张志光, 刘春栋[1]2005年在《透明质酸改性聚乳酸支架构建组织工程兔髁状突软骨的实验研究》文中研究说明目的利用透明质酸改性聚乳酸来构建同种异体动物组织工程软骨,分析探讨透明质酸在构建组织工程化软骨中的应用意义,同时探讨透明质酸改性聚乳酸构建组织工程软骨的可行性。材料和方法采用盐析法制备出高孔隙率PLA 支架,采用低浓度NaOH 进行表面轻度水解后,利用EDC 和HA 进行支架的改性。支架预湿后,接种培养至第3代的兔髁状突软骨细胞悬液(5×10~7/ml)。体外培养1周后用于动物实验。选择成年新西兰大白兔6只,体外培养1周后的软骨细胞-支架复合体植入动物背部。分别于4、6、8周按照标记取出植入组织,进行组织学检测,包括HE、Masson、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化。结果体外支架-细胞复合体植入后,兔未产生排斥反应。第4周HE染色示有中等数量的软骨细胞,排列无序,聚乳酸支架被大量降解。第6周HE 染色示大量软骨细胞生长,细胞排列无序,聚乳酸支架大部分被降解吸收。第8周HE 染色示软骨细胞排列有序,形成明显软骨陷窝,染色较前变深。Ⅱ型胶原免疫组化检测应用Imagej 分析软件进行分析,随时间增加染色阳性强度增加。相同时相点,实验组阳性表现强于对照组。Masson 三色染色及甲苯胺蓝染色显示植入4周时,色泽较浅。植入6用和8周时,染色逐渐加深。结论利用HA 改性PLA 为支架可以构建的同种异体软骨,其质量强于未改性PLA。
李宝军[2]2007年在《脂肪间充质干细胞体外诱导及复合PLGA体内异位成软骨的实验研究》文中指出第一章脂肪间充质干细胞的分离、培养和鉴定目的探讨脂肪间充质干细胞的分离、培养方法，观察其生长增殖情况，鉴定其生物性特征。方法以S-D大鼠为研究对象，机械分离，胶原酶消化腹股沟和附睾脂肪组织，获取细胞培养于含新生牛血清体积分数为0.1的低糖DMEM培养基中，利用干细胞的附壁生长特性，通过更换培养基而不断纯化获取脂肪间充质干细胞，镜下观察细胞形态变化。MTT法测定传3、5和10代细胞增殖情况。流式细胞仪检测传5代细胞表面CD29、CD34和CD44表达情况。结果原代培养后24小时看见微少贴壁细胞，初起为小圆形，48小时后可见梭形、短梭形和多角形贴壁细胞，3天后成纤维样细胞明显增多，5天左右进入对数增长期，8天左右细胞单层融合接近90％。传代细胞于2小时即可完成贴壁，生长较快，多数为成纤维样细胞，6天左右细胞单层融合。传3代后细胞形态均一。10代以后细胞则逐渐有宽大梭形样变。生长曲线显示传3、5代脂肪间充质干细胞均有较强的增殖能力，其中传5代细胞更为明显，而传10代细胞的增殖能力逐渐减弱。流式细胞仪检测传5代细胞有95％表达CD44，96％表达CD29，而只有5％表达CD34。结论大鼠脂肪间充质干细胞分离提取操作简便易行，且有较强的生长增殖能力，能够长期培养，符合组织工程种子细胞的基本条件。第二章脂肪间充质干细胞体外诱导成软骨能力的实验研究目的探讨脂肪间充质干细胞在特定培养基条件下体外定向软骨细胞分化的能力。方法(1)如前述方法，分离培养大鼠脂肪间充质干细胞。(2)取传5代细胞采用初始细胞密度为1.0×10~(10)／L的“微团”培养方法在特定培养基条件下进行成软骨诱导，诱导培养基为高糖DMEM，含体积分数为0.01的新生牛血清、10ug／L的转化生长因子β1、6.25mg／L的转铁蛋白、1×10~(-7)mol／L的地塞米松和50mg／L的维生素C。(3)观察脂肪间充质干细胞在诱导后的生长增殖情况、形态变化，于诱导7、14天后应用阿尔新兰染色、甲苯胺兰染色、藩红0／固绿染色，以及4、7、14天后应用Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学、aggrecan免疫荧光评价其成软骨能力。(4)逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测脂肪间充质干细胞诱导0周、2周和4周后前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA表达情况。(5)蛋白印迹试验(Western-blot)检测脂肪间充质干细胞诱导0周、2周和4周后前Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan的蛋白表达。结果(1)在特定培养基诱导条件下，脂肪间充质干细胞细胞生长增殖明显减缓，细胞形态由梭型渐变为三角形、多角形、圆形，有自发聚集倾向，高密度的“微团”培养细胞在诱导后48小时可以聚集形成结节，并逐渐增大，12天左右结节呈半透明类软骨样外观。(2)脂肪间充质干细胞在高密度的“微团”培养条件下，于诱导7、14天后阿尔新兰染色、甲苯胺兰染色、藩红0／固绿染色阳性，诱导4、7、14天后Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学、aggrecan免疫荧光阳性表达。(3)RT-PCR检测高密度“微团”培养的脂肪间充质干细胞诱导0周前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA呈阴性表达，而在诱导后2周和4周呈阳性稳定表达。(4) Western-blot检测在脂肪间充质干细胞诱导后0周前Ⅱ型胶原、aggrecan的蛋白为微弱表达，而在诱导2周和4周后呈阳性稳定表达。结论在体外特定的诱导环境下，高密度微团培养的脂肪间充质干细胞可以向软骨细胞方向分化，并能够稳定表达软骨细胞特异表型。第三章脂肪间充质干细胞复合PLGA体外培养诱导成软骨的实验研究目的探讨脂肪间充质干细胞在PLGA支架上培养并定向软骨方向诱导分化的能力，以及PLGA支架作为脂肪间充质干细胞载体的可行性。方法(1)将PLGA柱状支架，分别经过乙醇消毒、紫外线照射灭菌处理，晾干备用。(2)如前述方法，分离培养大鼠脂肪间充质干细胞，取传5代细胞，以4.0×10~(10)／L的初始细胞密度接种在PLGA支架材料上，分诱导组和未诱导组，诱导组在特定培养基，即含体积分数为0.01的新生牛血清、10ug／L的转化生长因子β1、6.25mg／L的转铁蛋白、1×10~(-7)mol／L的地塞米松和50mg／L的维生素C的高糖DMEM条件下进行成软骨诱导。(3)于3周后取材行扫描电镜观察细胞在材料表面的生长增殖情况，取材石蜡包埋切片行H-E染色、藩红0／固绿染色和Masson三色染色以及Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、aggrecan免疫荧光评价脂肪间充质干细胞在PLGA材料内部的生长情况和成软骨能力。(4)应用RT-PCR检测脂肪间充质干细胞／PLGA支架复合培养3周后未诱导组和诱导组前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA的表达情况。结果(1)脂肪间充质干细胞接种在PLGA材料复合培养时，初起细胞／材料复合体悬浮于培养基中，2天后渐沉入培养基底部，诱导组复合体表面逐渐光滑润泽，质地逐步增韧，倒置显微镜下可见有少量细胞溢出支架材料并附壁生长。(2)诱导组3周后扫描电镜观察，见细胞在支架表面分布密集，并可见支架空隙细胞延伸，基质分泌旺盛，甚至连接成片；未诱导组基质分泌较少。(3)石蜡切片H-E染色可见细胞在支架内部生长，但数量明显少于支架外部；石蜡切片见诱导组藩红0／固绿染色和Masson三色染色以及Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、aggrecan免疫荧光呈阳性表达，可见少量成熟软骨陷窝形成，未诱导组呈阴性。(4)在脂肪间充质干细胞／PLGA支架复合培养3周后，RT-PCR检测诱导组前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA均呈阳定表达，未诱导组呈阴性。结论脂肪间充质干细胞可以和PLGA支架复合培养，在特定的诱导培养基条件下可以表达软骨特异表型，形成类软骨样组织。第四章脂肪间充质干细胞复合PLGA体内异位成软骨的实验研究目的探讨脂肪间充质干细胞／PLGA材料复合体体外诱导后植入裸鼠体内异位构建组织工程化软骨的能力。方法(1)如第三章所述方法，脂肪间充质干细胞复合PLGA体外培养或诱导3周。(2)分别将诱导组和未诱导组细胞／支架复合体植入裸鼠背部皮下两侧，观察裸鼠的生活力变化以及皮下种植的细胞／支架复合体质地和形态变化。(3)分别于8周和12周取材石蜡包埋切片行H-E染色、阿尔新兰染色、藩红0／固绿染色和Masson三色染色以及Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、aggrecan免疫荧光评价脂肪间充质干细胞复合PLGA异位成软骨能力。(4) RT-PCR检测体内细胞材料复合体在8周和12周时前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA的表达情况。结果(1)将经过体培养的细胞／PLGA材料复合体植入裸鼠皮下后，裸鼠成长良好，没有全身和局部的炎症和毒性反应，诱导组细胞／支架复合体的大小形态基本保持原状，质地逐步增韧；未诱导组细胞／支架复合在8周取材时已无明确形体残留。(2)在8和12周后诱导组取材，石蜡包埋切片，行阿尔新兰染色、藩红0／固绿染色和Masson三色染色，以及Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、aggrecan免疫荧光均可见成熟软骨陷窝生成，胞外基质蛋白聚糖、粘蛋白、胶原纤维异染阳性表达，软骨特异表型Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan强表达。(3)在诱导组细胞材料复合体体内植入8周和12周时，应用RT-PCR检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA均呈阳性稳定表达。结论脂肪间充质干细胞复合PLGA材料经体外诱导后具有在裸鼠体内异位构建组织工程化软骨的能力。
缪志和[3]2000年在《聚乳酸构建组织工程化软骨的实验研究》文中提出聚乳酸构建组织工程化软骨的实验研究 目的：以聚乳酸生物材料为支架，改进方法培养的软骨细 胞为“种子”细胞，构建组织工程化软骨，观察所构建软骨的 组成成分及排列结构。方法：1、吹打经消化酶消化1次后的软 骨碎块，分离培养软骨细胞，观察其生物学性状。2、采用聚乳 酸为生物材料，NaC 结晶为发泡剂制成多维孔聚乳酸支架，观 察其大体及超维结构。3、将软骨细胞种植于聚乳酸支架上，体 外培养4天后植入裸鼠腋下皮内，构建组织工程化软骨，观察 所构建的“软骨”的组织成分及排列结构。结果：1、改进方法 培养的软骨细胞的形态及表形特征未发生改变。2、扫描电镜观 察多微孔聚乳酸支架，可见其内密布直径在100—300μm之间 的微孔，微孔孔壁光滑，彼此间相互连接，呈三维立体状。3、 工程化软骨经组织切片及HE、VG和AB-PAS染色，可见软骨细 胞及由其分泌的Ⅱ型胶原和蛋白多糖。结论：1、改进的软骨 细胞分离培养方法确实可靠，简单易行。2、多微孔聚乳酸支架 适合软骨细胞生长。3、构建的组织工程化软骨的组成成分与关 节透明软骨的组成成分相同，但其细胞及胶原纤维的排列结构 与透明软骨有差异，其原因有待于进一步研究。
李景红[4]2004年在《同种异体软骨细胞/聚乳酸复合物即时修复软骨缺损的实验研究》文中研究指明目的：观察同种异体软骨细胞和消旋聚乳酸支架材料复合物即时修复软骨缺损的修复效果，研究同种异体软骨细胞即时修复软骨缺损的方法和可行性，为同种异体软骨细胞和聚乳酸支架在临床急诊耳、鼻、喉和气管软骨组织缺损的即时修复提供实验依据和理论依据。 方法： 一．TGF-β_1、同种异体软骨细胞／聚乳酸复合物修复软骨缺损：18只大白兔随机分为同种异体软骨细胞／聚乳酸复合物加TGF-β_1组、同种异体软骨细胞／聚乳酸复合物组和不用任何修复材料的空白对照组，每组6只。分别于4、12、18周取材，行HE和甲苯胺蓝染色，观察各组兔耳廓软骨缺损修复情况。 二．同种异体软骨细胞即时体内构建组织工程软骨：获取1月龄兔耳廓软骨，分离消化后将软骨细胞种于聚乳酸上形成复合物，6小时后植于兔皮下，分别于6、12、18周取材行大体和组织学观察以及HE染色、甲苯胺蓝染色和Masson三色染色。 三．同种异体软骨细胞／聚乳酸复合物即时修复软骨缺损：取3月龄狗甲状软骨细胞，体外分离消化2小时后用于修复狗甲状软骨缺损，对照组单纯用聚乳酸修复。分别于4周、12周取材，行HE、甲苯胺蓝染色和Masson三色染色，观察各组甲状软骨缺损修复情况。结果:一、TGF一pl同种异体软骨细胞/聚乳酸复合物修复软骨缺损:移植后18周，TGF一p，复合物组修复软骨缺损的效果无论从大体标本观察或是病理组织学检查都比复合物对照组的修复效果好，空白对照组为纤维组织修复。二、软骨细胞即时体内构建组织工程软骨:体内培养6周后，软骨细胞/聚乳酸复合物中有基质分泌，软骨细胞不成熟，12周时，软骨细胞接近成熟并形成凹陷，18周时，新生软骨基本接近正常软骨。三、同种异体软骨细胞/聚乳酸复合物即时修复软骨缺损:实验组移植后4周，缺损区内见软骨样组织;移植后12周，新生的软骨组织充填于软骨缺损区;对照组软骨缺损区在实验各阶段未见明显软骨修复，移植后12周软骨缺损由纤维以及纤维软骨充填。结论:一、同种异体软骨细胞/聚乳酸复合物移植可较好地修复兔耳廓软骨缺损，TGF一p，可提高同种异体软骨细胞/聚乳酸复合物移植修复兔耳廓软骨缺损的质量。二、利用同种异体软骨细胞即时构建组织工程化软骨的方法可以在动物体内形成新的软骨。三、同种异体软骨细胞/聚乳酸复合物可即时修复狗甲状软骨缺损，为临床急诊头面部软骨缺损的即时修复提供了理论依据。 一4-意义:本实验为同种异体软骨细胞和聚乳酸支架应用于临床急诊头面部软骨缺损的即时修复提供理论和实验依据，同时将是一种具有永久性、安全性和符合生理的快捷修复头面部软骨缺损的新方法，为头面部软骨损伤尤其是喉、气管缺损的修复开辟出一条新的路径。
吴玉家[5]2007年在《构建带内支撑的组织工程化软骨的实验研究》文中提出本研究旨在探讨构建一种具有预制体积与形状的带有内支撑的组织工程化软骨的方法及其可行性。利用不同的培养模式(体外、裸鼠体内、兔体内)依次构建带内支撑组织工程化软骨并观察其特点。并先后于裸鼠皮下、兔再造阴茎模型内及兔阴囊原位构建组织工程化的阴茎及睾丸假体并观察其特点。结果证实:1)利用软骨细胞与PGA支架构建的组织工程化软骨存在“空心”现象。2)利用软骨细胞与HDPE-PGA支架可以于裸鼠体内构建出具有预制体积与形状、组织学良好的HDPE-软骨复合体。3)软骨细胞与HDPE-PGA支架复合物自体移植后,可构建出具有预制体积与形状、结构良好的HDPE-纤维软骨复合体;延长体外时间至4周有利于改善新生软骨的质量。4)即时再造阴茎内与皮下具有相同的构建组织工程化软骨的内环境。5)利用此方法,亦可以成功构建出组织工程化阴茎及睾丸假体。
李志忠[6]2006年在《梯度材料骨髓间充质干细胞构建组织工程骨—软骨的研究》文中研究表明目的：本实验旨在应用组织工程原理和技术，利用PLA、壳聚糖、胶原研制三维多孔、双性能的骨．软骨复合梯度支架材料；探讨材料的生物相容性、体内降解性能，以及材料对细胞生长可能产生的作用；并进行体外组织工程骨-软骨构建和生物体内原位骨-软骨诱导再生研究。 方法：借助超临界二氧化碳循环法研制壳聚糖生物／聚乳酸／胶原三元多孔复合梯度支架材料，构建不同强度、不同孔径和孔隙率的梯度材料：对支架材料进行动物体内生物相容性和降解试验；采用全骨髓分离培养法，体外进行兔骨髓基质干细胞(BMSC)诱导转化为软骨细胞，并与梯度材料共同培养，构建带骨支架的软骨复合体；将复合体植入新西兰兔体内，原位诱导骨．软骨再生，修复关节软骨缺损。对实验结果进行组织学、免疫组化、超微结构等检测。 结果：1、SC-CO_2反复循环法制备的PLA／壳聚糖／胶原的梯度支架材料的具有明显的梯度结构，支架材料的开孔率可以比传统的一次性升压法明显提高，其孔隙结构与孔隙率适宜软骨细胞的种植；梯度材料的生物力学强度、孔隙率、孔径达到了软骨细胞体外生长和体内原位再生的要求；2、全骨髓分离培养法在体外完成了兔MSCs的分离、扩增、传代，MSCs体外诱导向软骨细胞诱导分离3周后，培养出软骨组织块，经HE、Alcian blue染色，可见软骨细胞扩增、传代，并有细胞外基质分泌；免疫组化检测提供了依据，RT-PCR显示有Ⅱ型和Ⅹ型胶原表达，提示细胞所分泌的基质为Ⅱ型胶原，分泌物形成了透明软骨。透射电镜见软骨细胞在材料内呈贴壁生长，基质大量分泌，兔骨髓基质干细胞体在软骨诱导剂和离心培养条件下可成功生成软骨组织，初步构建成功带骨支架的软骨细胞复合体；3、PLA／壳聚糖／胶原支架材料体内组织学观察发现，降解的材料周围可见少量炎症细胞，表明PLA／壳聚糖／胶原在体内的降解产物可能引起轻度的炎症反应，但对组织工程骨软骨的生长发育无明显抑制。组织炎症12周后，基本消失；提示材料组织相容性能良好；4、超微结构显示，细胞在支架材料孔隙内壁良好的附着、生长、扩增并形成软骨样组织，细胞分布均匀，提示体外三维培养的细胞-支架复合物能形成了软骨样组织；5、细胞-支架复合物植入同种异体新西兰兔股骨髁12周后，骨和软骨两部分整合为一个整体，形成了结合良好的
郝彤[7]2007年在《温敏性壳聚糖水凝胶的研制及其用于羊关节软骨缺损修复的实验研究》文中进行了进一步梳理关节软骨具有重要的生理功能，但损伤后其自身的修复能力有限。目前临床上常用的各种治疗方法效果不甚理想，迫切需要寻找新的技术和手段，组织工程这一新兴交叉学科的研究为关节软骨缺损修复带来了希望。近年来，组织工程用水凝胶生物材料的研制发展迅速。许多研究表明，壳聚糖水凝胶是一类生物相容性好、可体内降解的生物材料，作为软骨组织工程细胞支架具有广泛的应用前景。尽管以其作为可注射性软骨缺损修复材料有较多研究报道，但利用壳聚糖水凝胶支架复合软骨细胞后以块状固体方式移植修复大动物关节缺损的研究尚未见报道。因此，本论文首先制备了温敏性壳聚糖水凝胶并对其进行了细胞毒性和组织相容性等生物学评价；其次，以研制的壳聚糖水凝胶为细胞支架，体外构建了块状组织工程化人工软骨，并对其进行了组织学、组织化学等相关检测，证实关节软骨细胞在壳聚糖水凝胶中可以正常生存并分泌Ⅱ型胶原等细胞外基质；最后，将体外再造的块状组织工程化软骨进行体内移植修复羊关节软骨缺损，实验分为三组，即组织工程化人工软骨移植组、单纯材料移植组和空白对照组。术后12周和24周进行取材，结果表明，组织工程化人工软骨移植组在术后12周缺损部位即已得到明显修复，术后24周，羊关节软骨缺损部位已修复完全，相关组织学、组织化学、免疫组织化学检测证实，再生的软骨为透明关节软骨；单纯材料移植组，术后12周，关节软骨缺损仅有少量修复，术后24周，关节软骨缺损部位得到明显修复，但修复效果不如组织工程化人工软骨移植组；空白对照组，手术后24周，仅在关节软骨缺损区周边部有少量新生软骨长入。上述研究结果表明，基于壳聚糖水凝胶的块状组织工程化人工软骨具有较强的软骨缺损修复能力，进一步深入研究，将为新型组织工程化软骨产品的开发与临床应用奠定基础。本论文的主要研究内容包括以下三个部分：一、温敏性壳聚糖水凝胶的制备及生物学评价二、组织工程化人工软骨的体外构建与功能检测三、组织工程化人工软骨体内移植修复羊关节软骨缺损的研究
丁小邦[8]2007年在《应用组织工程技术和人自体细胞探索可注射性真皮充填物的实验研究》文中研究说明一、研究背景及目的面部年轻化一直是美容外科探索的课题,除了拉皮手术外,很多真皮充填物已被开发,用于消除皱纹和皮肤凹陷。自1981年牛胶原蛋白作为第一个用于去皱的充填品获FDA批准,越来越多的更安全更有效的注射物被推出。目前国内外常用的注射充填物根据来源可分为有以下几类。自体的:自体脂肪,自体细胞,自体胶原等;同种异体的:人尸体组织的胶原,人成纤维细胞培养生成的胶原;异种来源:来自于牛、猪的胶原,来自于公鸡冠或细菌发酵的透明质酸及其衍生物类产品;人工合成:硅树脂(silicone)类产品,聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethylmethacrylate,PMMA),羟基磷灰石,聚乳酸类,聚丙烯酰胺类。非永久性注射充填物主要包括透明质酸及其衍生物类、胶原、聚乳酸类及自体细胞等;永久性注射充填物主要包括硅树脂类产品、PMMA、羟基磷灰石及自体脂肪。但是它们各有优缺点,自体脂肪存活有限,吸收率高,且只能适合富有脂肪的人;牛胶原易过敏,有效时间短;Artecoll可产生肉芽肿,且只能皮下深部注射;透明质酸钠则有效时间短:单纯成纤维细胞注射,需多次注射,价格昂贵且效果不尽人意。理想的注射充填材料应当安全,方便,无痛,不留下任何使用过的痕迹,能长期地存留,但又无任何并发症,如果要取出,它又可以容易而安全的取出;理想的注射充填材料应该生物相容性好,无免疫排斥反应,无毒性,无致传染病,致热和致癌性迁移等;最好价格不昂贵,易保存,易消毒。近年来,组织工程发展很快,在皮肤、角膜、肝、胰、软骨、骨、血管、尿道、神经系统等领域均取得了巨大的成绩。但应用组织工程技术研究可注射性真皮充填物是一个新的发展方向。其中细胞支架材料可以选择可降解生物材料氧化异丙烯Plurolic—F127和可降解的注射充填材料(透明质酸钠、胶原等),种子细胞可以选择人体容易获得的细胞,如来自皮肤和脂肪的细胞。利用组织工程技术,从少量人体的富余组织中分离出自体细胞,体外培养大量扩增,获得种子细胞,将种子细胞和可吸收的细胞支架混合,形成细胞一支架复合物,将此自体复合物回注入皱纹下的真皮层内,细胞支架逐渐降解而被吸收,自体细胞成活形成新的结缔组织,分泌大量新的细胞基质成份,从而,修复原有的真皮断裂,重建、修复皮肤结构,达到消除皱纹的目的。Pluronic-F127被广泛用于药物的缓释载体,没有细胞毒性,不会引起机体的免疫反应,常温下固化,可以塑形,4℃下为液态,而在液态状态下便于用注射器将细胞与载体的复合物注入体内,使用方便,是常用的组织工程支架材料。目前可降解的注射充填材料主要有:牛、猪的胶原,非动物源性的透明质酸及其衍生物类产品,羟基磷灰石微球,聚丙烯N,N一二甲基二烯丙基铵盐共聚物。其中非动物源性的透明质酸,因其无致敏性、容易获得且本身就是细胞基质成份,从而作为本研究的细胞支架材料。皮肤是人体最大的器官,细胞资源丰富,是一个庞大的细胞库。而且,皮肤位于体表,易于取材:通常,外科手术均需切开皮肤,因而在进行组织器官缺损修复手术的同时,可以切取少量皮肤组织,甚至可以利用手术切除的多余皮肤组织来获得大量的皮肤来源细胞。从皮肤获得种子细胞不仅安全、方便,而且还可充分利用手术废弃组织,不浪费宝贵的人体细胞资源。皮肤成纤维细胞作为种子细胞已经得到了深入的研究,Eaglstein WH用小儿包皮的成纤维细胞构建组织工程化真皮,并广泛应用于临床,促进创面愈合;陈兵等应用皮肤成纤维细胞构建组织工程化肌腱。自体培养的成纤维细胞(Isolagen)也在美国、欧洲等地治疗凹陷皱纹及痤疮后瘢痕,这是单纯细胞技术在注射除皱方面的应用,已有1450人接受过治疗。人成纤维细胞可以由皮肤中分离出来,再通过体外培养扩增,收集后可以回注到自体凹陷皱纹处,用来消除皱纹,对细浅纹有效,未发现并发症,但对稍深的皱纹则无效,可能与单纯成纤维细胞注射,细胞成活少,且细胞不易固定等有关。自2001年Zuk首次证实经吸脂术获得的脂肪组织中存在具有多向分化潜能的细胞群后,脂肪干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)的概念得以明确,其后ADSCs逐渐被人们所认知并迅速进入组织工程种子细胞研究领域。与BMSCs相比,ADSCs在人体内分布范围更广,可利用的细胞总量更多,而且所需的脂肪组织可经整形外科吸脂术(美容手术)获得,该手术操作简单,创伤小,还能对病人进行体型重塑,因此,病人易于接受,无心理障碍。正是基于以上考虑,我们认为在种子细胞来源的选择上,ADSCs较BMSCs更具优势,脂肪组织作为种子细胞来源,具有更加广阔的应用前景。人们对ADSCs的认识到目前只有几年的时间。1994年,Kaplan等发现病人皮下脂肪组织中有异位成骨现象,提出脂肪前体细胞能向成骨细胞分化的推断,但其未证实脂肪组织中间充质干细胞的存在。直至2001年,Zuk等从脂肪抽吸物中成功分离培养出具有骨、软骨、脂肪、肌肉等多向分化潜能的细胞,ADSCs才真正被人们所认识。此后的许多研究也均证实了ADSCs的多向分化潜能,包括向软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞甚至神经细胞的分化。对此种细胞获得率的研究发现,平均350ml脂肪抽吸物可分离出1×10~8。单个核细胞,数量非常可观,自体抽吸量可获得充足细胞,用于组织工程的研究。故本实验应用组织工程技术,选择可降解生物材料氧化异丙烯Plurolic—F127和透明质酸钠为支架材料,以人成纤维细胞和ADSCs为种子细胞,形成细胞--支架复合物,注射到裸鼠皮下构建软组织,为临床探讨一种更安全有效的除皱方法提供参数。二、材料与方法1、人皮肤成纤维细胞和ADSCs分离实验一皮肤来自于临床5名男性植皮患者,平均年龄22岁。实验二皮肤和脂肪来源于3名男性患者,2例为男孩,分别10岁和13岁,腹部取全厚皮及皮下脂肪,1例为24岁男性皮瓣修薄术的残留皮肤和脂肪。以无菌手术分离皮肤和皮下脂肪组织。胶原酶消化皮肤和脂肪,分离收集原代皮肤成纤维细胞和ADSCs置DMEM培养液传代,收集第2代细胞作为种子细胞。ADSCs按4×10~5有核细胞/cm~2细胞密度接种于培养皿内,常用的100mm塑料培养皿接种细胞3×10~7左右,加入低糖DMEM+10%FBS培养液培养,传代收集第2代细胞作为种子细胞和检测。2、细胞一生物支架复合物制备、植入和取材:30%plurolic—F127和透明质酸钠为支架材料,和种子细胞混合制成细胞-生物支架复合物,实验一分两组:组①plurolic—F127和成纤维细胞混合;组②单纯成纤维细胞组。按每一样本0.2ml注射到裸鼠(5只,雌性)背部皮下,形成4个点,每组各2个点,8周后取材,用于检测与分析。实验二分四组:组①成纤维细胞按25×10~6个/ml浓度与稀释后透明质酸钠混合:组②ADSCs按25×10~6个/ml浓度与稀释后透明质酸钠混合;组③成纤维细胞和ADSCs分别按12.5×10~6个/ml浓度与稀释后透明质酸钠共混合;组④单纯透明质酸钠设为对照组;按每一样本0.2ml注射到裸鼠(6只,雌性)背部皮下,形成4个点,每组各1个点,8周后取材,用于检测与分析。3、将取材获得的标本,分别从大体、体积、组织学等方面,对形成组织进行评价重量和体积;免疫组织化学检测形成的组织是否含有I型胶原:RT-PCR方法检测构建的组织的人Y染色体三、结果1、大体观察和分析:8周后取材,实验一两组均未发现有任何结节形成或残留,实验二6只裸鼠1只死亡,存活的5只裸鼠皮下注射的实验组样本,均形成了非常好结节状软组织,柔软有弹性,对照未有任何结节形成或残留。2、体积测定:实验二组①的平均体积(0.020±0.007)ml,占注射时样本体积的10%;组②的平均体积(0.037±0.094),占注射时样本体积的18.5%;组③的平均体积(0.035±0.012)ml,占注射时样本体积的17.6%。采用单因素方差分析示三组数据有统计学意义(F=5.145,P=0.024);组间采用LSD分析示实验组①的体积和组②、组③之间均有显著差异(P＜0.05);而组②和组③的体积之间无统计学差异(P＞0.05)。3、组织学检测:实验二结果HE染色示实验组①、②和③体内形成的组织周边有纤维组织包裹,纤维组织中有少量炎性细胞侵润,中间组织排列紊乱,生物材料完全降解,无新生血管长入;Masson三色染色能将胶原纤维染成绿色,弹性纤维染成棕色,肌纤维染成红色,胞核呈兰黑色,显示实验组①、②形成的组织周边有少量的胶原纤维,中间无胶原纤维;而实验组③形成的组织周边有少量的弹性纤维或肌纤维,中间有大量排列紊乱的胶原纤维:Oil Red染色示脂肪组织为红色,显示实验组①、②和③形成的组织周边有少量的脂肪,中间无脂肪组织。4、I型胶原免疫组织化学检测结果示实验组①、②和③体内形成的组织工程化组织内均未含有明显的I型胶原存在。5、RT-PCR方法检测构建的组织的人Y染色体:结果显示实验二实验组①、②和③体内形成的组织工程化组织和阳性对照组均得到294bp和494bp二条带,表明实验组所形成的组织为植入的细胞-生物支架复合物所形成。四结论应用组织工程技术,可降解生物材料氧化异丙烯30%Plurolic—F127为支架材料,人成纤维细胞为种子细胞,以25×10~6细胞/ml混合,裸鼠皮下不能构建出有形的组织。但应用透明质酸钠为支架材料,能构建出组织工程化软组织。应用组织工程技术,透明质酸钠为支架材料,以人脂肪干细胞(ADSCs)或成纤维细胞为种子细胞,能构建出相当好的组织工程化软组织,且脂肪干细胞(ADSCs)为种子细胞更有优势,这为临床寻找一种安全有效的除皱新方法提供了新的研究方向。
赵影颖, 石润杰[9]2008年在《骨与软骨组织工程研究成果的介绍及问题展望》文中研究指明近年来随着组织工程技术的兴起,医务工作者们看到了一种更有效、安全的修复和重建缺损组织的治疗措施。通过国内外大量的动物实验,证实了组织工程化骨与软骨修复组织缺损的可行性、有效性及优越性。组织工程化骨与软骨修复组织缺损、重建组织功能,在动物模型以及初步临床应用研究领域已取得了一定的成果,相较传统手术方法而言,组织工程技术拥有更广阔的临床应用前景,尤其适用于骨科、口腔科、颅面外科、耳鼻喉科等临床科室。然而,通过现有的研究结果,认识到目前构建的组织工程化组织还很不完善,存在组织成分单一、生物活性不足、支架材料及组织再生能力有限、未能实现产业化生产等局限性。
阴其谱[10]2011年在《低温冻存同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨修复兔膝关节软骨缺损》文中研究说明目的对低温冻存异体软骨种子细胞构建的工程化软骨用于修复兔膝关节缺损进行大体和组织形态学观察。从而探讨低温冻存异体软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞修复关节软骨缺损的可行性及效果,为临床应用提供理论依据。方法体外实验:取用慢速梯度降温法保存的健康成年新西兰兔双膝关节软骨原代种子细胞, 37℃水浴中复温2分钟。取一定量的经滤膜除菌的海藻酸纳混悬液加入精确计数的软骨种子细胞,充分吹打混匀,种植密度为4×107/m1,然后在硅胶盘模上制备细胞盘,加入质量分数为1.06%的Cacl2液凝胶化10min,DMEM/F12无血清培养基加20%胎牛血清于24孔培养板中培养2周。分别于1、2、4、6、8、10、12、14天分别取3个完整的细胞盘,取均数绘制软骨细胞的生长曲线。于培养2周取材,切片行HE染色,观察软骨细胞的分布、形态。体内实验:同时选用成年新西兰大白兔27只,用电钻在股骨的髌股关节面中心造成直径3.0mm,深3.0mm的全层软骨缺损模型,随机在缺损处植入体外培养2周的软骨细胞-海藻酸钠盘(A组)及无细胞的海藻酸钠载体(B组),空白组不做处理(C组)。分别于术后4、8、12周采用空气栓塞法分批处死动物后取材,行大体观察,HE、甲苯胺蓝染色及免疫组织化学分析观察。进行Wakitani组织学评分,观察在体内关节软骨缺损修复效果。数据以均数±标准差(x±s)表示,用SAS8.1统计软件包进行分析,采用双因素方差分析进行实验效应和时间效应的分析,并用LSD-t检验进行组间多重比较,P<0.05为有统计学意义。结果1.软骨细胞盘内软骨细胞的观察与检测:软骨种子细胞在海藻酸钠支架内,于培养4天后开始增殖,2周时继续增量生长,并形成工程化软骨。2.移植处大体观察:术后三组观察,关节内滑膜均无充血、水肿,无关节液的异常,关节囊无粘连。术后12周时,A组修复缺损组织与周围正常软骨组织很难区分,与周围正常组织无明显界限,颜色接近,表面光滑,色泽一致,按压弹性一致。其余两组均可见缺损处未完全修复,有凹陷,按压略有弹性,低于周围软骨组织,未见软骨组织,与周围组织有明显差别。3.移植处组织学观察:术后12周时,A组以透明软骨修复为主。免疫组化示软骨细胞呈阳性,甲苯胺蓝染色示软骨组织胶原基质的合成与分泌功能旺盛。缺损部位修复面基本平整,修复组织和周围软骨整合紧密,基本无差异。整个观察期,未见血管及淋巴侵入。其余两组缺损区以纤维组织填充为主,略有凹陷,未能完全修复。甲苯胺蓝染色及免疫组化,B组之见少量软骨细胞表达,C组未见软骨细胞表达,细胞外基质与Ⅱ型胶原未见表达。4. Wakitani组织学评分及统计学分析,示A组与其余两组的修复效果有显著性差异(P<0.05)。结论1.通过慢速梯度降温法保存的软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞。2.海藻酸钠是一种比较理想的支架材料,软骨细胞-海藻酸钠复合物体在外培养可生成工程化软骨;3.用此复合物构建的工程化软骨可以修复兔膝关节缺损。
参考文献：
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[6]. 梯度材料骨髓间充质干细胞构建组织工程骨—软骨的研究[D]. 李志忠. 暨南大学. 2006
[7]. 温敏性壳聚糖水凝胶的研制及其用于羊关节软骨缺损修复的实验研究[D]. 郝彤. 中国人民解放军军事医学科学院. 2007
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[9]. 骨与软骨组织工程研究成果的介绍及问题展望[J]. 赵影颖, 石润杰. 中国组织工程研究与临床康复. 2008
[10]. 低温冻存同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨修复兔膝关节软骨缺损[D]. 阴其谱. 泰山医学院. 2011