（2湖北中医药大学检验学院 湖北 武汉 430065）
【摘要】目的：观察苦参碱(Matrine，MA)体外诱导人结肠癌Caco-2细胞的凋亡作用并探讨其机制。方法：分别采用不同浓度苦参碱作用Caco-2细胞24小时后，MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测苦参碱对Caco-2细胞凋亡和细胞周期的影响，Western blot法检测线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、Bcl-2的表达水平。结果：在2～16mg/mL苦参碱作用下，Caco-2细胞增殖被明显抑制，且呈时间和剂量依赖性(P<0.05或P<0.01)；采用4、8和16mg/mL苦参碱作用Caco-2细胞24h后，细胞凋亡率分别为(14.64～2.45)％、(37.60～2.39)％和(53.10～1.70)％，均明显高于对照(4.36～0.22)％(P<0.05)；经苦参碱作用24h后，细胞Bax蛋白表达增加，而BeL-2表达减少，呈剂量依赖性。MA显著诱导Caco-2细胞凋亡；16mg/ml MA作用Caco-2细胞24小时后，caspase-9，-3酶活性明显升高；Western blot结果显示：MA处理组促凋亡蛋白Bax表达明显升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低。结论：MA具有促进结肠癌细胞凋亡的作用，且具有剂量依赖性，其机制可能与线粒体凋亡途径有关。
【关键词】苦参碱；结肠癌Caco-2细胞；细胞凋亡
【中图分类号】R735.35 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）30-0114-03
结肠癌的发病率以及死亡率是我国恶性肿瘤的第三位，治疗手段主要以手术切除为主，同时联合化疗、放疗来降低复发率，提高生存率。结肠癌的化疗毒副作用大。中药有高效低毒的特点，近年来在肿瘤的后期治疗中起到一定的作用[1]。苦参碱是中药苦参的主要活性成分之一，近年来发现其能够诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖而发挥抗肿瘤作用。本实验主要研究MA对人结肠癌Caco-2细胞的致凋亡作用，探讨其对结肠癌可能的作用机制，为中药在肿瘤治疗方面的应用提供一定的理论依据。
1.材料与方法
1.1 材料与试剂
人结肠癌Caco-2细胞由湖北省肿瘤医院实验中心提供。苦参碱购自Sigma公司，用RPM1640（美国Gibco公司）助溶，终浓度为200mg/ml，0.22滤器除菌，-20℃保存，临用时加培养液稀释至所需浓度；二甲基亚砜（DMSO）﹑噻唑蓝（MTT）为南京凯基公司产品；其他试剂购自广州瑞博公司。
1.2 细胞培养和MTT测定
结肠癌细胞Caco-2常规培养于RPMI 1640培养基（含10%的小牛血清），置37℃、5% CO2孵箱内静置培养 。取对数生长期的细胞，采用0.25%胰酶消化后，将细胞密度调整为l×l05/ml。以每孔200μL接种于微孔板，分别加入苦参碱，终质量浓度分别为2、4、8、16和32mg/ml，每组设3个复孔，分别培养24，36和48小时，对照组仅加等量的培养液。每孔加 MTT（5g/L）20μl，培养4h后，弃去培养基，加150mL的DMSO溶液，轻轻振荡约10min后，酶标仪于490nm波长处 测吸光度（A），根据公式（细胞增殖率=A实验组／A对照组）计算细胞增殖率。
1.3 有丝分裂
有丝分裂评估细胞死亡率，将不同浓度苦参碱的细胞悬液（1×105个细胞）与磷酸盐缓冲盐水（PBS）在4℃下混合，12000转/分离心5分钟。70%乙醇溶液重悬浮，4℃温育过夜。收集上清液细胞，室温下重悬于500μLPI溶液（含有0.2% Triton X-100的PBS，50μg/ml的PI和100μg/ml的RNase A）。30分钟后，采用Cell Quest软件，使用流式细胞术测定有丝分裂状态。
1.4 Annexin V-FITC / PI双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡
以4、8、16mg/ml MA处理人结肠癌Caco-2细胞24h，分别消化收集各组细胞，调整细胞浓度至1×106/ml，4℃ PBS洗涤两次后，弃上清液；加入预冷的结合缓冲液100μl重悬细胞，置冰浴；加入10μl annexin V-FITC和10μl20μg/ml PI于细胞悬液中，轻轻混匀；将试管置于室温避光染色15min；补加400μl结合缓冲液混悬细胞，流式细胞仪进行检测、分析细胞凋亡的百分比。
1.5 Western印迹检测细胞色素c水平
培养细胞经PBS处理，用含有10mM Tris-HCl（pH7.5），10mM NaCl，175mM蔗糖和12.5mM EDTA的缓冲液中超声处理细胞来分离线粒体和细胞质，将细胞提取物以1000×g离心10分钟弃沉淀，转移上清再以18000转/分离心30分钟，所得上清即作胞质部分和对应所得的沉淀即为胞质对应的粗制线粒体部分。通过Bradford方法在两个级分中测量蛋白质含量。通过15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的蛋白质，并电转移至NC膜上。NC膜以封闭液室温孵育3h后，取出放入一抗工作液中孵育，4℃过夜，以TBST洗膜（5min×3次）后，放入AP标记的二抗工作液中孵育，室温2h，再以TBST洗膜（3min×5次），然后水洗，并放入以BBT/BCIP试剂盒新鲜配制AP显色液中显色，流水洗涤终止显色，扫描NC膜上显色条带，并采用Quantity One软件分析。
1.6 蛋白质印迹分析
采用分光光度法检测人结肠癌Caco-2细胞caspase-3，-9酶活性，以4、8、16mg/ml MA，作用细胞24h后收集各组细胞，按caspase-3，-9检测试剂盒说明书操作。酶标仪在λ=405nm测定其光密度（D）值。用D实验组/D对照组的比值表示caspase活化程度。
1.7 Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的表达
将细胞经不同浓度的MA处理24h后，消化并收集细胞，加入细胞裂解液100μl后，经4℃ 12000rpm离心10min。将等量样品（30μg/ml）经12.5% SDS–PAGE胶分离蛋白质并转到硝酸纤维膜上。先加入一抗工作液过夜，再加入二抗工作液。洗膜加ECL化学显影剂，X光片曝光显结果。
1.8 统计学方法
采用用SPSS13.0统计分析软件进行方差分析，统计方法采用方差分析和t检验，P＜0.05被认为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 Matrine 对Caco-2 Cells细胞增殖的抑制作用
2mg/ml苦参碱作用Caco-2 Cells细胞24、36、48小时细胞增殖率分别为9.8%，19%，28%；4 mg/ml时分别为11%，35%，50%；8mg/ml时分别为32%，49%，60%；8 mg/ml时分别为38%，49%，61%，16mg/ml时分别为52%60%，68%；32mg/ml时分别为58%，68%，75%；不同浓度Matrine 对Caco-2 Cells细胞增殖均有不同程度地抑制，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。
2.2 流式细胞仪分析Martine 对细胞周期的影响
如图1所示，随着浓度地增加细胞在G0/G1期明显增加，在G2/M期显著降低，这一结果表明苦参碱阻滞G0/G1期Caco-2细胞，S和G2/M期细胞减少。
图1
2.3 凋亡检测
因本研究使用PI的组织化学分析来分离凋亡的初始阶段与坏死。在用FACScan流式细胞仪测试了不同阶段的细胞比例，包括活细胞死亡或凋亡相。结果如图2所示。活体细胞在左下象限（不含膜联蛋白V-FITC和PI染色）中鉴定。早期的细胞在右下象限（Annexin V-FITC阳性）中发现。晚期凋亡的特征在于膜和核泡沫的存在，并且在该阶段的细胞在右上象限中发现（膜联蛋白V-FITC和PI的双染色）。结果表明随着苦参碱剂量的增加，早期和晚期凋亡增加。晚期凋亡细胞的比例高于早期凋亡细胞的比例。
图2
2.4 细胞色素c释放
细胞凋亡刺激引发线粒体释放细胞色素c进入胞质溶胶。蛋白质印迹分析显示细胞质中的细胞色素c含量增加（图3）。
图3
2.5 Bax和Bcl-2表达水平
Western印迹结果表明，在4至16mg/ml的剂量范围内，Bcl-2表达下调和Bax水平增强，Bcl-2/Bax比例降低（图3）。
2.6 上调caspase-9和-3
胱天蛋白酶是介导凋亡致死阶段的半胱氨酸蛋白酶。苦参碱能够增强其前体活化的半胱天冬酶-9和-3的产生（图4）。
图4
3.讨论
在本研究中，使用结肠癌细胞系在体外建立苦参碱的抗癌作用，如MTT测定所示，采用2～32mg/ml苦参碱时，Caco-2细胞的生长以剂量依赖性方式被阻断。流式细胞术分析显示Caco-2细胞在G0/G1期生长停滞，S期和G2-M期细胞减少。
细胞凋亡不仅介导正常生理，还介导多种疾病的病理生理。凋亡和增殖不平衡导致肿瘤发展和进展[2]。促凋亡特性Bcl-2组蛋白，包括其他成员中的抗凋亡Bcl-2和促凋亡Bax，调节细胞生长和增殖[3]。Bcl-2抑制细胞色素c的分泌，而不破坏外线粒体膜。Bax促进细胞色素c释放。在本研究中，苦参碱治疗下调Bcl-2和上调Bax，从而增加线粒体膜的通透性。免疫印迹显示苦参碱通过调节Bax和Bcl-2的表达水平来干扰体外结肠癌细胞。
胱天蛋白酶介导凋亡的致死阶段。外因和内在信号通路分别由caspases-8和-9诱导。通过线粒体蛋白簇切除Procaspase-8。此外，胱天蛋白酶-3作为关键酶涉及凋亡，已知通过DNA修复分子的切割诱导凋亡，抗凋亡蛋白的降解，细胞外基质的蛋白水解修饰，特异性多肽的骨架表达和其他分子。在本研究中，发现苦参碱处理诱导细胞色素c的线粒体释放，并最终增加caspase-3的活性。半胱天冬酶-3表达为35kDa无活性的前体（procaspase-3），其被激活至17-kDa酶。凋亡的Caco-2细胞在4-16mg/ml的剂量范围内苦参碱后显示增加的活化的半胱天冬酶-3的水平。
本研究的结果表明，苦参碱可以预防体外人结肠癌细胞的进展。苦参碱通过降低Bcl-2/Bax比例诱导结肠癌细胞凋亡，并增加胱天蛋白酶-3和-9的活化。因此，苦参碱可用于人结肠癌辅助治疗。
【参考文献】
[1]张呜号，王秀玉，何沿虹，等．氧化苦参碱对感染性休克大鼠心肌组织细胞因子的影响[J],中草药，2012，43(11):2242-2246．
[2] Zhou N, Li J, Li T: Matrineinduced apoptosis in Hep3B cells via the inhibition of MDM2. Mol Med Rep?15(1):442-450, 2017.
[3] Yu B,Yue DM,Shu LH: Pseudolaric acid B induces ?caspase-dependent cell death in human ovarian cancer cells. Oncol Rep 31(2):849-57,2014.
论文作者:王丹1,肖凌2,江绍伟2
论文发表刊物:《医药前沿》2018年30期
论文发表时间:2018/12/6
标签：细胞论文; 凋亡论文; 苦参碱论文; 线粒体论文; 作用论文; 浓度论文; 蛋白论文; 《医药前沿》2018年30期论文;