张欣欣[1]2001年在《活性氧对耳蜗损伤的分子机制研究》文中研究说明线粒体是内源性ROS产生的重要场所，mtDNA由于缺乏组蛋白及DNA结合蛋白的保护和自身修复系统，在ROS保护酶功能低下或缺乏时，极易受到损伤而突变。为探讨ROS对耳蜗损伤的分子机制，我们应用分子生物学技术对Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗及同系野生型CD129/CD-1小鼠耳蜗mtDNA进行检测，从以下4个方面分别进行论述。 一、Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mtDNA缺失的检测 目的 缺乏Cu/ZnSOD的保护，ROS对耳蜗mtDNA的影响，在分子水平揭示ROS对耳蜗的损害作用。方法 应用套式PCR和分子克隆测序技术对14个Cu/ZnSOD基因敲除纯合突变(Cu/ZnSOD无活性，Sodl-/-)小鼠耳蜗和 7个Cu/ZnSOD杂合突变(50％Cu/ZnSOD失活，Sod1+/-)小鼠耳蜗及16个同系野生型(Cu/ZnSOD活性正常，Sodl+/+)小鼠耳蜗进行研究。结果1.Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mtDNA有叁种缺失，分别为mtDNA3867bp、mtDNA3726bp、mtDNA4236bp缺失，其中Sodl-/-小鼠和Sodl+/+小鼠耳蜗 mtDNA易出现 mtDNA3867bp缺失，Sodl+/-小鼠耳蜗mtDNA易出现3726hp缺失。mtDNA4236bp缺失在叁种小鼠中无或不常见。2．MtDNA缺失发生率及缺失量随着Cu/ZnSOD活性的递减而增加，Sodl-/-小鼠(分别为100%和 6.284×10~-4)明显高于Sodl+/+小鼠(分别为31.25%和0.273×10~-4)(p<0.01)。mtDNA缺失发生率在Sod1-/-小鼠和Sod1+/-小鼠(71.43%)之间及Sod1+/-小鼠和Sod1+/+小鼠之间无明显不同，mtDNA缺失量两组内小鼠比较有显着的差异(p<0.01)。结论Cu/ZnSOD对耳蜗mtDNA具有保护作用，在其功能活性低下或缺乏时，ROS可造成耳蜗mtDNA出现多处缺失突变，缺失的发生率和含量随着Cu/ZnSOD活性的增加而降低。r－—一、－J—。“、二、汕一 、—x 二 二，。工。—”趣C，W。冗W。S二FpeZ．x 二”7、＿1卜巧一／“， 川Y w．”＊b／ 博士后工作报告 中文摘要 8 nlDJon缺失突变导致编码OThHOS酶的活性异常，可能在造成听觉功能 障碍上起到了重要作用。 二、耳蜗是ROS损伤的敏感标靶一lOS损伤mtDNA的组织 特异性研究 目的探讨ROS对各种组织moNA的损伤情况，耳蜗IntDNA是否为 ROS损伤的标靶。方法应用套式 PCR及分子克隆测序技术对 10只 CLI／ZnSOD基因敲除小鼠及5只同系野生型小鼠耳蜗、脑、肝脏、肾脏、脾 脏、心脏及皮肤组织进行研究。结果1．各组织mw可检测到3种缺失， 常见的缺失为mtDN3 867hp和mo狐372柳缺失，IllUj：rvn．arx236’bp缺失不 常见。2．moNA缺失在不同组织的含量有明显的不同，肝脏和肾脏组织含 量最高，耳蜗、心脏和大脑组织其次，脾脏及皮肤组织含量最低。与野生 型小鼠比较，Cu／ZnSOD基因敲除小鼠皿o的A在不同组织的缺失量是野生 型小鼠的 3～20倍，其中耳蜗组织 mtDNA缺失量约是 WT小鼠的 15倍。结 论缺乏Cll／ZnSOD的保护，ROS可以攻击各种组织IntDN，但具有明显 的组织特异性，耳蜗IntDM是其损害的敏感标靶。 叁、老龄小鼠耳蜗moNA缺失惰况 目的 探讨老龄小鼠耳蜗moNA缺失情况，明确老龄小鼠耳蜗mtDNA 缺失的位置。方法应用套式PCR和DM测序技术对不同月龄CD129C 杂交小鼠耳蜗31个（2月龄7个，7—10月龄16个，1719月龄8个）进行 定性及定量检测。结果 1．小鼠耳蜗 IntDN3867bp大片缺失，缺失发生在 fit9H～l：1112970 Z间，其两攸 m9089～l：lly103和 m12956ofl：［12970 为核昔酸 完全相同的15hp重复序列。2随着小鼠月龄的增加，耳蜗1llUJfroH6867bD 缺失发生率有明显增加的趋势，2月龄小鼠未发现缺失①厂人17叶9月龄 小鼠0侣）明显高于7～10月龄小鼠（4／16）中＜0．01人3．缺失＜tD灿总 二 ＿＿。＿＿．．、、。、。。＿＿r，。＿．、＿＿．＿、。＿、。L／＿、l、。－兰M。一．！l．Ic、尸卜。、、2呐＿／Ws。”V句为 呵。”卜”）、二＼忖“松。。。蚁／议＜嚎、耶“C5n叁沪豪穹匆才么不／委二／口L大”。”～广。。’尸”。“’，。。。二－’”丫二““厂一 f人。“LU钦二人网／不虫砒琢。一 博士后工作报告 中文摘要 a IntDNA比值，17叶9月龄小鼠明显高于710月龄小鼠（＜0．01人 结论老 龄小鼠耳蜗出现 ］：I］：ln－wtyM．－－867bp大片缺失可能与老年性聋发生密切相关。 四、耳蜗铡损伤模型的确立 目的确定一?
刘斌[2]2006年在《NF-κBp65，I-κBα及iNOS在豚鼠椎基底动脉缺血再灌注耳蜗损伤中的作用和葛根素的保护作用研究》文中研究指明耳蜗缺血再灌注损伤是内耳疾病中较为常见的一种病理过程，但其损伤的确切机制至今尚未完全明了，临床对该损伤也无有效治疗方法。本文通过颅底径路造成豚鼠椎基底动脉缺血再灌注耳蜗损伤模型，观察了缺血及缺血再灌注对耳蜗的听功能和形态学的影响；而且进一步采用免疫组织化学方法、Western blot和EMSA技术探讨NF-κBp65／IκBa-iNOS通路在耳蜗缺血再灌注损伤时的激活情况，从信号转导通路方面探讨了再灌注损伤的机制。研究发现在椎基底动脉缺血再灌注时耳蜗有明显听功能和形态学改变，NF-κB p65／IκBα-iNOS通路在耳蜗缺血再灌注损伤时激活。研究从整体动物和分子水平探讨了葛根素抗耳蜗缺血再灌注损伤的作用及机制，观察到葛根素对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤有明显的保护作用，而且可以抑制NF-κBp65的激活及IκBα的降解，下调iNOS的表达。本研究证实NF-κB p65／IκBα-iNOS通路参与了耳蜗缺血再灌注损伤病理过程，为临床使用葛根素治疗缺血性内耳疾病提供了理论依据。
陈浩[3]2013年在《盐酸椒苯酮胺对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤保护作用及机制》文中研究指明听力障碍是一类常见疾病,严重影响着人类的身体健康和生活质量,据世界卫生组织(WHO)估计,全世界有轻度听力损失的人近6亿,2.5亿人患有中度以上听力损失,其中叁分之二在发展中国家。而每出生700—1000个新生儿中,就有一个听障患儿。中国是世界上最大的发展中国家,13亿人口中听力障碍残疾人就有2780万,为各类残疾之首。能否找到有效的方法预防和治疗听力障碍,是我们共同面临的巨大挑战。听力障碍分传导性、感音神经性和混合性,绝大部分为感音神经性。感音神经性聋是耳鼻咽喉头颈外科学中常见病,是内耳及其神经传导通路一系列病变所致听力损失的总称,发病原因有遗传性、缺血性、耳毒性、感染性、老年性、噪声性、创伤性、代谢性、自身免疫、突发或特发性、中枢性、听神经病、肿瘤、功能性等,其中以缺血、病毒感染、耳毒性药物中毒及老年性退行性变等最常见。病理改变主要是耳蜗毛细胞损伤、螺旋神经节、支持细胞及神经末梢的器质性改变以及耳蜗神经、脑干听觉通路及听觉中枢病变或受损。耳蜗内包含两种类型感觉细胞：内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC),它们负责将声音转化为电信号进行传递,这些信号经过螺旋神经节神经元(SGC)换元传递到听觉脑干通路。而这些IHC、OHC和SGC都缺乏再生的能力,因此,耳蜗的任何损伤都会导致不可逆的听力损失。在耳蜗损伤所导致的听力障碍里,耳毒性药物所致损伤是当前临床治疗上的难题,众多研究围绕其发病机制及治疗展开,希望可以为临床治疗耳毒性药物损伤提供更好的方法。关于药物性损伤的机制,目前多认为与自由基损伤、钙离子超载等有关[2],其中氨基糖苷类所致的耳毒性感音神经性聋属于临床中常见的类型。氨基糖苷类抗生素(Aminglycosides, AmAn)具有抗菌谱广、杀菌抑菌作用强、价格便宜等许多适用于临床使用的优点,但因其具有耳毒性、肾毒性等严重的不良反应,限制了临床应用,在短期应用AmAn治疗的病例中,耳毒性发生率为20%,而在治疗结核及其他严重细菌(尤其是革兰阴性细菌)感染的长期应用中,耳毒性发生率可高达80%[3]。近年来由于结核和其他新的感染性疾病如抗艾滋病的发生率增高,使AmAn又有新的应用。有研究表明AmAn可与HIV中的RNA的逆转录病毒蛋白应答因子(RRE)结构域结合,使HIV的RRE. Rev(逆转录病毒蛋白)相互作用产生抑制,从而具有阻遏HIV复制的活性[4],使得AmAn的很多应用不可替代。属于氨基糖苷类抗生素的庆大霉素(gentamicin, GM)是由绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌等发酵产生的一种杀菌力较强的广谱抗菌素,目前被广泛用于临床。GM由于廉价抗菌谱广,在临床广泛应用,以至出现了不少致感音神经性聋的病例。同时,因GM的肝肾毒性较其他AmAn小,使其成为是实验研究中制造感音神经性聋动物模型的理想药物。GM在机体内的药理学分布特点是不易进入胞内,不易透入关节腔,也不易透过血脑屏障,其主要集中在细胞外液,特别是内耳淋巴液。庆大霉素的内耳淋巴液的蓄积[7]构成了其耳毒性的生理基础,机制较为复杂,一直是国内外众多学者研究的热点。目前认为内耳毛细胞受损与氧有自由基、钙超载和启动凋亡等相关。氧自由基主要通过一系列的过氧化反应造成组织细胞的损伤,往往损害细胞膜磷脂分子中不饱和脂肪酸的过氧化,最终使生物膜受到严重损伤。郭玉芬等证实聚天冬氨酸酶对庆大霉素致耳蜗组织氧自由基的产生有抑制作用,从而拮抗了庆大霉素所致耳蜗毒性的发生。McFadden等已证实一种超氧化物歧化酶的类似物,可防止由庆大霉素引起的毛细胞损伤。氧自由基和钙超载除直接造成细胞损伤外还可导致细胞的凋亡[11]。也有学者证明,细胞凋亡是氨基糖苷类抗生素致聋的主要方式,细胞凋亡的“瀑布式”级联反应主要有两条途径：①细胞外途径,即死亡受体途径。②细胞内途径,研究比较多的是线粒体途径。但两种途径最终都依赖于Caspase-3的活化,caspase-3在凋亡级联反应中处于核心地位,是凋亡的最终执行者。Shimizu等通过研究发现凋亡抑制剂—钙蛋白酶和半胱天冬酶抑制剂可以阻止AmAn耳毒性的产生,促进前庭毛细胞的存活,表明凋亡与AmAn前庭耳毒性有着紧密关系。目前临床上仍然缺乏治愈感音神经性听力障碍和保护听觉功能的有效的方法。虽然近年来一些研究报道了哺乳动物甚至人的内耳前庭及耳蜗毛细胞在受伤后可能再生,但哺乳动物OHC、IHC和SGC再生的在体试验尚未取得成功。有研究提出耳聋基因概念,认为耳聋与线粒体DNA突变有关,发现tRNAIleA4317G同质性突变,确认A1555G和C1494T突变与感音神经性耳聋和氨基糖甙类耳聋有关。上述研究停留在实验阶段,尚未展开临床应用。感音神经性耳聋多数治疗效果不佳,大多数药物治疗无效的患者只能选择配戴助听器或行人工耳蜗植入术。当前人工耳蜗植入术可以赝复重度的感音神经性耳聋,但价格昂贵。所以,探索对各种因素导致内耳损伤的早期干预和有效治疗药物就显得尤为重要。由中国医学科学院药物研究所自主创新研制的化合物盐酸椒苯酮胺(peperphentonamine hydrochloride,PPTA),3个发明专利已获授权,2个国内和1个国际PCT发明专利己申请。2008年获11类化学药品临床试验批件并已完成127例Ⅰ期临床试验。临床前研究提示其具有清除再灌注损伤时自由基,抑制脂质过氧化反应的作用。徐江平研究PPTA对脑细胞受损所产生的氧自由基具有清除作用,可增加SOD活力和GSH含量。也有实验表明PPTA有抗钙超载的作用,对心肌损伤线粒体有明显的保护作用。PPTA也可使线粒体膜流动性保持正常,明显减轻线粒体的超微结构损伤。而氧自由基和钙超载往往导致机体大多数组织和细胞损伤,而线粒体的损伤又可活化Caspase-3启动细胞凋亡。有研究表明PPTA具有显着降低Caspase-3mRNA的表达,表现出良好的抗调亡作用。这为PPTA用于感音神经性耳聋的干预和治疗奠定了基础。本研究以庆大霉素的耳毒性制造耳蜗损伤豚鼠作为实验动物,采用鼓阶开窗微孔注入技术和腹腔注射方法,观察PPTA对耳蜗的保护作用,通过听性脑干反应(ABR)、免疫组化(IHC)、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(ternial-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeing, TUNEL)、蛋白质免疫印迹技术(Western blot)、扫描电镜(SEM)等方法,透射电镜(TEM)等方法检测ABR RT、PL、T-SOD、GSH、Caspase-3等指标及凋亡和坏死等形态学变化,探讨GM的耳毒性机理及PPTA对耳蜗损伤的保护机制,为感音神经性聋药物治疗提供新的实验依据。本研究分为以下叁个部分：第一部分庆大霉素致豚鼠耳蜗损伤模型和鼓阶开窗微孔注入技术的建立目的建立庆大霉素制造豚鼠的耳蜗损伤模型和鼓阶开窗微孔注入技术,探讨在模型豚鼠上ABR的应用及听力学特征,并研究经鼓阶开窗手术对听力和耳蜗组织的影响。方法听力正常实验级豚鼠30只,随机分为叁组：A组(Control group):10只,生理盐水,等量,每日称重,按体重计算用量,肌注,28d；B组(GM group):10只,硫酸庆大霉素注射液,120mg/(kg-d),每日称重,按体重计算用量,肌注,28d。C组(Fenestration group):10只,左耳行鼓阶开窗微孔注入手术,注入人工外淋巴液,正常饲养7d。A、B两组GM前1h及第28天测ABR;A、C两组术前及术后7d测ABR。数据以X±S表示,采用SPSS13.0软件包进行统计学分析。对实验前后数据进行协方差分析,若实验前ABR反应阈对试验后ABR无影响,则用独立样本t-test检验两组前后差异,用配对样本t-test检验同一组前后差异。结束后将A,B,C组豚鼠断头取听泡,行扫描电镜(SEM)形态学观察、免疫组化(IHC)细胞染色观察。结果用药28天后,GM组比正常组ABR RT显着升高(t=18.108,P<0.001)；经鼓阶开窗微孔注入术7天后,C组和正常组ABR RT无显着差异(t=0.000, P=1.000)。IHC及SEM观察见GM组毛细胞纤毛倒伏、断裂、细胞缺失,细胞核出现固缩、棕染等,A组及C组未见这些现象。结论庆大霉素可以建立稳定的感音神经性聋动物模型；庆大霉素耳毒性体现在RT提高,耳蜗OHC、IHC、SGC、SV细胞坏死及凋亡；通过豚鼠耳蜗鼓阶钻孔开窗,微孔注入手术后对豚鼠听力及耳蜗组织没有产生明显影响。第二部分鼓阶微孔注入PPTA对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤的保护作用及相关机制研究目的将PPTA经鼓阶开窗微孔注入技术注入豚鼠耳蜗,研究其对庆大霉素耳毒性的拮抗作用及氧自由基机制。方法听力正常豚鼠45只,分为叁组：A组(Control group)15只,以等量生理盐水肌肉注射,连续3d；B组(GM group)15只,以GM160mg/kg.d,肌肉注射,连续3d；C组(PPTA+GM group)15只,以GM160mg/kg.,3d,每日GM1小时前,行双侧鼓阶开窗微孔技术注入PPTA (浓度2mg/ml)10μl。(注：每组都以10只做统计学分析,额外为扫描电镜做形态学观察用)。叁组动物分别在用药前,第3天用药后测ABR。在最后一次测ABR每组取10只迅速断头取听泡取左侧耳蜗(n=10)行T-SOD活力检测,取右侧耳蜗(n=10)行GSH含量检测；各组ABR RT、T-SOD、GSH统计使用SPSS13.0分析软件,数据以X±S表示,用协方差分析处理数据,若实验前ABR反应阈对实验后无影响,对试验后数据进行单因素方差分析。每组剩余5只豚鼠耳蜗行扫描电镜(SEM)形态学观察。结果用药3d后,GM组ABR RT显着高于正常组(P<0.05),GM组T-SOD活力、GSH含量显着显着低于GM+PPTA组(P<0.05)；经鼓阶开窗微孔技术注入PPTA3d后,PPTA+GM组ABR RT明显高于Control组(P<0.05),但显着低于GM组(P<0.05)。PPTA+GM组比GM组及正常组T-SOD活力、GSH含量显着低于正常组(P<0.05),但显着高于GM组(P<0.05)。SEM观察见：GM后毛细胞纤毛倒伏、断裂、细胞缺失等,PPTA+GM组亦有此现象,但较GM组轻微,正常组未见这些现象。结论促耳蜗组织内产生过量OFR造成耳蜗组织细胞损伤,是GM耳毒性的一个重要原因。经鼓阶开窗微孔技术注入PPTA可拮抗GM所致听力和耳蜗组织损伤；PPTA可以通过清除耳蜗组织内氧自由基和增强抗氧化能力从而发挥耳蜗保护作用。第叁部分腹腔注入PPTA对庆大霉素豚鼠耳毒性拮抗作用及对耳蜗组织Caspase-3表达的影响目的研究PPTA全身给药对庆大霉素耳毒性的拮抗作用及相关机制。方法听力正常豚鼠45只,分为叁组：A组(Control group)15只,以等量生理盐水肌肉注射,连续14d；B组(GM group)15只,GM120mg/kg.d,肌肉注射,连续14d；C组(PPTA+GM group)15只,PPTA10mg/kg.d腹腔注射+GM120mg/kg.d (1h后),肌注,连续14d。叁组动物在用药前1h,第14天用药后测ABR。在最后一次测ABR后所有动物迅速断头取听泡,以左侧耳蜗(n=10)行Western blot检测Caspase-3表达,统计使用SPSS13.0分析软件,数据以X±S表示,用协方差分析处理数据,若实验前ABR反应阈对实验后无影响,对试验后数据进行单因素方差分析。以右侧耳蜗行TUNEL染色,每组剩余5只一侧耳做扫描电镜另一侧耳做透射电镜观察。结果GM组、PPTA+GM组ABR RT显着高于Control组(P<0.05), PPTA+GM组ABR RT显着低于GM组；Western blot结果表明用药后GM组豚鼠caspase-3表达显着增加(P<0.001); PPTA+GM组caspase-3的表达显着高于Control组但显着低于GM组(P<0.001)。SEM/TEM和TUNEL观察见：GM组毛细胞损伤严重,耳蜗Corti器、侧壁的血管纹和螺旋神经节存在阳性细胞,出现了凋亡和坏死的形态学特征；而PPTA+GM组损伤较GM组明显减轻；Control组未见阳性细胞。而结论庆大霉素耳毒性所致耳蜗组织损伤中,凋亡与坏死并存,GM通过caspase-3途径参与了耳蜗细胞凋亡；PPTA具有拮抗GM耳毒性所致的耳蜗功能和结构损伤的作用；PPTA通过降低caspase-3蛋白表达,抑制凋亡,从而对豚鼠耳蜗组织起到保护作用。
谢利红[4]2011年在《~（60）COγ射线照射对豚鼠耳蜗损伤及乙酰半胱氨酸辐射防护的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:放射治疗是鼻咽癌等头颈部恶性肿瘤的主要治疗手段。在鼻咽癌等头颈部恶性肿瘤患者的放射治疗时,单侧或双侧耳蜗受到相当于肿瘤治疗剂量的照射,引起放疗后的感音神经性耳聋(sensorineurial hearing loss ,SNHL)的发生,在中国,鼻咽癌放疗后SNHL的发生率可达36%,严重影响患者的生活质量。放射治疗所致的SNHL的发生发展规律仍不清楚,目前对放疗后SNHL尚无有效的治疗方法,给临床治疗工作带来了很大的困扰。因此研究电离辐射引起耳蜗损害的细胞分子机理,对于如何使用抗辐射损伤的药物治疗具有重要的临床意义。本研究旨在通过建立~(60)Coγ射线照射致豚鼠耳蜗损伤的模型,通过电生理、病理形态学、免疫组织化学染色、逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction ,RT-PCR)、脱氧核苷酸末端转移酶介导的dTP缺口末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling ,TUNEL)等检测技术,观察豚鼠~(60)Coγ射线照射后耳蜗损伤的改变,初步探讨耳蜗损伤发生的可能分子机制,并局部经圆窗膜给予抗氧化剂乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)以及观察其对~(60)Coγ射线照射后耳蜗损伤是否具有防护作用,为放射治疗引起的SNHL的治疗寻求安全有效的药物提供实验依据。方法:本研究分叁部分:第一部分,~(60)Coγ射线照射致豚鼠耳蜗损伤模型的建立;第二部分,~(60)Coγ射线照射致豚鼠耳蜗细胞凋亡的相关研究;第叁部分,乙酰半胱氨酸在~(60)Coγ射线照射引起的耳蜗损伤中的防护作用。第一部分实验方法:48只白化豚鼠随机分为对照组和放疗组,对照组8只为未进行~(60)Coγ射线照射的健康豚鼠,放疗组40只,以右耳为照射耳,一次性给予耳颞部70Gy~(60)Coγ射线照射,于照射后第1天、第4天、第7天、第14天、第30天行听性脑干反应(auditory brainstem response ,ABR)测听后处死动物,取右侧听泡固定,做耳蜗中轴切片HE染色,每组随机取2只耳蜗做基底膜扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)检查,观察耳蜗组织的形态学病理变化。第二部分实验方法:白化豚鼠130只,分为对照组和放疗组,对照组26只,为未进行~(60)Coγ射线照射的健康豚鼠,放疗组104只,以右耳为照射耳,一次性给予耳颞部70Gy ~(60)Coγ射线照射,并于照射后第1天、4天、7天、14天处死豚鼠行以下相关指标的检测:①耳蜗超氧化物酶( superoxide dismulasc , SOD )和丙二醛(malondialdehyde ,MDA)的检测。②TUNEL法检测耳蜗组织的细胞凋亡情况。③免疫组织化学法检测凋亡蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate specific proteases ,Caspase)3、Caspase8、Caspase9的表达。④蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测耳蜗Caspase3、Caspase8、Caspase9的表达。⑤RT-PCR检测凋亡基因Bax、Bcl-2和Fas信使核糖核酸(messenger RNA ,mRNA)的表达。第叁部分实验方法:白化豚鼠144只,随机分为4组,每组36只,四组分别为:正常组(未进行任何干预的健康豚鼠)、单纯放疗组、生理盐水组(放疗+生理盐水组)、乙酰半胱氨酸药物组(放疗+乙酰半胱氨酸组)。每组均取右耳为实验耳。除正常组外,其余3组均分别在照射后第4天、第14天行以下相关检查:①ABR检测。②耳蜗SOD和MDA的检测。③TUNEL法检测耳蜗组织的细胞凋亡。④免疫组织化学法检测凋亡蛋白Caspase3、Caspase8、Caspase9的表达。结果:第一部分,①大体标本观察:70Gy剂量照射后第1天、第4天、第7天所有豚鼠听泡内无积液及脓性分泌物,第14天少数豚鼠有中耳积液,照射后第30天的豚鼠右耳听泡内均有积液或脓性分泌物。②ABR反应阈值:照射后第1天ABR阈值(20.00±4.47 dB nHL)比对照组(11.66±2.58 dB nHL)高,但比较差异无统计学意义(p>0.05),照射后第4天ABR阈值(25.00±10.48 dB nHL)与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05),照射后第7天(46.66±9.31 dB nHL)、第14天(55.00±5.47 dB nHL)ABR阈值与对照组比较差异有显着性统计学意义(p<0.01),照射后第30天由于豚鼠听泡内有脓性分泌物,ABR阈值最高声强105dB nHL引不出。③HE染色显示:对照组耳蜗组织结构正常,未出现变性萎缩等异常改变,而放疗组的豚鼠耳蜗组织结构在照射后不同时间点均出现了不同程度的损害,并随着照射后观察时间的延长,组织结构损害更加严重。耳蜗螺旋神经节细胞(SGC)的损伤表现为:细胞萎缩(细胞浆的减少、细胞核浓缩凝集、缺失或者整个细胞的缺失);照射后第1天出现细胞浆轻微萎缩,细胞核未见萎缩,第4天时部分细胞浆出现明显萎缩,少数细胞核也呈现萎缩现象,第7天、14天萎缩的细胞数量明显增多,第30天时可见细胞萎缩程度加剧,甚至出现整个细胞的缺失,空泡形成。耳蜗螺旋器(Corti器)的表现:对照组Corti器,3排外毛细胞及1排内毛细胞排列整齐。观察放疗组Corti器照射后第1天、第4天、第7天的结构可见:整个Corti形态未见明显塌陷,3排外毛细胞及内毛细胞排列尚整齐。照射后第14天、30天出现明显的Corti器塌陷萎缩,有明显外毛细胞缺失的现象。耳蜗血管纹(SV)的表现:对照组血管纹结构正常,未见充血水肿空泡形成,放疗组第1天、第4天血管纹未见明显病理改变,第7天、第14天可见轻微的水肿,第30天才出现明显的的水肿或较多空泡形成。④基底膜扫描电镜结果:扫描电镜观察可见,对照组耳蜗各回的内毛细胞(inner hair cell,OHC)、外毛细胞静(outer hair cell,OHC)纤毛排列整齐、形态正常,OHC的静纤毛呈V型,IHC静纤毛略呈弓形。放疗组可见不同程度的纤毛排列紊乱、倒伏、融合、残缺甚至缺失,这种变化在第叁排OHC比较明显,并随着照射后时间的延长,以上变化更加突出。照射后第1天毛细胞纤毛无明显倒伏缺失,部分第叁排OHC纤毛排列紊乱、转向,但是第4天第叁排OHC纤毛排列转向紊乱并出现缺失现象,第7天时OHC纤毛出现紊乱融合和缺失,以第叁排OHC明显,IHC纤毛也出现紊乱或缺失。第14天时叁排毛细胞纤毛均出现明显融合和缺失现象。第30天时叁排OHC出现大量的缺失,IHC纤毛排列紊乱,部分缺失。第二部分:①SOD活力和MDA水平的测定:对照组耳蜗SOD活力(41.61±26.49 U/mgprot)较高,照射后第1天(14.08±2.90 U/mgprot)、第4天(11.83±2.74 U/mgprot)、第7天(11.30±2.98 U/mgprot)、第14天(8.70±1.29 U/mgprot)各不同时间点SOD活力与对照组比较,差异有显着性统计学意义(p<0.01),随着照射后时间的延长,SOD活力呈逐渐递减趋势。对照组耳蜗MDA含量(0.24±0.09 nmol/mgprot)较低,其与照射后第1天(0.49±0.10 nmol/mgprot)组比较,差异无统计学意义(p>0.05),照射后第4天(0.66±0.26 nmol/mgprot)、7天(0.88±0.30 nmol/mgprot)、14天(0.84±0.13 nmol/mgprot)组与对照组比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。②Tunel检测结果:光学显微镜下可见Tunel法使凋亡细胞的细胞核呈亮棕黄色为阳性表达,非凋亡细胞核呈淡蓝色。对照组SGC、Corti器、SV均未见凋亡细胞,放疗组Corti器、血管纹未见明显凋亡细胞。SGC对照组未见凋亡细胞数,而放疗组可见明显染成棕黄色的凋亡细胞,对螺旋神经节细胞凋亡比率进行了统计,发现照射后第1天(5.20±1.40 %)与对照组(0.00±00 %)比较差异无统计学意义(p>0.05),放疗后第4天(16.00±1.10 %)、第7天(19.00±4.20 %)、第14天(32.00±8.70 %)与对照组比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。③免疫组织化学染色结果显示:Caspase3、Caspase8、Caspase9在螺旋神经节细胞中的阳性表达为细胞浆的棕黄色颗粒,Caspase3、Caspase8、Caspase9在耳蜗组织中的阳性表达在SGC中明显,在Corti及血管纹中表达不明显。SGC的Caspase 8在照射后第1天(0.12±0.01)、第4天(0.23±0.04)、第7天(0.11±0.01)、14天(0.21±0.03)的平均光密度值与对照组(0.05±0.02)的平均光密度值比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。照射后第1天SGC的Caspase 3平均光密度值(0.10±0.02)与对照组(0.07±0.01)比较差异有统计学意义(p<0.05),照射后第4天(0.11±0.02)、第7天(0.14±0.01)、第14天(0.10±0.01) SGC的Caspase 3平均光密度值与对照组比较差异有显着性统计学意义(p<0.01),照射后第1天SGC的Caspase 9平均光密度值(0.11±0.01)与对照组(0.12±0.01)比较差异无统计学意义(p>0.05),照射后第4天(0.22±0.03)、第7天(0.35±0.02)、第14天(0.29±0.02 )SGC的Caspase 9平均光密度值与对照组比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。④WB检测结果:对照组豚鼠耳蜗中可见少量Caspase3、8、9蛋白的表达,放疗组可见Caspase3的表达上调,其中照射后1天的灰度值(0.59±0.09)与对照组(0.23±0.07)比较差异有统计学意义(p<0.05),照射后第4天(0.58±0.19)、14天(0.54±0.05)与对照组比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。放疗组可见Caspase9的表达上调,其中照射后1天的灰度值(2.06±0.24)与对照组(0.46±0.09)比较差异有统计学意义(p<0.05),照射后第4天(2.05±0.13)、14天(1.94±0.25)与对照组比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。照射后第1天(0.68±0.09)、第4天(0.75±0.19)、第7天(0.95±0.25)的Caspase8灰度值与对照组(0.46±0.09)比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。⑤RT-PCR结果:对照组豚鼠耳蜗中可见少量Fas、Bax、Bcl-2 mRNA的表达,放疗组可见Fas mRNA表达上调,其中照射后第1天(2.13±1.23)与对照组(0.80±0.37)的灰度值比较差异有统计学意义(p<0.05),照射后第4天(2.92±2.06)与对照组比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。照射后第1天(1.90±1.20)、第4天(1.81±1.54)Bax mRNA灰度值与对照组比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。照射后各不同时间Bcl-2 mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。第叁部分:①ABR阈值测定:NAC药物组(第4天组)(26.25±8.53 dBnHL)与单纯放疗组(第4天)(25.00±10.48 dBnHL)的ABR阈值比较差异无统计学意义(p>0.05),NAC药物组(第14天组)(41.25±11.08 dBnHL)与单纯放疗组(第14天)(55.00±5.47 dBnHL)的ABR阈值比较差异有显着性统计学意义(p<0.01),正常组ABR阈值(11.66±2.58 dBnHL)较低,其与单纯放疗组(第4天、14天)ABR阈值比较,差异有显着性统计学意义(p<0.01)。②扫描电镜发现:正常组内外毛细胞排列整齐,外毛细胞纤毛呈V型,内毛细胞纤毛略呈弓形。4天组中单纯放疗组、生理盐水组第叁排外毛细胞纤毛排列紊乱,并出现缺失,而NAC药物组毛细胞纤毛无明显缺失及倒伏。14天组中单纯放疗组和生理盐水组外毛细胞纤毛倒伏变形或缺失,内毛细胞纤毛无明显缺失,部分倒伏,而NAC药物组外毛细胞纤毛无明显缺失,排列稍紊乱,内毛细胞纤毛有部分倒伏。③SOD活力和MDA含量的测定: NAC药物组(第4天)(17.27±3.80 U/mgprot)的SOD活力与单纯放疗组(第4天)(11.84±2.74 U/mgprot)的SOD活力比较差异有统计学意义(p<0.01),NAC药物组(第14天)(10.65±2.95 U/mgprot)的SOD活力与单纯放疗组(第14天)(8.70±1.29 U/mgprot)的SOD活力比较差异有统计学意义(p<0.05),正常组耳蜗SOD活力(41.61±26.49 U/mgprot)较高,其与单纯放疗组(第4天、14天)的SOD活力比较,差异有显着性统计学意义(p<0.01)。NAC药物组(第4天)(0.40±0.20 nmol/mgprot)的MDA水平与单纯放疗组(第4天()0.66±0.26 nmol/mgprot)比较差异有统计学意义(p<0.05),NAC药物组(第14天)(0.33±0.05nmol/mgprot)与单纯放疗组(第14天)(0.84±0.13 nmol/mgprot)比较差异有统计学意义(p<0.01),正常组耳蜗MDA含量(0.24±0.09 nmol/mgprot)较低,其MDA含量与单纯放疗组(第4天、14天)比较,差异有显着性统计学意义(p<0.01)。④免疫组织化学染色:NAC药物组(第4天)(0.12±0.02)与单纯放疗组(第4天)(0.23±0.04)的Caspase8平均光密度值比较差异有显着性统计学意义(p<0.01),NAC药物组(第4天)(0.09±0.01)与单纯放疗组(第4天)(0.11±0.02)的Caspase3平均光密度值比较差异有统计学意义(p<0.05),NAC药物组(第4天)(0.18±0.01)与单纯放疗组(第4天)(0.22±0.03)的Caspase9平均光密度值比较差异有统计学意义(p<0.05)。NAC药物组(第14天)(0.09±0.03)与单纯放疗组(第14天)(0.21±0.03)的Caspase8平均光密度值比较差异有显着性统计学意义(p<0.01),NAC药物组(第14天)(0.08±0.02)与单纯放疗组(第14天)(0.10±0.01)的Caspase3平均光密度值比较差异有显着性统计学意义(p<0.01),NAC药物组(第14天)(0.21±0.02)与单纯放疗组(第14天)(0.29±0.02)的Caspase9平均光密度值比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。生理盐水组(第4天,第14天)与单纯放疗组的Caspase 3、Caspase8、Caspase9平均光密度值比较,差异无统计学意义(第4天,第14天)(p>0.05)。⑤TUNEL染色:正常组的耳蜗螺旋神经节细胞未见明显棕黄色的凋亡细胞,而单纯放疗组和生理盐水组可见较多凋亡细胞,NAC药物组的凋亡细胞数比单纯放疗组和生理盐水组少, NAC药物组(第4天)(6.40±1.80 %)的螺旋神经节细胞凋亡比率与单纯放疗组(第4天)(16.00±1.10 %)的凋亡比率比较差异有显着性统计学意义(p<0.01)。NAC药物组(第14天)(7.80±1.79 %)的螺旋神经节细胞凋亡比率与单纯放疗组(第14天)(32.00±8.70 %)的凋亡比率比较差异有统计学意义(p<0.05)。单纯放疗组(第4天、14天)与生理盐水组(第4天、14天)比较差异无统计学意义。结论:1. 70Gy的~(60)COγ射线照射豚鼠耳颞部后,能引起听力及耳蜗组织结构的损伤,随着照射后时间的延长,其损害更明显,成功建立了~(60)CO照射后耳蜗损伤模型。2. ~(60)COγ射线照射可致豚鼠耳蜗SOD活力下降,MDA水平升高。3. ~(60)COγ射线照射后可引起凋亡基因Fas及Bax mRNA表达上调,凋亡蛋白Caspase3、8、9表达也上调。4.细胞外凋亡途径和线粒体途径均参与了~(60)COγ射线照射所致的耳蜗细胞凋亡。6.乙酰半胱氨酸可提高豚鼠耳蜗抗氧化能力,对~(60)COγ射线照射耳蜗损伤有一定的防护作用。
朱恒涛, 管俐娜, 江红群[5]2016年在《噪声性耳聋病理机制的研究进展》文中指出噪声广泛存在于人类的日常生活和工作环境中,而噪声最主要的危害是损害人类的听觉系统,可造成永久性听觉障碍。噪声性耳聋的分子机制复杂,在治疗上更是多种多样,治疗效果也存在很大差异,本文就近年来噪声性聋在病理机制方面的研究进展进行综述。
胡莹[6]2016年在《泻火化瘀通窍法对耳蜗IRI模型大鼠Caspase-9/6及Bax/Bcl-2影响的实验研究》文中研究说明目的:目前全世界有3.6亿人患有听力障碍,并且有逐年增加的发病趋势。中医则认为“火”、瘀”是突发性耳聋的主要病因,祖国医学在长期的耳聋诊治临床实践中摸索和积累了丰富的经验,运用清肝泻火法与活血化瘀法结合起来而形成泻火化瘀通窍法治疗突发性耳聋在临床治疗中获得很好的疗效,间接证明了泻火化瘀通窍法对耳蜗IRI具有多靶点调控的作用,但是作用机制并不明确。研究证明,听力障碍主要是感音神经性聋,由血液循环障碍引起,尤其为耳蜗缺血再灌注损伤(ischemia and reperfusion injury,IRI)所致。最近的研究表明,耳蜗对内耳血流和氧供应的降低或中断极为敏感,耳蜗内氧自由基生成增多和细胞凋亡等因素,可能会导致耳蜗IRI—内耳结构和功能改变。耳蜗内氧自由基如果生成增多,会引起细胞膜功能的变化、细胞和细胞器功能的损伤。其中氧自由基和脂质过氧化物的降解产物丙二醛(MDA)可干扰蛋白质、糖和核酸的代谢,导致酶的活性下降、核酸的模板功能障碍和组织细胞结构损害;当过氧化物酶不足以清除体内氧自由基时,组织亦出现损伤,因此,氧自由基损伤与机体抗氧化酶活性有关,如过氧化氢酶(CAT)等。综上,CAT、MDA是评价耳蜗IRI的重要指标。研究证明,细胞凋亡是耳蜗IRI的一种主要细胞损伤形式。B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(Bcl-2)是调控细胞增殖与凋亡状态的基因家族。Bcl-2为主要抗凋亡因子,Bax、Bad、Bak、Bid是促细胞凋亡基因,对Bcl-2产生阻抑作用。Bcl-2高表达时,可形成Bcl-2/Bax异源二聚体,能够抑制细胞凋亡。Bax高表达时,可形成Bax/Bax同源二聚体,促进细胞凋亡。若Bcl-2/Bax存在失衡,即凋亡和增殖的失衡可导致细胞凋亡加重。因此,耳蜗IRI与Bcl-2/Bax表达相关。凋亡的发生过程可通过内源性及外源性通路发生,它们都可通过激活Caspases使细胞亚结构降解。所以,Caspase是凋亡现象中的关键蛋白酶。在外源性凋亡通路中,Caspase-8参于诱导Caspase-3激活,启动类Caspase级联反应,然后活化执行类Caspase-6等,通过作用于细胞核,切割片层素蛋白,导致核纤层崩解,继而导致染色体凝集,即裂解特异性底物促进细胞凋亡。内源性凋亡通路中Caspase-9属于凋亡起始蛋白,它们剪切一系列的细胞亚结构最终导致细胞死亡。两条凋亡通路是相互独立又是紧密联系的。所以耳蜗IRI中Caspase-6、9是评价细胞凋亡损伤的重要指标。突发性耳聋属中医“暴聋”范畴,祖国医学在长期的临床实践中摸索中积累了丰富的经验,泻火化瘀通窍法在大量的临床研究获得了良好的疗效。本实验利用大鼠耳蜗iri模型,观察泻火化瘀通窍法对耳蜗的过氧化氢酶(cat)和丙二醛(mda)、细胞凋亡相关蛋白bcl-2/bax、bad、bak、bid及其凋亡调控蛋白caspase-6、9、12蛋白表达的影响,从分子水平探讨泻火化瘀通窍法在内耳iri中对耳蜗的保护作用,阐明依据中医“火”、“瘀”致病理论创立的泻火化瘀通窍法对耳蜗iri的调控机制,为其临床应用和作用机制提供实验依据。材料与方法:动物造模与分组:采用血管阻断法制备大鼠耳蜗缺血再灌注损伤(耳蜗iri)模型。将大鼠分成5组,即空白组、模型组、清肝泻火组、泻火化瘀通窍组、活血化瘀组,每组20只。实验方法:清肝泻火组:造模成功术后12h,予清肝泻火药物1ml/100g,分早晚两次,连续给药7d。泻火化瘀通窍组:造模成功术后12h,予泻火化瘀通窍药物1ml/100g,分早晚两次,连续给药7d。活血化瘀组:造模成功术后12h,1ml/100g,分早晚两次,连续给药7d。实验指标:(1)各组大鼠分别于造模后、用药前和用药后7d检测听觉脑干诱发电位abr阈值;(2)用解剖显微镜对耳蜗基底膜铺片毛细胞进行观察;(3)利用tba法和可见光法检测耳蜗组织mda及cat含量;(4)实时荧光定量pcr方法检测耳蜗组织bcl-2mrna、baxmrna表达;(5)用westernblot蛋白免疫印迹法检测bcl-2/bax、bad、bak、bid蛋白的表达;(6)实时荧光定量pcr方法检测耳蜗组织caspase-6mrna和caspase-9mrna表达;(7)westernblot法检测caspase-6、caspase-9、caspase-12蛋白的表达。统计学处理:数据用spss18.0软件处理,各组计量数据均以均数加减标准差sx)(?表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析;计数资料采用卡方检验。定义p<0.05为差别有显着性意义。结果:1.泻火化瘀通窍组治疗后听觉脑干诱发电位abr阈值显着低于模型组、清肝泻火组和行气活血化瘀组p<0.05。正常组的阈值最低,与其他组相比具有显着性差异p<0.05。2.耳蜗基底膜铺片基底膜外毛细胞显微结构观察显示:正常组基底膜外毛细胞分布呈叁排,排列整齐,分布均匀,无明显缺失;模型组的外毛细胞受损严重,排列严重紊乱,崩解破坏,大片缺损,细胞连接消失,纤毛倒伏严重,外毛细胞结构出现极其严重的破坏、凋亡和坏死;清肝泻火组外毛细胞受损也较严重,排列紊乱,缺损,细胞连接消失,纤毛倒伏严重,外毛细胞结构出现破坏、凋亡以及坏死,活血化瘀组见外毛细胞排列较为整齐,部分变形,出现坏死;泻火化瘀通窍组见外毛细胞排列整齐,散在缺失,轮廓不清。模型组及清肝泻火组外毛细胞损伤较重,细胞出现凋亡,泻火化瘀通窍组及活血化瘀组外毛细胞损伤相对较轻,活血化瘀组损伤相对于泻火化瘀通窍组损伤明显。3.耳蜗iri可使耳蜗组织cat活性降低(p<0.05),泻火化瘀通窍组与活血化瘀组能增加cat活性(p<0.05),且泻火化瘀通窍组促进cat活力作用优于活血化瘀组(p<0.05)。4.耳蜗iri可使耳蜗组织mda活性升高(p<0.05),泻火化瘀通窍组与活血化瘀组能显着抑制mda活性(p<0.05)。5.耳蜗iri可使耳蜗组织bcl-2mrna的表达量降低(p<0.05),泻火化瘀通窍组的bcl-2mrna的表达量明显高于模型及清肝泻火组(p<0.05)。6.耳蜗iri可使耳蜗组织baxmrna的表达量升高(p<0.05),活血化瘀组的baxmrna的表达比模型及清肝泻火组低(p<0.05);泻火化瘀通窍组的baxmrna的表达则显着低于模型组(p<0.05)。7.模型及清肝泻火组bcl-2蛋白的表达显着低于空白组(p<0.05);而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组bcl-2蛋白的表达均明显增加(p<0.05)。8.模型及清肝泻火组bax蛋白的表达显着高于空白组(p<0.05);而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组与模型及清肝泻火组相比,显着抑制bax蛋白蛋白的表达(p<0.05),泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着(p<0.05)。9.耳蜗iri使耳蜗组织caspase-6mrna的表达量升高(p<0.05),泻火化瘀通窍组caspase-6mrna的表达量明显低于模型组(p<0.05)。10.耳蜗iri促进耳蜗组织caspase-9mrna的表达量升高(p<0.05),泻火化瘀通窍组caspase-9mrna的表达量明显低于模型模型及清肝泻火组(p<0.05),泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着(p<0.05)。11.耳蜗iri促进耳蜗组织caspase-12mrna的表达量升高(p<0.05),泻火化瘀通窍组caspase-9mrna的表达量明显低于模型组(p<0.05),泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着(p<0.05)。12.模型组caspase-6蛋白的表达显着高于空白组(p<0.05);而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组与模型及清肝泻火组相比,显着抑制caspase-6蛋白的表达(p<0.05),泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着(p<0.05)。13.模型组Caspase-9蛋白的表达显着高于空白组(P<0.05);与模型及清肝泻组相比,而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组显着降低Caspase-9蛋白的表达(P<0.05)。14.模型组Caspase-12蛋白的表达显着高于空白组(P<0.05);与模型组相比,而泻火化瘀通窍组和活血化瘀组显着降低Caspase-12蛋白的表达(P<0.05),泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着(P<0.05)。15.泻火化瘀通窍和活血化瘀组GRP78蛋白低于模型及清肝泻火组(P<0.05),且泻火化瘀通窍组和活血化瘀组相比,差异显着(P<0.05)。结论:1.血管阻断法可用于建立大鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型,该建模方法操作简单、可靠性高、造模成功率高、对动物的伤害小,模型动物均出现耳蜗缺血再灌注损伤,值得推广应用。2.大鼠耳蜗缺血再灌注损伤可显着提高听阈,模型建立成功后24h时听阈即显着增加(P>0.05),7d后听阈维持无明显变化。3.泻火化瘀通窍法具有缓解耳蜗缺血再灌注损伤、降低大鼠听觉脑干诱发电位和改善大鼠损伤后听力的作用。4.耳蜗IRI使耳蜗组织CAT活性降低,MDA含量升高,是听力受损的主因。5.在耳蜗IRI中,泻火化瘀通窍法显着增加CAT活性、降低MDA活性,从而加强抗脂质过氧化,减少脂质过氧化的作用,即纠正CAT/MDA氧化轴的失衡,改善耳蜗IRI中由膜脂质过氧化反应引发的自由基损伤。6.泻火化瘀通窍法能显着升高耳蜗组织中Bcl-2蛋白的表达、降低Bax蛋白表达,纠正Bcl-2/Bax凋亡轴的失衡,起到抑制细胞凋亡的作用。7.泻火化瘀通窍法能显着降低耳蜗组织中Caspase 6、Caspase 9及Caspase 12蛋白的表达,通过抑制外源凋亡执行蛋白和内源凋亡启动蛋白表达,阻抑细胞凋亡,从而在内耳IRI中发挥对耳蜗的保护作用。综上所述,本研究阐明泻火化瘀通窍法纠正CAT/MDA氧化轴失衡、Bcl-2/Bax凋亡轴的失衡、抑制凋亡相关蛋白Caspase-6、Caspase-9、Caspase 12执行凋亡的活性,通过抗细胞氧化应激和凋亡机制,抗耳蜗缺血再灌注损伤,为临床突发性耳聋的诊治提供理论依据。
王爱平[7]2016年在《泻火化瘀通窍法影响大鼠耳蜗缺血再灌注损伤Caspase-8/3及Fas系统的实验研究》文中研究说明目的:当各级听中枢或听神经、螺旋器的毛细胞发生病变,导致对声音的感受与神经冲动的传导发生障碍,此即为感音神经性耳聋,是耳鼻喉科的临床常见病和多发病,内耳血流障碍是导致其发生的主要因素。越来越多的研究证实,缺血后的再灌注损伤会加重缺血导致内耳血流障碍。缺血再灌注损伤是一个复杂的病理和生理过程,是多个因素和靶点参与的反应。在近些年中医治疗内耳疾病的报道中,活血化瘀类药物最为常用和有效,其次是清肝泻火类药物,本实验中,将活血化瘀与清肝泻火联合用药结合形成泻火化瘀通窍法,以达到增加疗效的目的。本实验旨在探索(1)血管阻断法在大鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型造模中的应用;(2)泻火化瘀通窍法对血管阻断法大鼠耳蜗缺血再灌注损伤的影响;(3)探明泻火化瘀通窍法改善耳蜗缺血再灌注损伤的分子作用机制。材料与方法:动物造模与分组:采用血管阻断法造模,造模成功后,将大鼠分为五组,每组12只,分别为正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组和泻火化瘀通窍组。实验方法:正常组:不给药;模型组:造模成功后,正常饮食不给药。清肝泻火组:造模成功后一天,每天分两次给予清肝泻火药物灌胃,每次2ml,每只大鼠均连续灌胃7天;行气活血化瘀组:造模成功后一天,每天分两次给予行气活血化瘀药物灌胃,每次2ml,含药物2g,每只大鼠均连续灌胃7天;泻火化瘀通窍组:造模成功后一天,每天分两次给予泻火化瘀通窍药物灌胃,每次2ml,共含药物5g,每只大鼠均连续灌胃7天。实验指标:(1)各组大鼠分别与造模后、用药前和用药后7天检测听觉脑干诱发电位ABR阈值;(2)用解剖显微镜对耳蜗基底膜铺片毛细胞进行观察;(3)TUNEL法检测细胞凋亡;(4)制备耳蜗组织匀浆,采用TBA法和可见光法对耳蜗组织的MDA含量和CAT活性进行检测;(5)荧光定量PCR技术检测Caspase-8、Caspase-3的mRNA的表达水平;蛋白免疫印迹(western blot)检测Caspase-8、Caspase-3的蛋白表达;(6)实时荧光定量PCR检测耳蜗组织中Fas、FasL mRNA水平变化;westernblot检测耳蜗组织中fas、fasl蛋白表达水平的变化;(7)梯度pcr检测耳蜗组织中xiap、xaf1mrna水平变化;westernblot检测耳蜗组织中xiap、xaf1蛋白表达水平的变化。统计学处理:采用spss18.0统计软件,计量数据以均数±标准差sx)(±表示,单因素方差分析(one-wayanova),组间比较采用最小显着差法(lsd)方法,以p<0.05和p<0.01作为显着性和极显着性差异的标准。结果:1.泻火化瘀通窍组治疗后听觉脑干诱发电位abr阈值显着低于模型组、清肝泻火组和行气活血化瘀组(p<0.05-0.01)。正常组的阈值最低,与其他组相比具有显着性差异p<0.05。2.耳蜗基底膜铺片基底膜外毛细胞显微结构观察显示:正常组外毛细胞分布呈叁排,可清晰看到外毛细胞分布均匀,排列整齐,无明显缺失;模型组、清肝泻火组见外毛细胞大部分变形,排列严重紊乱,崩解破坏,大片缺损,细胞连接消失,纤毛倒伏严重,外毛细胞结构出现极其严重的破坏,出现坏死和凋亡;行气活血化瘀组见外毛细胞排列较为整齐,部分变形,部分出现坏死;泻火化瘀通窍组见外毛细胞排列整齐,散在缺失,个别轮廓不清。模型组及清肝泻火组外毛细胞损伤较重,细胞出现凋亡和坏死,泻火化瘀通窍组及行气活血化瘀组外毛细胞损伤相对较轻,且行气活血化瘀组损伤相对于泻火化瘀通窍组损伤更为明显。3.正常组阳性细胞荧光基本分布在血管纹区域,基底膜上几乎无表达。模型组与药物干预组的基底膜上的叁排外毛细胞荧光信号明显增多、增强,与正常组相比差异有统计学意义(p<0.01);而与模型组相比,泻火化瘀通窍组和行气活血化瘀组的毛细胞荧光信号明显减少(p<0.01),散在分布在基底膜上,且泻火化瘀通窍组这一表现更加明显(与行气活血化瘀组比较有统计学意义,p<0.05)。而清肝泻火组的毛细胞信号较泻火化瘀通窍组和行气活血化瘀组则明显增强(p<0.01)。4.耳蜗组织中丙二醛(mda)含量与cat活性测定结果显示:模型组和清肝泻火组的mda含量最高,显着高于其他各组(p<0.05),说明模型组和清肝泻火组两组大鼠的耳蜗微循环障碍最严重,泻火化瘀通窍组与清肝泻火组和模型组比较具有显着差异(p<0.05)。正常组的cat活性最高,显着高于其他组(p<0.05);泻火化瘀通窍组的cat活性显着高于行气活血化瘀组,差异具有统计学意义(p<0.05),与清肝泻火组及模型组相比较具有极显着差异(p<0.01)。5.检测正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组耳蜗组织中caspase-8mrna和caspase-3mrna的表达量。结果显示与正常组相比,其余各组caspase-8和caspase-3mrna的表达均明显增高,差异具有统计学意义(p<0.01~0.05),而与模型组、清肝泻火组相比,行气活血化瘀组和泻火化瘀通窍组caspase-8和caspase-3mrna的表达则明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。westernblot检测各组caspase-8、caspase-3蛋白表达,结果与mrna表达结果类似,与正常组相比,其余各组caspase-8和caspase-3蛋白表达均明显增高,差异具有统计学意义(p<0.05),而与模型组、清肝泻火组相比,行气活血化瘀组和泻火化瘀通窍组caspase-8和caspase-3蛋白表达则明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。泻火化瘀通窍组较行气活血化瘀组表达显着降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。6.检测正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组耳蜗组织中fasmrna和faslmrna的表达量,结果显示与正常组相比,模型组及清肝泻火组fas、faslmrna的表达水平显着增高,差异具有统计学意义(p<0.01~0.05),而与模型组与清肝泻火组相比,行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组fas、faslmrna的表达水平显着降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。westernblot检测各组fas、fasl蛋白表达,泻火化瘀通窍组fas、fasl蛋白表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组显着降低,差异具有统计学意义(p<0.01);而行气活血化瘀组fas、fasl蛋白表达水平较清肝泻火组、模型组也又显着降低,差异具有统计学意义(p<0.01);而清肝泻火组、模型组fas、fasl蛋白表达水平比正常组则明显增高,差异具有统计学意义(p<0.01)。泻火化瘀通窍组较行气活血化瘀组表达显着降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。7.检测正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组耳蜗组织中xiap、xaf1mrna的表达。正常组呈现较低表达,与其他各组相比有极显着差异(p<0.01);泻火化瘀通窍组和行气活血化瘀组xiapmrna表达水平较清肝泻火组、模型组明显增高(p<0.01);但是清肝泻火组和模型组两组xiapmrna表达水平没有明显差异(p>0.05)。正常组的xiap蛋白有表达,模型及药物干预各组表达水平与正常组相比明显增高(p<0.01);泻火化瘀通窍组xiap蛋白表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组显着增高(p<0.05,p<0.01);而行气活血化瘀组xiap蛋白表达水平较清肝泻火组、模型组也显着增高(p<0.05);但是清肝泻火组和模型组两组xiap蛋白表达水平没有明显差异(p>0.05)。正常组中xaf1mrna有表达,模型组表达水平与正常组相比明显增高(p<0.01);泻火化瘀通窍组xaf1mrna表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组明显降低(p<0.05,p<0.01),;然而清肝泻火组与模型组两组xaf1mrna表达水平没有明显差异(p>0.05);行气活血化瘀组xaf1mrna表达水平也较正常组明显增高(p<0.01)。正常组的xaf1蛋白有表达,模型及药物干预各组表达水平与正常组相比明显增高(p<0.05);泻火化瘀通窍组xaf1蛋白表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组明显降低(p<0.05,p<0.01);同样的,行气活血化瘀组xaf1蛋白表达水平较清肝泻火组、模型组也由明显降低(p<0.01);然而清肝泻火组与模型组两组xaf1l蛋白表达水平没有明显差异(p>0.05)。结论:1.血管阻断法可用于建立大鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型,该建模方法操作简单、可靠性高、造模成功率高、对动物的伤害小,模型动物均出现耳蜗缺血再灌注损伤,值得推广应用。2.大鼠耳蜗缺血再灌注损伤可显着提高听阈,模型建立成功后24h时听阈即显着增加(p<0.05),7d后听阈维持无明显变化。3.泻火化瘀通窍法具有缓解耳蜗缺血再灌注损伤、降低大鼠听觉脑干诱发电位和改善大鼠损伤后听力的作用。4.泻火化瘀通窍法可有效改善血管阻断法引起的大鼠耳蜗缺血再灌注损伤,降低mda含量,提高cat活力,且优于行气活血化瘀法。5.泻火化瘀通窍法能够明显抑制大鼠耳蜗缺血再灌注损伤耳蜗组织caspase3、caspase8的表达,优于行气活血化瘀法。6.泻火化瘀通窍法可能通过抑制大鼠耳蜗缺血再灌注损伤耳蜗组织caspase3、caspase8的表达抑制毛细胞凋亡。7.fas和fasl基因和蛋白均参与大鼠耳蜗微循环障碍损伤,泻火化瘀通窍法能够明显抑制大鼠耳蜗缺血再灌注损伤耳蜗组织fas和fasl的表达,且优于行气活血化瘀法。8大鼠耳蜗微循环障碍后耳蜗凋亡现象与XIAP及XAF1的表达相关,泻火化瘀通窍法可能通过提高XIAP的表达抑制XAF1的表达来抑制细胞凋亡的发生。9泻火化瘀通窍法抑制细胞凋亡能力高于活血化瘀法。
李婷钰[8]2010年在《Caspase-12介导内质网应激参与卡那霉素诱导耳毒性的研究》文中进行了进一步梳理本研究通过大鼠卡那霉素耳毒性动物模型的建立,于在体和离体培养条件下,采用ABR检测、耳蜗铺片、离体器官培养以及免疫组织化学染色方法,从功能和形态学两方面分别观察了卡那霉素对耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元细胞的毒性作用;应用免疫荧光及Western blot等实验技术检测了卡那霉素干预的耳蜗组织中caspase 12及calpain的表达情况并定量测定其表达规律;同时,观察了应用calpain抑制剂对受损耳蜗组织毒性及caspase 12活性的影响;从分子和蛋白水平阐述了它们在卡那霉素诱导耳毒性中的作用机制;从而得出结博,caspase 12介导的内质网应激是卡那霉素导致药物性耳聋的机制之一,calpain抑制剂对卡那霉素耳毒性具有保护作用。应用calpain抑制剂有望成为治疗卡那霉素耳毒性的有效手段。
汤勇[9]2006年在《神经营养因子受体与顺铂诱导的耳蜗细胞毒性的相关性研究》文中认为本研究通过顺铂耳毒性动物模型的建立,分别观察了顺铂在活体和离体培养中对耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元细胞的毒性作用;应用RT-PCR、免疫组化及Western blot检测TrkB、TrkC、p75及caspase-3在耳蜗的表达情况,从分子和蛋白水平明确在顺铂对耳蜗的毒性作用中它们的动态表达规律;并对caspase-3的表达与听力水平的关系、p75的表达与caspase-3表达之间的关系进行直线回归分析。在国内外首次提出,TrkB、TrkC和p75表达参与顺铂耳毒性耳蜗损伤的病理过程;而且p75参与顺铂中毒性耳聋的螺旋神经节神经元细胞凋亡;在p75介导的顺铂对螺旋神经节神经元的神经毒性作用中,caspase-3参与了下游激活信号。为药物性耳聋的病因学及治疗和预防方面的进一步研究提供理论依据和参照数据。
杨东[10]2013年在《内皮祖细胞与噪音性耳聋耳蜗损伤的关系》文中进行了进一步梳理目的：1、建立噪声导致的内耳损伤的动物模型,在噪声性耳聋的动物模型上观察听功能的变化、内耳毛细胞的损伤情况,建立内耳损伤修复的研究平台。2、观察外周血EPCs的变化和耳蜗血管纹中VEGF、iNOS在噪声暴露后表达变化,阐述噪声性耳聋的耳蜗组织损伤与修复过程中的发病机理。3、通过干预内源性EPCs、探讨对于噪声性耳聋耳蜗损伤的预防和治疗采取的措施。方法：取健康体重约250g-300g成年SD大鼠应用118±1dBSPL白噪声持续暴露4小时建立噪声性耳聋模型,实验分组为：对照组：未进行噪声暴露；噪声暴露即刻组：噪声暴露后即刻检测：噪声暴露1天组：噪声暴露后1天检测;噪声暴露3天组：噪声暴露后3天检测；噪声暴露7天组：噪声暴露后7天检测,；噪声暴露14天组：噪声暴露后14天检测；各组均为10只；将试验分为两部分,一为单纯噪声暴露对耳蜗损伤修复的影响,二为干预内源性EPCs后噪声暴露对耳蜗损伤修复的影响。SD大鼠根据噪声暴露后即刻组、1天组、3天组、7天组和14天组的分组分别检测各组大鼠的ABR听阈改变、通过Fillo密度梯度离心法获得单个核细胞流式细胞仪鉴定SD大鼠外周血中EPCs数量、通过Western印记和耳蜗冰冻切片免疫组化观察耳蜗血管纹VEGF、iNOS和CD34的表达变化,同时对噪声暴露后的耳蜗行扫描电镜观察。应用EPO皮下注射提高内源性EPCs数量、半胱氨酸饲料喂养制备内源性EPCs数量降低的模型和NS皮下注射,分别观察SD大鼠噪声暴露后即刻组、1天组、3天组、7天组、和14天组ABR听阈改变。结果：1、噪声暴露后即刻组ABR阈值为最高,其听阈为86.67±6.85dBSPL,听力损伤最为明显,属于TTS期；噪声暴露后7天和14天ABR阈值部分恢复,阈值降低,属于PTS期,其听阈分别为为56.18±5.29dBSPL和57.92±6.20dBSPL;2、对各组外周血中的EPCs进行测定,观察到EPCs于噪声暴露后1天时最高,数值为91.40±8.13/20万个单核细胞；噪声暴露后14天时EPCs恢复接近正常水平,数值为29.00±14.56/20万个单核细胞；3、免疫组化及Western印记表明噪声暴露后1天VEGF和iNOS出现高峰,噪声暴露后即刻组表达最低,CD34于噪声暴露后3天和7天达到高峰；4、通过干预内源性EPCs,EPCs升高组对于听力的保护作用明显高于EPCs抑制组。4、EPCs在内耳损伤后的修复过程中,有促进血管生成,改善内耳微环境的作用,降低EPCs可以导致听力较为严重的下降,提高内源性EPCs的释放,可以保护耳蜗减轻噪声对耳蜗的损伤加快耳蜗损伤后的恢复。结论：1、噪声性耳聋最终可导致耳蜗损伤,随着时间改变外周血中EPCs的数量也发生改变；2、VEGF、iNOS参与噪声性耳聋损伤与修复的各个阶段,VEGF和EPCs在噪声损伤的耳蜗血管修复的不同阶段均发挥作用；3、EPCs在噪声性耳聋耳蜗损伤与修复过程中起着关键作用。
参考文献：
[1]. 活性氧对耳蜗损伤的分子机制研究[D]. 张欣欣. 军医进修学院. 2001
[2]. NF-κBp65，I-κBα及iNOS在豚鼠椎基底动脉缺血再灌注耳蜗损伤中的作用和葛根素的保护作用研究[D]. 刘斌. 中南大学. 2006
[3]. 盐酸椒苯酮胺对庆大霉素豚鼠耳蜗损伤保护作用及机制[D]. 陈浩. 南方医科大学. 2013
[4]. ~（60）COγ射线照射对豚鼠耳蜗损伤及乙酰半胱氨酸辐射防护的实验研究[D]. 谢利红. 广西医科大学. 2011
[5]. 噪声性耳聋病理机制的研究进展[J]. 朱恒涛, 管俐娜, 江红群. 中华耳科学杂志. 2016
[6]. 泻火化瘀通窍法对耳蜗IRI模型大鼠Caspase-9/6及Bax/Bcl-2影响的实验研究[D]. 胡莹. 辽宁中医药大学. 2016
[7]. 泻火化瘀通窍法影响大鼠耳蜗缺血再灌注损伤Caspase-8/3及Fas系统的实验研究[D]. 王爱平. 辽宁中医药大学. 2016
[8]. Caspase-12介导内质网应激参与卡那霉素诱导耳毒性的研究[D]. 李婷钰. 吉林大学. 2010
[9]. 神经营养因子受体与顺铂诱导的耳蜗细胞毒性的相关性研究[D]. 汤勇. 吉林大学. 2006
[10]. 内皮祖细胞与噪音性耳聋耳蜗损伤的关系[D]. 杨东. 天津医科大学. 2013
标签：眼科与耳鼻咽喉科论文; 细胞毒性论文; 毛细作用论文; 荷兰猪论文; 光密度论文;