bt毒素种类及其应用前景》文中进行了进一步梳理甜菜夜蛾对不同种类Bt毒素的敏感性存在差异。归纳总结了可有效防治甜菜夜蛾的Bt毒素种类、作用效果,并简述其应用前景,以期为提高Bt毒素对甜菜夜蛾控制力度提供依据。
刘铭[3]2001年在《几株芽孢杆菌对杀虫苏云金杆菌菌株的增效作用研究》文中进行了进一步梳理本文第1章全面考察了几丁质酶在所有苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)70个血清型的不同菌株中的分布，采用比色法完成了不同菌株几丁质酶的定性和定量分析。在检测的70个菌株中，有38株在pH7.0的诱导培养液中表现出几丁质酶活性，其中17株在pH10.0条件下仍有酶活。这说明该酶在苏云金杆菌中普遍存在，但与几丁质酶高活性菌株沙雷氏菌(Serretia marcescens)菌株相比，大多数菌株的酶活性较低。对两株几丁质酶活性较高的Bt菌株T04A001和T13003的产酶特性及生物学特性进行了研究，发现两菌株均在pH7.0时产酶量最大，分别为355 U／ml和314U／ml，无论是在酸性还是碱性诱导条件下酶产量均明显降低。以甜菜夜蛾(Spodoplera exigua)初孵幼虫为对象的生物测定表明，两菌株的诱导培养液均对苏云金杆菌菌株DL5789有明显的增效活性，增效效果分别为2.35倍和1.52倍，说明苏云金杆菌的几丁质酶同样有助于提高杀虫效果。对几株产酶菌进行PCR检测，证明其基因组中存在几丁质酶基因。部分菌株所产生的几丁质酶的SDS-PAGE与Western blotting表明，这些菌株所产生的几丁质酶分子量约为61KD，与Ha sNPV的几丁质酶有较高的同源性，推测他们可能同属于ChiA家族。 本文第2章在筛选对高毒Bt菌株具有增效活性的蜡状芽孢杆菌(B. cereus)和产几丁质酶的Bt菌株的基础上，建立了一套增效菌株与高毒菌株的混合发酵技术，使其增效效果得到明显提高。通过筛选和混合发酵，发现蜡状芽孢杆菌菌株Ym2102与苏云金杆菌菌株DL5789混合发酵的增效效果最好，其发酵液对甜菜夜蛾初孵幼虫的LC_(50)仅为0.218μL／g，而DL5789单独发酵的发酵液对甜菜夜蛾初孵幼虫的LC_(50)高达1.047μL/g，增效效果为4.81倍；DL5789单独发酵的发酵液对甜菜夜蛾二龄幼虫和叁龄幼虫的毒性很低，分别为2.151μL／g和4.115μL/g，而混合发酵液的对他们的毒效分别为0.387μL／g和0.743μL／g。不仅如此，混合发酵后制剂的稳定性也明显得到改善，克服了DL5789发酵液毒效不稳定、不易长期保存的缺点。混合发酵后制剂对棉铃虫(Heliothis amigera)初孵幼虫也有明显的增效效果，说明混合发酵对不同虫种都有增效作用。对混合发酵的生物学特性的研究表明，混合发酵的细菌的生长情况、pH变化以及毒力变化 中国仆学写硕士研究生牛业论文 儿株芽地杆菌对杀虫苏云金仟菌菌株的增效什用研穷都有别于DL5789单独发酵。YmZ102与其仙Rt菌株的混合发酵结果表明，混合发酵增效途径是广泛存在的。对混合发酵机理的初步探讨表明，菌数的增加可能是导致毒力提高的主要因素；YmZ102的发酵上清液对DL5789发酵液的毒力提高起一定的作用，但其作用机理还有待深入研究。
戴小枫[4]2003年在《中国植物保护科学技术发展战略研究》文中提出中国农业生物灾害每年造成了巨大损害，常年发生灾害面积超过30亿亩次，损失粮食15％、棉花25％以上，严重制约农产品产量与质量的提高，危及粮食安全、食品安全、生物安全、生态环境保护和可持续发展，研究中国植物保护科学技术的发展战略是一个迫切需要解决的重大问题，具有理论和实践意义。这是一个综合性和专业性密切结合的复杂问题。为此，作者综合运用多学科的多种方法，从植物保护科学技术的不同层面和方向，进行了系统的分析与综合研究。 本项研究是第一次比较系统地探讨21世纪农业发展新时期中国植物保护技术的发展战略问题，重点在以下领域进行了创新性的探索： 一是系统的分析了国际植物保护科学技术发展的趋势：论文以我国植物保护科学技术发展战略为重点，从农业减灾、生态安全、可持续发展和现代高新技术农业应用等多角度对我国农作物重大病虫草灾害的预防与控制技术的发展现状、技术研究与应用面临的问题和挑战，中国与国际先进水平的差距等问题进行了系统的综合分析，对与植物保护技术发展战略密切相关的关键技术领域进行了重点的回顾、总结和评述，对当前国际植物保护技术的发展现状和动态进行了深入的探讨，总结提出了生物技术应用空前加速、数字化发展全面渗透、技术的环保性和效益性要求更加严格、GMO安全性和外来生物入侵预防与控制问题异军突起、“一地多灾”综合灾变机理研究已现端倪、区域性多对象多目标可持续控制势在必行等国际植物保护科学技术发展的趋势和方向； 二是首次提出了中国植物保护科学技术的发展模式和道路：在系统回顾、总结分析国际植物保护科学与技术发展历程的基础上，凝练出带头学科交替拉动和科学革命质变起爆的植物保护科学发展模式，需求牵引的单个技术更迭与科学先导的技术体系综合发展等植物保护技术发展规律，给出了未来中国植物保护科学技术发展“生物技术一马当先，高新技术多点起爆，互作机理核心支撑，4部引擎联合驱动，全面推进植物保护科学技术革命，建立为全面建设小康社会宏伟目标提供支撑的新型植物保护科学技术体系”的模式和发展道路。 叁是综合性地提出了我国植物保护科学技术发展的总体战略、发展目标、优先方向和重点研究内容：重点研究和系统阐述了生物农药、环境相容化学农药、农业转基因安全和危险性外来生物预防与控制研究等“4部引擎”的发展思路、战略、目标，以及植物保护科学技术在基础性工作、基础研究、高技术前沿、关键技术等不同技术层次的重点研究内容，提出了新时期我国植物保护科学技术研究发展的优先方向是有害生物一作物互作机理研究、生物农药创制、环境相容化学农药开发、农业转基因安全和危险性外来生物预防与控制研究等五大领域;针对植物保护科学技术自身特点、发展规律和我国现状，提出了在“预防为主、综合防治”植保方针下，未来植物保护科学技术发展中应始终把握和坚持“4个紧密结合”的原则，即宏观与微观紧密结合，生物技术与信息技术紧密结合，关键技术研究与基础研究、基础性工作紧密结合，前沿高技术与传统常规技术紧密结Z‘ 四是创新性地提出了相应的植物保护科学技术发展的对策与建议: 1.从组织制度和体制创新的角度，提出了把农业有害生物灾害预防与控制问题纳入国家生物安全整体战略的发展新观念，提出了成立农业生物灾害国家管理委员会，建立官方植保官制度，改革我国农林动植物有害生物检疫检验管理体制，建立农业生物灾害公共危机应急控制制度和机制，完善动植物有害生物预防控制测报系统，加强动植物有害生物防灾减灾保障系统建设。 2.从依法治国的角度，在完善和建立国家法律法规体系中，提出新建立“植物检疫与植物保护法”、“官方植物保护官试行条例”、“外来入侵生物预防与控制法”、“国家农业生物灾害预防与控制法”等法规，以及修改和补充“农业法”、 “环境保护法”、“对外贸易法”、“国家公共安全法”、“刑法”等法律法规的相关条款，和有法必依、执法必严等政策建议。 3.从国家产业政策和投资政策的角度，研究提出了坚持农业生物灾害的社会公益性质不动摇、农业科研公益性定位不动摇、农业科研基地国家投资主体地位不动摇、农业科学技术的完整体系不动摇、政府为主体的投入渠道和机制不动摇、坚持政府对公共产品实行积极干预的方针，坚持国家目标与市场目标相结合的原则，用好世贸组织的绿箱政策、改革国家财政对农业科技现有的支持方式、增加国家财政对植物保护技术科研与推广应用的投入等政策建议。 4，在国家科技政策建议中，针对一植物保护科学技术创新能力和保障支撑体系建设，提出了建设“一个中心五大基地”(即植物保护基础研究创新中心、外来生物入侵预防与控制基地、农业应用微生物基因资源与基因改良研究基地、农业转基因产品安全性评价研究基地、新型农药创制基地、有害生物可持续控制技术研究基地为核心的学科体系、创新能力建设)的布局和建议，以此为基础建设以国家植物保护科研基地为核心、区域性植物保护技术创新中心为支撑和网络的国家植物保
赵晓峰[5]2016年在《粘质沙雷氏菌PS-1菌株对甜菜夜蛾幼虫杀虫机理的初步研究》文中提出甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hübner,属于鳞翅目、夜蛾科、灰翅夜蛾属,是一种世界性分布的多食性农业害虫,主要为害蔬菜。该虫抗药性强,目前已经发现对多种杀虫剂(如有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、昆虫生长调节剂类等)和Bt制剂产生了抗性。因此,找到一种新型生物药剂防治甜菜夜蛾成为迫切需要。粘质沙雷氏菌Serratia marcescens PS-1菌株(以下简称PS-1菌株)是从罹病黄曲条跳甲幼虫体内分离获得的一种新的病原菌,它对甜菜夜蛾幼虫的生长发育和存活有显着的抑制作用,且菌体培养物的上清液对甜菜夜蛾也有很强的杀虫活性。为了明确PS-1菌株的杀虫机理,本文进行了PS-1菌株的生理生化试验,观察了甜菜夜蛾幼虫感染PS-1后的病症,并采用组织切片和透射电镜的方法研究了甜菜夜蛾幼虫感染后的中肠组织病理变化,分离培养了甜菜夜蛾幼虫肠道共生细菌,并测定了PS-1菌株对甜菜夜蛾肠道共生细菌的影响以及消化酶活性的影响,旨在进一步阐明PS-1菌株的杀虫机理,为甜菜夜蛾的生物防治提供新方法,为PS-1菌株的研发和田间应用提供依据。现将主要结果摘要如下:1.PS-1菌株的生理生化特性PS-1菌株在恒温28℃,转速为160r/min,LB液体培养基中生长较为迅速,约4h后进入对数生长期,20~32h为稳定期并达到生长最大值,32h之后菌体进入衰亡期。生理生化试验表明:PS-1为革兰氏阴性菌,能够利用葡萄糖、甘露醇,肌醇,不能利用山梨糖醇、鼠李糖和阿拉伯糖,且利用效果为甘露醇>葡萄糖>肌醇。PS-1菌株不产生溶血,M.R.试验为阴性,H2O2试验产气,解脂活性试验表现阳性,吲哚试验呈阳性,抗生素药敏试验表明PS-1菌株对氯霉素、壮观霉素和四环素敏感,抑菌圈直径由大到小顺序为壮观霉素>氯霉素>四环素,PS-1菌株对氨苄青霉素不敏感。2.PS-1菌株破坏甜菜夜蛾幼虫肠道细胞和细胞器结构运用切片技术和显微技术观察了PS-1菌株对甜菜夜蛾幼虫中肠肠道细胞结构的影响。结果表明:PS-1菌株能够破坏甜菜夜蛾幼虫中肠肠壁细胞,使肠壁细胞变形甚至脱落到肠腔,且随着处理时间的延长,破坏作用增强。用透射电镜法观察了PS-1作用后对甜菜夜蛾幼虫肠道细胞器的影响。结果表明:被感染虫体细胞微绒毛排列无规则,有的甚至脱落,线粒体和核仁发生病变,部分细胞器消失,细胞内出现空洞。3.PS-1菌株影响甜菜夜蛾肠道内共生细菌的组成用含PS-1菌悬液(2.0×108cfu/g)的含菌饲料饲喂甜菜夜蛾幼虫后,对其体内的肠道可培养共生细菌进行了分离培养,鉴定出3种共生细菌,它们分别是克雷伯氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌;通过高通量测序的方法鉴定了甜菜夜蛾肠道共生细菌的种类及其组成,共聚类314个OTU,总共注释到7个门、11个纲、38个目、50个科、71个属,其中,优势菌群主要有厚壁菌门及变形菌门的细菌,分别占90.05%和9.65%;在属分类级别上,普罗维登斯菌属是优势属,占30.85%。丰度高的前15种共生细菌依次为普罗维登斯菌属、不动杆菌属、埃希氏杆菌属、铜绿假单胞菌、寡养单胞菌属、鞘氨醇单胞菌、葡萄球菌属、乳杆菌属、奈瑟氏菌属、肠球菌属、棒状杆菌属、沃尔巴克氏体属、伟荣氏球菌属、支原体属和链球菌属。与对照组相比,PS-1菌悬液处理后的甜菜夜蛾幼虫中肠共生细菌丰度发生了很大变化,普罗维登斯菌属明显增多,寡养单胞菌属明显减少,不动杆菌属增多。分析结果表明,PS-1菌株显着地影响了甜菜夜蛾幼虫肠道共生细菌的组成。4.PS-1菌株对甜菜夜蛾肠道内消化酶活性的抑制作用结合代谢酶学方法测定了PS-1菌株对甜菜夜蛾幼虫中肠淀粉酶和蛋白质酶活性的影响。结果表明:PS-1菌株对甜菜夜蛾中肠淀粉酶活性有明显的抑制作用,但不同浓度处理之间差异不显着。PS-1菌株对蛋白酶活性也表现出抑制作用,并随着处理浓度的增加抑制作用明显增强。其中,用含2.0×108cfu/g浓度PS-1菌株的处理组对甜菜夜蛾幼虫中肠蛋白质酶活性的抑制作用最强,抑制率达44.42%。
郑大胜[6]2006年在《苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的异源表达和遗传改良》文中研究指明苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种自然界中广泛分布的好气芽胞杆菌，由于对昆虫具有特异性毒杀作用，不污染环境和对人畜无害，成为目前应用最广、产量最大的生物杀虫剂菌种。其杀虫活性主要依赖于在芽胞期产生的杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)或称δ-内毒素。本文研究了Bt杀蚊毒素蛋白在水生革兰氏阴性菌中的异源表达及表达调控分析，并进行了Bt杀虫毒素的遗传改良，分别获得了几株杀虫活性和持效性得到改良的杀蚊和杀虫工程菌株。在蚊幼虫天然食物之一的离中不粘柄菌(Asticcacaulis excentricus，Ae)中已成功表达Bti的杀蚊毒素Cry11Aa的基础上，将另一个具有协同杀蚊作用和阻抑蚊虫抗性产生的Bti杀蚊毒素的基因cyt1Aa转入Ae中表达。分别构建了含有cyt1Aa基因和同时含有cry11Aa基因的重组质粒pSODCyt20和pSODCryCyt20，获得相应的Ae重组子Ae-Cyt20和Ae-CC20。尽管重组质粒pSODCryCyt20中插入的cyt1Aa基因和cry11Aa的DNA序列正确，而且在重组菌株Ae-CC20中能检测到cry11Aa和cyt1Aa基因的mRNA，然而Ae-Cyt20和Ae-CC20只能分别表达Cyt1Aa和Cry11Aa蛋白，Ae-CC20菌株不能共表达两类毒素蛋白，因此认为Ae-CC20中cyt1Aa的表达受转录后水平因子调控。为了进行cyt1Aa和cry11Aa的共表达，在pSODCryCyt20中cyt1Aa基因的上游插入一个单独的启动子，构建了同时含有两基因的重组质粒pSODCryPCyt20，获得重组子Ae-CPC20，结果两基因都获得表达，表达产物对目标蚊幼虫具有协同毒杀作用。因此，认为cry11Aa和cyt1Aa在Ae中的共表达需要两个独立的启动子，这可能与其有着特殊的RNA系统、修饰限制系统有关。虽然表达的Cyt1Aa蛋白影响了Ae-CPC20的生长和发育，导致该重组菌株生长缓慢、终培养液的菌密度较低，但由于Cyt1A与Cry11A的协同杀蚊作用，Ae-CPC20对敏感和抗性致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的毒力分别是Ae-CC20的2.21倍和12.6倍。此外，Ae-CPC20菌株抗紫外线的能力比野生型Bti菌株强，因此该工程菌株在蚊虫的生物防治中具有潜在的应用价值。同时，本研究通过Bt不同Cry蛋白之间毒性区域的结构域交换而获得具有特异性杀虫活性的杂交晶体蛋白。通过Cry1Ca和Cry1Ab、Cry11Aa和Cry11Bb的结构域Ⅱ-Ⅲ的互换，在Bt无晶体突变菌株中进行了杂交毒素蛋白Cry1CAA和Cry11ABB的表达，得到了形态、蛋白质分子量大小和免疫原性都与野生型蛋白相符合的伴胞晶体。生物测定表明，杂交晶体Cry1CAA对棉铃虫的毒力(按LC_(50)计算)分别是Cry1Ab和Cry1Ca的55.8％和3.26倍，对甜菜夜蛾的毒力分别是Cry1Ab和Cry1Ca的4.08倍和35.5％；杂交晶体Cry11ABB对敏感和抗性库蚊的LC_(50)值分别为339.2和245.1 ng／ml、其毒力分别比野生型的Cry11Aa分别高40％和25％。证明晶体蛋白不同结构域的片段交换可以用于晶体蛋白的遗传改良，此研究将为探究Cry蛋白的不同结构域的功能及不同结构域相互作用的关系和筛选高效的毒素蛋白奠定基础。
秦毅[7]2010年在《表达苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株的构建及其对斜纹夜蛾幼虫的肠道与体壁侵染力》文中研究表明球孢白僵菌(Beauveria bassiana)为典型的昆虫病原真菌,一般经昆虫体壁附着和穿透而侵染致死寄主,由于侵染潜伏期较长而对咀嚼式口器的暴食性害虫控制效果较差。菌株毒力改良往往基于内源体壁降解酶或外源毒素基因的导入,但少见利用昆虫肠道毒力因子改造菌株的成功报道。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)可分泌产生若干高效的营养生长期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins) Vip3A,对咀嚼式鳞翅目害虫表现很高的肠道毒力,但其很低的分泌量和非晶体结构的不稳定性,使其除了转基因抗虫植物的利用途径之外迄今未见可制剂化的利用途径。利用极易生产和剂型化的生防真菌分生孢子作为Vip3A之类肠道毒力因子的载体,发挥真菌孢体壁侵染和摄入后肠道感染的互补优势,是害虫微生物防治的新挑战。为此,本研究以暴食性斜纹夜蛾(Spodoptera litura)为对象,从筛选具有较高毒力的球孢白僵菌菌株入手,构建高表达Vip3Aal (Vip3A毒蛋白家族成员之一)的球孢白僵菌工程菌株,设计合理的方法评价工程菌株对斜纹夜蛾幼虫的毒力,以确认其经体壁附着、口器摄入或双途径侵染的杀虫效应。主要内容和结果分述如下：球孢白僵菌对斜纹夜蛾幼虫的菌株筛选为了筛选出对斜纹夜蛾具有较高毒力的球孢白僵菌作为Vip3Aal的受体菌株,对生物学性状和抗逆性状良好的12株球孢白僵菌,采用国际标准喷塔法分别对斜纹夜蛾二龄幼虫进行1x108个孢子/mL的高浓度体壁喷雾接种的生物测定,并以0.02%吐温80无菌水作为空白对照。接种后在25℃和12L：12D条件下饲养并逐日观察7天,试虫(每处理87～97头)的死亡率用对照死亡率(从第3天到第7天为1.11%～11.11%)进行校正。结果表明,在平均2473个／mm2的孢子附着量下,供试菌株引起的幼虫校正死亡率为33.9%～82.4%。除诱发死亡率过低的2株之外,其余10株供试菌高剂量接种对斜纹夜蛾二龄幼虫的致死中时LT5o在3.9～5.4天不等。其中,Bb2860菌株对斜纹夜蛾二龄幼虫的侵染力最强,致死率最高,作为后续毒力改造的受体菌株。杀虫蛋白Vip3Aal在球孢白僵菌中的转化表达与活性分析用芽生孢子转化体系介导,以草丁膦抗性基因bar为筛选标记,将vip3Aal基因导入球孢白僵菌野生株Bb2860 (BbW)中。通过一系列筛选鉴定,获得了一株生长和产孢性状良好且具有遗传稳定性的工程菌株BbV28。Western杂交和免疫胶体金定位分析显示,Vip3Aal蛋白在BbV28中组成型高表达且在其气生分生孢子细胞质呈均匀分布。用经浓度为5x108个孢子/mL的BbV28分生孢子悬液或60μg/mL原核表达的Vip3Aal溶液浸渍过的甘蓝叶片喂饲斜纹夜蛾四龄幼虫18h时后,幼虫出现个体缩小、麻痹等相同症状,而此时摄入相同浓度BbW分生孢子悬液或仅0.02%吐温80处理叶片的幼虫表现正常。用抗Vip3Aal兔血清多克隆抗体对取食BbV28分生孢子18和36 h后的四龄幼虫的中肠内容物提取液进行Western杂交,显示出与大肠杆菌表达的Vip3Aal处理组肠液样品中相同的清晰条带,主要条带的分子量约为62 kDa,与文献报道经中肠液消化后的Vip3A活性片段的分子量大小一致。与此相反,在摄入BbW处理的对照组幼虫的中肠液样品中,没有被上述多克隆抗体检测到任何信号。以上结果说明球孢白僵菌工程菌株BbV28的分生孢子在进入昆虫中肠后,可释放出其内表达的Vip3Aal并发挥其应有的肠道毒力因子作用。由此证明,球孢白僵菌分生孢子作为肠道毒力因子Vip3Aal的运送载体,通过昆虫咀嚼式口器摄入抵达中肠而发挥杀虫作用。转vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株不同侵染方式对斜纹夜蛾幼虫的毒力为合理评价转vip3Aal基因的工程菌株BbV28对靶标害虫的杀虫效力,采用全自动喷塔法,将工程菌株BbV28和野生株BbW的分生孢子分别以体壁感染(生测Ⅰ)、摄入感染(生测Ⅱ)和双途径复合感染(生测Ⅲ)的叁种不同方式接种斜纹夜蛾二龄幼虫,进行平行的生物测定。每个生测包含4×106、2×107and 1×108个/mL不同浓度的孢子悬液处理和仅0.02%吐温80无菌水的空白对照。由此,叁种浓度的孢子悬液喷雾分别产生低、中、高叁个接种剂量,分别为53-66、337-390和1242-1397个孢子/mm2。每剂量处理设3次重复,每重复接种试虫30-40头。每日更换新鲜的无菌(生测Ⅰ)或带菌(生测Ⅱ和Ⅲ)甘蓝叶片供试虫取食并逐日观察记录死亡率共7天,每日挑出虫尸并将保湿培养。所获数据用DPS软件进行两因素随机区组方差分析和时间一剂量一死亡率模型模拟分析。结果表明,两株菌接种后导致的幼虫死亡率都随接种剂量增加和接种后时间延长而升高。各菌株接种后第7天引起的幼虫累计死亡率在叁种生测间和叁个接种剂量间均差异显着。在同一接种浓度下,生测Ⅱ和Ⅲ中BbV28处理的幼虫死亡显着快于BbW的处理,而生测Ⅰ中两株菌导致的幼虫死亡趋势无显着差异。空白对照组的幼虫平均死亡率在生测Ⅰ～Ⅲ中无明显差异,分别为8.1%(±4.4),3.8%(±4.2)和6.2%(±3.3)。此外,在生测Ⅰ中,两株菌经体壁接触感染的幼虫均表现出相同的典型真菌致死症状,即保湿培养3天后的虫尸体表长出茂密的菌丝并产孢。在生测Ⅱ和Ⅲ中,经BbW感染致死的幼虫显示出与生测Ⅰ中相同的症状,而经由BbV28感染而死亡较早的幼虫则多个体萎缩变小,在相同条件下保湿培养3天后虫尸体表菌丝稀疏甚至无菌丝长出。各菌株不同接种方式的生测数据很好地拟合时间一剂量一死亡率模型,由此计算出各菌株随时间变化的致死中浓度LC50和随接种浓度变化的致死中时LT50。在主要经体壁感染的生测Ⅰ中,BbW和BbV28对斜纹夜蛾二龄幼虫的LC50值及其95%置信限随接种后天数的变化无明显差异,分别由第3天的2.6(0.8-8.5)×104和1.5(0.6-4.1)×104个孢子/mm2减少到第7天的750(571-985)和698(539-900)个孢子/mm2。而在生测Ⅱ和生测Ⅲ中,BbW和BbV28孢子对幼虫的LC50值的变化趋势具有显着差异。与生测Ⅰ相比,随着试虫在生测Ⅱ和生测Ⅲ中摄入BbV28孢子的机会增加,使得BbV28对试虫的LC50值比BbW在第3天分别降低定26.2和17.2倍,在第7天分别降低1.1和1.3倍。在生测Ⅰ中两株菌的LT50值随接种剂量增高而下降的趋势也十分相似。例如,在1000个在孢子/mm2剂量下,BbV28和Bb2860的LT50值分别为5.56和5.61天。而在生测Ⅱ和生测Ⅲ中,BbV28随接种后时间变化的的LT50趋势显着低于BbW。BbV28在生测Ⅱ800～1500个孢子/mm2剂量范围内的LT50值比BbW缩短26.9-34.8%,而在生测Ⅲ500-1500个孢子/mm2剂量范围内的LT50值缩短23.5-35.3%。以上结果表明,工程菌株BbV28既具有与野生菌株相似的体壁侵染毒力,又表现出Vip3Aa1特有的肠道毒力,双侵染途径的杀虫效果显着优于野生菌株有BbW。综上所述,本研究的主要创新成果有叁。一是利用国际标准喷塔接种法成功筛选到对斜纹夜蛾幼虫具有较高毒力的Vip3Aal蛋白受体菌株球孢白僵菌Bb2860。二是首次利用芽生孢子转化体系将Bt营养其杀虫蛋白基因vip3Aal导入Bb2860中,构建和筛选出能够高效表达具有肠道杀虫活性的Vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株。叁是通过不同感染途径证明工程菌株对斜纹夜蛾二龄幼虫具有体壁感染和撮入后肠道感染的双途径侵染能力,其双侵染途径的毒力比野生菌株大幅提高。这是首次将vip3A基因成功转入球孢白僵菌而实现生防真菌毒力大幅提升的研究实例,创造出在发挥白僵菌既有体壁侵染优势的同时而利用Vip3A毒蛋白的新途径,有助于推动微生物杀虫剂的技术进步。
张静涛[8]2009年在《新型cry2基因克隆、表达及活性分析》文中研究指明本研究从两株Bt菌株出发,对新型的cry2类基因进行了研究。SBT2菌株是一株从海南省玉泉山土壤样品中分离出的一株新Bt菌株,经鉴定含有cry2Ad基因,该基因的活性至今未见报道。SC6H8菌株是一株从福建省武夷山土壤样品中分离的Bt菌株,生物活性测定结果表明该菌株对Cry1Ac抗性和敏感的棉铃虫均具有明显的体重抑制作用,说明该菌株所含杀虫基因与cry1Ac可能不具有交互抗性,经鉴定含有cry2类新基因。本研究对这两株菌的新型cry2类基因进行了克隆、表达和活性分析。对野生菌株SBT2进行了晶体形态、质粒图谱和蛋白分子量分析,结果表明SBT2产生分子量约130kDa、大小不一的双锥体形晶体蛋白,所含有的质粒带型与B. thuringiensis subsp.kurstaki HD-1相比,两者所含大质粒相似,而小质粒差异较大。对该菌株进行了PCR-RFLP鉴定,发现该菌株含有cry1Aa、cry1Da、cry1Hb、cry1Jb、cry1Ka、cry1Ib和cry2Ad基因。克隆了其中的cry2Ad基因,在NCBI上应用BLAST软件比较相似性显示,来自SBT2菌株的Cry2Ad与已知的Cry2Ad1的相似性最高(达99%),属于第四等级的新基因。通过实验室构建的高效原核表达载体pEB成功表达了cry2Ad基因,表达产物生物活性测定结果显示,Cry2Ad对棉铃虫(Helicoverpa armigera),玉米螟(Ostrinia furnacalis),小菜蛾(Plutella xylostella)和舞毒蛾(Lymantria dispar)活性较低,对大猿叶甲(Colaphellus bowringi)无活性。对野生菌株SC6H8进行的晶体形态、质粒图谱和蛋白分子量分析显示,SC6H8产生小双锥体形状的晶体蛋白,在130kDa和60kDa都有蛋白条带,所含质粒比HD-1丰富。对该菌株进行了PCR-RFLP鉴定,结果显示该菌株含有cry1Aa、cry1Ba、cry1La、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab和新型cry2基因。克隆了其中的新型cry2基因,在NCBI上应用BLAST软件比较同源性显示,此Cry2Ax与已知的Cry2Ab8的相似性最高(达93%),属于第叁等级的模式基因。通过pET21b表达载体成功表达了cry2Ax基因,表达产物生物活性测定结果显示,Cry2Ax对棉铃虫和玉米螟有较好的体重抑制效果,IC50分别为8.70ug/ml和9.23ug/ml。对经Cry1Ac筛选的抗性棉铃虫IC50为13.96ug/ml。Cry2Ax对小菜蛾和大猿叶甲无活性。Cry2Ax是我国同时获得的两个cry2模式基因,叁维结构分析显示,Cry2Ax与已知的Cry2A蛋白一样具有典型的叁个结构域。与Cry2Ab的碳骨架比较显示,Cry2Ax的碳骨架与Cry2Ab的碳骨架除355位脯氨酸(Pro)存在差异外,其余部分的碳骨架完全一致。利用重迭PCR获得Cry2Ax的两个定点突变体:Cry2Axv354-sp和Cry2Axv354-vp。通过pET21b表达载体成功表达了cry2Axv354-sp和cry2Axv354-vp基因,表达产物生物活性测定结果显示,Cry2Axv354-sp和Cry2Axv354-vp对小菜蛾无活性,对棉铃虫的IC50分别为1.632 ug/ml和5.683ug/ml。
马作江[9]2008年在《Vip3A基因和EF1α启动子的克隆、载体构建及其对烟草的转化研究》文中指出苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在其营养生长期分泌的一种杀虫蛋白,称为营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,Vips),这种新型高毒力蛋白基因对于构建高效广谱的基因工程微生物和培育转基因抗虫植物、控制害虫抗性发展都具有重要意义,被认为是第二代抗虫基因,其中Vip3A蛋白基因研究的最为清楚。本研究利用PCR技术克隆了Vip3A基因,序列分析表明:该基因全长2370 bp,编码789个氨基酸,其序列及预测蛋白质与已知的Vip3A氨基酸的同源性均在99%以上,该基因蛋白分子量为88 KDa,为弱酸性蛋白质。对Vip3A基因核苷酸序列及其编码的氨基酸残基序列进行生物信息学预测发现:Vip3A基因编码的蛋白质前端具有信号肽,并且是跨膜信号,它是一种胞外分泌蛋白,Vip3A蛋白的C端有一个稳定的功能区,二级结构预测显示这个蛋白有较明显的β折叠、α螺旋和无规则卷曲。这些特殊区域可能与其功能密切相关。为了研究Vip3A基因在转基因抗虫植物中的应用,及考虑到外源抗虫基因在转基因植物中表达水平低的原因,本实验又利用PCR技术克隆了烟草的EF1α启动子,该启动子是一种很好的花组织高效表达启动子,经测序及序列分析:该启动子全长1115 bp,含有EF1α基因的起始的63个编码碱基序列,含有TATA-box、CAAT-box等多个保守区,高效转录作用元件5UTR Py-rich stretch;抗氧化作用元件ARE;光反应元件Box I、Sp1;乙烯反应元件ERE;热激作用元件HSE;MYB蛋白结合位点MBS等多个顺式作用元件。将克隆的Vip3A基因和EF1α启动子,以pBI121质粒为基本载体,分别成功构建了EF1α启动子驱动GUS基因的植物表达载体pBIEF,及由组成型CaMV35S启动子和花特异表达的EF1α启动子驱动Vip3A基因的植物表达载体pBIVip3A和pBIEFVip3A。且将这些构建好的植物表达载体通过农杆菌介导的方法对烟草进行了遗传转化,经PCR检测,外源基因已整合到烟草基因组中,经PCR检测,外源基因已整合到烟草基因组中,并对获得的阳性转基因植株通过GUS组织化学染色及RT-PCR进行了表达分析。
陈波[10]2015年在《苏云金芽孢杆菌BtZ01的发酵优化及其对小鼠胚胎和胚后生长发育的影响》文中研究表明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)作为生物农药使用有着长期的历史,其具有高效、安全、生态环保等特点,一直都是人们关注的焦点。做为商业使用的Bt菌株,必须具有高效、高产以及安全这叁大特点。本实验室保存的BtZ01是一株经过筛选、具有高效活性的菌株,为使其尽快商业化,本研究需对其进行发酵条件的优化,并以此优化数据发酵Bt菌做安全性评价,以期为其生产应用提供更准确的研究数据。研究报道结果如下：(1)试验采用二次回归旋转组合设计方法优化了发酵培养基中碳源、氮源和无机盐添加量,同时对部分发酵条件作了初步优化。通过建立各原料与细菌总量间的回归模型,分析各试验因子的单因素效应和互作效应,得到各组分最优添加量为：玉米淀粉3.61%,黄豆饼粉3.46%,鱼粉1.03%,酵母粉1.13%,蛋白胨0.18%,KH2PO4 0.65%, FeSO40.21%, CaCl2O.21%, AL2(SO4)30.33%, MgSO40.23%。细菌的最佳培养条件为：发酵温度37℃,发酵初始pH7.5,接种量5%～10%,发酵时间44 h-50 h。在此条件下,活菌总量可达2.7x1010 CFU·mL-1,芽孢率达80%。(2)为了观察BtZ01菌株对小鼠胚胎发育和胚后生长发育的影响,将48只孕鼠随机分组,试验组饲喂浓度分别为106 CFU·mL-1、108 CFU·mL-1、5 × 109 CFU· mL-1的BtZ01菌液,并设灭菌水为对照组。采用行为致畸学方法检查BtZ01对小鼠胚胎和胚后发育的影响并制作脏器切片,测量脏器指数等指标。结果表明,与对照组相比,各试验组小鼠在胚胎和胚后发育各阶段体重和体长无显着差异(P>0.05),胚胎畸形发生率无增加,骨骼染色观察发现高剂量组小鼠后囟门显着大于其它3组(P<0.05)。18 d与48d小鼠部分脏器指数虽存在显着差异,但却仅有高剂量组肾脏被发现有病变。小鼠肠道形态在18d时无显着差异(P>0.05),但在48 d时,高、中剂量组小鼠的肠绒毛高度和绒毛长度／隐窝深度值显着高于对照组(P<0.05)。小鼠肠道菌群检测并未出现失调现象。试验结果表明,苏云金芽孢杆菌BtZ01在浓度为108 CFU·mL-1及以下时对小鼠胚胎发育及胚后生长发育无不良影响。
参考文献：
[1]. 高毒力Bt菌株筛选及其对甜菜夜蛾生长发育的影响[D]. 杨小林. 华中农业大学. 2003
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[5]. 粘质沙雷氏菌PS-1菌株对甜菜夜蛾幼虫杀虫机理的初步研究[D]. 赵晓峰. 华南农业大学. 2016
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[7]. 表达苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株的构建及其对斜纹夜蛾幼虫的肠道与体壁侵染力[D]. 秦毅. 浙江大学. 2010
[8]. 新型cry2基因克隆、表达及活性分析[D]. 张静涛. 中国农业科学院. 2009
[9]. Vip3A基因和EF1α启动子的克隆、载体构建及其对烟草的转化研究[D]. 马作江. 重庆大学. 2008
[10]. 苏云金芽孢杆菌BtZ01的发酵优化及其对小鼠胚胎和胚后生长发育的影响[D]. 陈波. 四川农业大学. 2015