手足口病是因肠道病毒感染引起的一种传染性疾病，多发于婴幼儿中，会引起小儿的足、手、口腔等部位发生疱疹，部分患儿甚至会引起肺水肿、心肌炎或无菌性脑膜炎等严重的并发症[1-2]，其中会引起手足口病的常见病包括科萨奇病毒A组16、4、5、9、10型，肠道病毒71型（EV71）及B组的2、5型，其中最为常见的病原体类型为肠道病毒EV71型及柯萨奇病毒A组的16型[3]，因此对其进行早期、准确诊断非常重要，以往多采用逆转录-聚合酶连反应（RT-PCR）周期较长，不利于快速诊断，而实时荧光定量PCR是一种新兴的用于病原体核酸快速检测的技术[4]。本文分析了RT-PCR和荧光探针PCR对手足口病肠道病毒的诊断价值，以为手足口病肠道病毒检测选择合适的诊断方法，现进行如下报告。1 资料与方法1.1一般资料选择我市2018年1月至2018年12月的225例手足口病患儿，所有患儿的发病时间均小于7d，排除免疫性疾病、感染性疾病及其他伴发疾病等。其中男115例，女110例，年龄范围为8个月~4岁，平均年龄为3.1±0.9岁。1.2方法RNA提取试剂盒购自Roch公司，核酸分子质量标准DL2000 DNA marker购自TaKaRa公司，逆转录PCR扩增采用Titan One Tube RT-PCR Kit；荧光实时定量PCR试剂盒购自江苏硕世生物科技股份有限责任公司，实时荧光定量PCR扩增仪器为AB 公司的StepOne，琼脂糖凝胶电泳系统购自北京六一公司。荧光探针PCR法：取原始样本200μl，用固相提取法中的柱式提取法对RNA进行提取，并采用PCR核酸扩增检测仪进行扩增，按说明书进行温度条件、循环扩增参数设置，并设置阴性及阳性对照组。RT-PCR：引物序列符合《手足口病诊断》标准（WS 588-2018），反应条件为50°C下进行逆转录半小时，之后94°C下2min，94°C下30s，45°C下30s，68°C下45s，进行40个循环后在68°C下7min，之后转入4°C。1.3观察指标对比RT-PCR和荧光探针PCR两种方法的病毒阳性检出率，包括通用型肠道病毒、EV71、CoxA16。1.4统计学方法采用SPSS23.0软件进行数据的处理与分析，计量资料用均数±标准差表示，计数资料用n或百分比表示，对比分析采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果表1结果表明，荧光探针PCR对通用型肠道病毒、EV71、CoxA16等手足口病肠道病毒的检出率明显高于RT-PCR法，差异对比显著，具有统计学意义（P<0.05）。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆表1对比两种方法的病毒阳性检出率[n（%）] 检测方法 样本 通用型肠道病毒 EV71 CoxA16 总计 荧光探针PCR 咽拭子（n=225） 102（45.3）* 10（4.4）* 79（35.1）* 191（84.9）* RT-PCR 咽拭子（n=225） 88（39.1） 5（2.2） 61（27.1） 154（68.4） 注：与RT-PCR对比，*P<0.05。3讨论目前，手足口病检测的金标准方法是用分离、鉴定病毒的方法，常用分离方法包括乳鼠接种及细胞接种，但因细胞对病毒的敏感性导致细胞出现明显病变的周期较长，且因病毒抗原漂移容易受到阻碍，且接种乳鼠的鉴别过程繁琐耗时，因此其不适用于短时间内处理大量样本，也不满足临床早诊断及早干预的需要，且会出现难以采集合格标本的情况，从而无法对病毒进行检测，肠道病毒特异性鉴定可采用血清中和实验，多见于手足口病无症状的肠道病毒感染，但其检测方法特异性较低[5]，因此需采用合适的检测方法，本文分析了荧光探针PCR对手足口病肠道病毒的检测效果。本文结果表明，荧光探针PCR对通用型肠道病毒、EV71、CoxA16等手足口病肠道病毒的检出率明显高于RT-PCR法，差异对比显著，具有统计学意义（P<0.05），主要是由于荧光探针PCR具有快速、定量检测、灵敏度、特异度高且自动化程度高等优点[6]，因此其可用于手足口病肠道病毒的检测。综上所述，与RT-PCR相比，荧光探针PCR对手足口病肠道病毒的阳性检出率较高，值得临床推广应用。参考文献[1]Wang M, Ren Q, Zhang Z, et al. Rapid detection of hand, foot and mouth disease enterovirus genotypes by multiplex PCR[J]. Journal of Virological Methods, 2018, 258:7-12.[2]赖辉兵,喻黎明,冯梓来,等.2009-2015年广东省云浮市手足口病流行病学特征和重症病例的病原学分析[J].现代预防医学,2017,43(3):23-27.[3]李娟娟,王玉肖,周美静,等.2013-2016年河北省保定市CoxA6型手足口病流行病学特征分析[J].医学动物防制,2018,34(12):34-36.[4]沈伟锋,邵平扬,殷新光,等.多重荧光定量RT-PCR快速甄别手足口病病原体的方法研究[J].中华临床感染病杂志,2017,10(2):141-145.[5]吕莉琨,杨东靖,李力,等.手足口病柯萨奇病毒A2、A4和A5型SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国病原生物学杂志,2017,30(1):15-19.[6]程洁萍,谭翰清.柯萨奇A组6型病毒TaqMan探针实时荧光RT-PCR的建立[J].热带医学杂志,2017,17(7):908-911.
论文作者:何锋,刘颖迪,程艳君
论文发表刊物:《中国保健营养》2019年第7期
论文发表时间:2020/1/16
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