刘山鸣[1]1998年在《河豚鱼BAC文库的构建及鉴定》文中研究指明河豚鱼品种红鳍东方豚(Fugu rubripes)已被广泛地接受为研究脊椎动物基因组的理想的模式生物。构建具有优良代表性(5个库容量以上)的高质量的基因组大片段文库是基因组研究，比较基因组学(comparative genomics)研究和完整基因的分离的前提条件。细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)文库是目前最理想的基因组大片段文库。 本文以河豚鱼精子DNA为材料，以第二代BAC载体pBelloBACll为载体，成功地构建了河豚鱼基因组的BAC文库。本文库由23，040个BAC克隆组成，这些克隆被一对一地保存在240块96孔细胞培养板的23，040个孔中。对100个随机抽样的BAC克隆进行插入片段大小分析，结果表明99个BAC克隆(99％)含有从25到450Kb大小不等的插入片段，它们的平均大小为102Kb。根据这些数据推算，本文库相当于5.8个河豚鱼单倍体基因组(即5.8个库容量)，从本文库中筛选到河豚鱼基因组任一单拷贝DNA序列的几率为99.7％。对10个插入片段大于100Kb的BAC克隆进行克隆片段的稳定性检查，发现经过连续100代繁殖后，BAC克隆的插入片段没有任何变化。冻融试验表明，反复冻融10次，抽样孔中的细菌存活率仍高于50％。就我们所知，本文库是这种新型模式生物在国际上的第一个BAC文库。 我们还利用自行设计的一套制膜工具，为本BAC文库制备了中密度菌落杂交膜。用人多药耐药性基因1(MDR1)的全长cDNA、PCR扩增所得的5′序列和3′序列为探针筛选本文库，获得了四个含有河豚鱼多药耐药同源基因的全长基因组片段的BAC克隆。Southern印迹分析和部分测序结果表明，本实验确实筛选到含有河豚鱼多药耐药基因的BAC克隆。作者相信，本河豚鱼基因组BAC文库定会在河豚鱼基因组研究和比较基因组学的研究中发挥重要作用。
刘勇[2]1998年在《河豚鱼多药耐药基因组全长序列和邻座基因的分析》文中认为人的多药耐药基因家族是由MDR1和MDR3组成，二者位于7q21.1，总跨度约230kb，其中MDR1＞120kb，MDR3为74kb。其表达产物为一跨膜蛋白p-glycoprotein，通过ATP提供能量，将进入细胞内的多种物质泵出细胞外，从而使细胞对这些物质产生耐药性，多药耐药基因的功能决定了它在肿瘤化疗中的位置而使其成为基因结构、功能和表达、调控研究中的热点。本文采用人的多药耐药基因的全长cDNA为探针，通过与河豚鱼cosmid文库的杂交获得候选克隆，再通过反复杂交验证最终获得9个多药耐药基因的阳性克隆，通过ExoⅢ系统和shotgun法获得cosmid 124A22的全长序列。采用生物信息学的多种软件系统，对全长序列进行分析、预测。结果表明：河豚鱼基因组中含有至少三个多药耐药基因，以头尾方式相连，在cosmid 124A22中含有两个阅读框架完整的多药耐药基因，全长序列分别为10.8kb和10.2kb，只有人的多药耐药基因的1／7-1／12，但二者的cDNA(exon4-exon28)分别为3732bp和3699bp，与人的3723bp(exon4-exon28)无论在核苷酸水平还是氨基酸水平都表现出较高的同源性，氨基酸水平的同源性分别为75％和76％，其结构也高度保守，包括跨膜结构，功能保守区即核苷酸结合位点高度保守。在这40kb的序列中共包括6.5个基因，基因的平均长度为6kb。这些结果都表明河豚鱼作为一新型模式生物可以在比较基因组学、基因的结构功能和表达调控等方面发挥积极、重要的作用。
张勇[3]2011年在《水稻白叶枯病菌和条斑病菌对噻枯唑和链霉素的抗药性机理研究》文中指出水稻白叶枯病和水稻条斑病是水稻上的两种重要细菌性病害,噻枯唑和链霉素则是我国防治这两种病害的主要药剂。噻枯唑和链霉素在我国使用分别已有30年和50年的历史,在靶标病原群体中也均已出现抗药性。因此开展噻枯唑和链霉素抗性机理研究,对于抗药性治理和抗性诊断技术发展具有十分重要的意义。本论文围绕抗性机理进行了以下研究：1.水稻白叶枯病菌抗噻枯唑菌株粘粒基因组文库构建；2.抗噻枯唑水稻白叶枯菌株基因组文库的活体筛选和基因分析；3.水稻条斑病菌和白叶枯病菌抗链霉素分子机理研究；4.水稻白叶枯病菌、条斑病菌、大白菜软腐病菌以及柑橘溃疡疾菌抗药基因rpsL的分子检测。1.水稻白叶枯病菌噻枯唑抗性菌株粘粒基因组文库构建为了探索水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)对噻枯唑的抗性机制,本研究建立了白叶枯病菌噻枯唑抗性菌株2-1-1的粘粒基因组文库。通过对2-1-1基因组提取并不完全酶切,回收>23.13kb基因片段,用来自溶源菌BHB2688和BHB2690、效价达1×108pfu/μgDNA的包装蛋白包装,感染宿主大肠杆菌S17-1,在含LB+Km+Sp的平板上进行筛选,随机挑选1200个转化子进行扩增保存,库容达到2.7倍；随机挑选15个转化子进行酶切验证,均有外源片段插入粘粒载体中,插入片段大小23-40kb,成功构建了抗噻枯唑白叶枯病菌2-1-1的粘粒基因组文库。2.水稻白叶枯菌噻枯唑抗性菌株基因组文库的活体筛选和基因分析将构建好的白叶枯病菌噻枯唑抗性菌株2-1-1粘粒基因组文库,1200个转化子通过两亲交配转染白叶枯病菌野生敏感菌株PXO99,获得的结合子再剪叶接种经300μg/ml噻枯唑处理的稻苗,筛选发现646、518等2个结合子表现抗药性；同时通过在清水对照处理的水稻上筛选,发现5、33、115、152、119、102、172、519、537、611、643、501、694、518、612、654、308、919、670等多个转化子在致病性上强于2-1-1和PXO99。通过对646和518片段进行亚克隆,进一步缩小功能片段,发现抗性菌株有两个基因发生突变。两基因分别为raxR2基因和conserved hypothetical protein (Chp)基因发生突变。其中raxR2基因有7个碱基发生突变,但未造成氨基酸序列变化；Chp基因发生一个碱基突变,引起了氨基酸变化(Val变成Gly)。3.水稻白叶枯病菌和条斑病菌链霉素抗性机理研究通过室内紫外诱变和药剂驯服获得了水稻条斑病菌和白叶枯病菌链霉素抗性突变体。这些突变体可以在含100μg/mL链霉素平板上生长,而敏感菌株在5μg/mL浓度下则不能生长。通过田间致病力测定,发现抗性菌株在水稻叶片上的致病力与敏感出发菌株无明显差异。从水稻条斑病菌和白叶枯病菌野生敏感菌株及室内诱导抗性菌株中分别扩增到编码核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)全序列,序列分析表明rpsL基因中第43位或第88位氨基酸由赖氨酸(AAG)突变为精氨酸(AGG)。rpsL基因全长375bp,编码125个氨基酸。序列分析结果表明水稻条斑病菌与水稻白叶枯病菌rpsL基因同源性达97%,编码氨基酸同源性达100%；与柑橘溃疡病菌氨基酸同源性达98%,与大白菜软腐病菌氨基酸同源性达99%。设计合成1对含有酶切位点(EcoRI)的特异性引物,从抗药性菌株UV-R-1(含rpsL基因43位点突变)和UV-R-3(含rpsL基因88位点突变)中扩增出含启动区的rpsL基因,成功构建了重组质粒pUFRRS知pUFRRX。功能验证证明,质粒pUFRRS和pUFRRX能够互补敏感菌株的抗药性功能,结合子RS1、RS2、RS3、PS1、PS2对链霉素敏感性测定结果证实rpsL基因序列发生点突变是水稻白叶枯病菌和条斑病菌对链霉素产生抗药性的主要原因。同时转化子的致病力与敏感出发菌株和抗药突变体的致病力无明显差异。4.水稻白叶枯病菌、条斑病菌、大白菜软腐病菌以及柑橘溃疡病菌抗药基因rpsL的分子检测通过室内药剂驯化和紫外诱导,获得大白菜软腐病菌链霉素抗性突变体12个,柑橘溃疡病菌突变体11个,番茄细菌性斑点病菌突变体12个。分别比较番茄细菌性斑点病菌、柑橘溃疡病菌、大白菜软腐病菌链霉素抗性突变体与他们的敏感亲本菌株的序列,发现所有抗链霉素菌株的rpsL基因中第43位或第88位氨基酸均由赖氨酸(AAG)突变为精氨酸(AGG)。由于psL基因43位点是MboⅡ的酶切位点,因此通过PCR-RFLP方法可以检测出上述细菌rpsL基因43位点突变情况。通过设计一对特异性引物,扩增rpsL基因部分片段304bp,若43位点发生突变,则酶切位点消失,304bp则被酶切成201bp和103 bp片段；若43位点不发生突变,304bp则被酶切成201bp、103bp和55 bp片段。研究结果表明PCR-RELP方法可以快速、准确的检测出rpsL基因43位点突变情况,检测结果与直接测序结果完全一致,且操作简便。
王小刚[4]2010年在《点带石斑鱼精子种质保存研究》文中提出点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)是我国东南沿海重要的名贵海水养殖经济鱼类。目前对点带石斑鱼的生物学研究及其人工繁育技术已相当成熟,而对该鱼的精子种质保存技术尚未开展研究。本论文对点带石斑鱼的精子活力、超低温冷冻前后的精子超微结构的差异和精子超低温冷冻保存进行了较详细的研究,为点带石斑鱼精子低温冷冻保存和低温精子种质库的建立提供理论依据。通过设置盐度和pH梯度,研究了盐度、pH值对点带石斑鱼精子活力的影响；同时利用电子显微镜技术对点带石斑鱼精子的超微结构进行了观察,比较了超低温冷冻前后精子超微形态结构的差异。研究结果表明：(1)该鱼精子活力的适宜盐度范围为15-35,盐度为15时,精子寿命最长为26min；最适pH值范围为6.5-8.0。(2)正常的点带石斑鱼精子由头部、中段和尾部三部分组成,精子头部呈球圆形或近圆形,直径约1.8μm；中段不明显,可见线粒体；鞭毛细长,约15μm,尾部主要结构是轴丝,为典型“9+2”微管结构。(3)超低温冷冻保存后,点带石斑鱼精子的形态结构损伤明显,主要表现为质膜褶皱、破裂,细胞质外漏,线粒体膨胀破损,脱落和鞭毛断裂等特征。通过选用TS-19、TS-2、Hank's、MPRS、Cortland、0.75% NaCl等作为稀释液及10%-25%二甲亚砜(DMSO)、甘油(Gly)、甲醇(MeOH)作为抗冻液,对繁殖季节中3个不同时期的点带石斑鱼精液进行超低温冷冻保存研究。研究结果表明：(1)Hank's溶液为点带石斑鱼精子冷冻保存最适冷冻稀释液；(2)点带石斑鱼精子保存的最适冷冻保护液组合为Hank's溶液与10%-15%DMSO溶液,可以获得60%以上的冻精成活率,而使用不同浓度的MeOH作为抗冻液时,冻精成活率均为O%；(3)以10%-25%Gly作为抗冻液时,冷冻前未加天然海水时均能激活点带石斑鱼精子正常运动,效果与天然海水相似,加入天然海水后精子运动效果急剧下降,精子冷冻保存后也存在同样现象；(4)为保证获得更高的冻精成活率,点带石斑鱼精液冷冻保存样品的最佳获取时期是在亲鱼排精前1天进行为宜。
付晓腾[5]2014年在《栉孔扇贝（Chlamys farreri）高密度图谱构建和基因组框架图绘制》文中研究说明栉孔扇贝Chlamys farreri （Jones et Preston1904）作为双壳类的一种，是我国极具商业价值的重要经济种。本研究借助二代测序平台，建立了栉孔扇贝高通量SNP开发与分型技术，构建了高精度图谱，进行了经济性状的精细定位，绘制了基因组框架图谱，并实现了遗传图谱与序列图谱的整合，为扇贝基因组学研究提供了较为全面的序列信息和整合的资源工具，也为双壳贝类生长繁殖机制、进化适应性机制和基因组辅助育种研究提供了新的起点。1栉孔扇贝高通量SNP开发与分型技术的建立本研究首先对2b-RAD技术进行了改进和优化，包括限制性内切酶选择、选择性碱基确定和barcode设计三方面，建立了高通量SNP开发技术。本研究还开发了适合无参照基因组的非模式生物作图群体的SNP分型策略，将共显性和显性标记的分型算法整合成流程化软件RADtyping，并对其分型结果进行了评价。拟南芥拟测交F1群体模拟数据的分型结果评价显示：当亲本测序深度均超过10x，高于98%的位点源于基因组单拷贝区，说明RADtyping可有效过滤重复序列。当亲本和子代测序平均深度均达20x，共显性标记分型准确性达97%；显性标记分型准确性则在较低测序深度下就可达98%。对作图群体而言，当每个亲本和子代的平均测序深度均至少20x则可满足分型准确性的要求。通过比较两套重复测序文库分型结果发现，共显性标记一致性达96%，显性标记分型一致性达99%。对RADtyping分型得到的8个共显性和8个显性标记位点进行Sanger测序的结果显示共显性标记验证率达96%，显性标记验证率达97%，验证了RADtyping在无参照基因组SNP分型的准确性。2栉孔扇贝高精度图谱构建和重要经济性状的QTL定位本研究构建了栉孔扇贝首张高密度遗传连锁图谱。整合图谱包含3,806个SNP，分布于19个连锁群，图谱总长1543.4cM，标记平均间隔为0.41cM，基因组覆盖率达99.5%，623个SNP注释到功能基因，平均重组率为1.3cM/Mb。生长性状的QTL定位显示：于1号和3号连锁群分别检测到一个显著的QTL区间，各解释表型变异的11.4%和16.9%。关联分析结果与QTL定位有较为一致的趋势，验证了QTL定位的可靠性。3号连锁群QTL区间内的f68558标记位于转录因子PROP1（Homeobox protein prophet of Pit-1）的内含子中，已知PROP1具有调控生长激素分泌的作用，在动物中生长激素可调控生长、细胞分裂和再生，推测PROP1基因可能是控制栉孔扇贝体尺性状的主效基因。性别相关的QTL被定位于11号连锁群的0.37cM的区间，关联分析鉴别到27个显著与性别相关的标记(P <1E-6)且位于QTL定位的区间中。标记f93422位于转录因子ZNFX1（NFX1-type zincfinger-containing1）中，已有研究表明河豚中ZNFX1与性别决定基因AMHR2（anti-Mullerian hormone receptor type II）紧密连锁。本研究为解析扇贝生长和繁殖调控机制提供了候选位点。3栉孔扇贝全基因组序列图谱绘制及与遗传图谱的整合本研究根据扇贝基因组高度杂合高重复序列含量的特点，选用家系来源的一只贝为材料，搭配构建不同长度DNA插入片段文库进行测序，获得栉孔扇贝的基因组测序数据。组装采用先将两套杂合contigs分出后，单倍体基因组单独拼装再整合的策略进行栉孔扇贝全基因组框架图谱的绘制。拼接共获得143,162条scaffolds，scaffold N50为528.6Kb，总长度约805Mb；Contigs共192,003条，contig N50达到21.5Kb，总长为777Mb。基因组scaffolds覆盖了93%的转录组序列，基因预测获得20,573个基因，其中62.7%的基因获得功能注释，基于同源比对和从头预测获得的重复序列占基因组序列的12.7%。借助遗传图谱，与基因组框架图谱和物理图谱进行了整合。从染色体水平，排序了2,923条scaffolds。栉孔扇贝基因组框架图谱的获得，为解析双壳类系统进化、环境适应机制和生长、发育、繁殖等生物学问题提供了重要基础资源，同时为栉孔扇贝基因组精细图谱绘制奠定了基础。
沈伟[6]2003年在《用BAC介导的转基因鼠研究人α与β珠蛋白基因簇的表达调控》文中进行了进一步梳理人类珠蛋白基因家族分为α和β两个基因簇。位于第16号染色体短臂上的α-珠蛋白基因簇以5'-ζ-ψζ-ψα-α_2-α_1-θ-3'顺序排列，其中ζ为胚胎型功能基因，α为胎儿型和成年型功能基因，全长约40kb；位于第11号染色体短臂上的β-珠蛋白基因簇以5'-ε-~Gγ-~Aγ-ψβ-δ-β-3'顺序排列，其中ε为胚胎型功能基因，~Gγ和~Aγ为胎儿型功能基因，β为成年型功能基因，全长约50kb。 珠蛋白基因在个体发生中表现为依次表达，并具有高度的组织特异性和发育阶段特异性；两类珠蛋白基因的终产物间始终维持平衡。珠蛋白基因的转录受编码基因与其旁侧序列甲基化程度、顺式作用元件、细胞内反式作用因子和染色质结构的调节控制。β-珠蛋白基因座控制区(Locus Control Region，LCR)位于ε-基因上游，由四个红系特异性的DNase I高敏位点(HS)和一个非红系特异性的HS(功能有争议)组成，它们对于β-珠蛋白基因簇内各个珠蛋白基因在红系组织细胞中的高表达是必需的。α-珠蛋白基因簇上游亦存在类似的一系列高敏位点(Positive Control Element，PCE)，参与调控α样珠蛋白基因的表达。 转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组中稳定整合并能遗传给后代的一类动物。利用转基因动物研究真核基因的表达调控可以在分子水平上设计实验，从四维时空观察转基因的整体效应。此外，利用转基因动物技术可以建立人类疾病相关基因的转基因动物模型，以探讨异常基因的表达调控规律。近年发展起来的建立在大肠杆菌F因子基础上的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)载体，可携带长达300kb以上的外源DNA片段，使人们得以利用包含完整基因簇的大片段DNA进行转基因动物研究，克服以往小片段重组体转基因实验中忽略基因间或调控元件之间相互作用的缺陷，从而研究大片段基因簇的表达调控规律。BAC载体的
参考文献：
[1]. 河豚鱼BAC文库的构建及鉴定[D]. 刘山鸣. 中国协和医科大学. 1998
[2]. 河豚鱼多药耐药基因组全长序列和邻座基因的分析[D]. 刘勇. 中国协和医科大学. 1998
[3]. 水稻白叶枯病菌和条斑病菌对噻枯唑和链霉素的抗药性机理研究[D]. 张勇. 南京农业大学. 2011
[4]. 点带石斑鱼精子种质保存研究[D]. 王小刚. 海南大学. 2010
[5]. 栉孔扇贝（Chlamys farreri）高密度图谱构建和基因组框架图绘制[D]. 付晓腾. 中国海洋大学. 2014
[6]. 用BAC介导的转基因鼠研究人α与β珠蛋白基因簇的表达调控[D]. 沈伟. 中国协和医科大学. 2003
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