【摘要】 目的 探讨他克莫司抑制成纤维细胞增殖预防兔膝关节瘢痕粘连的实验效果.方法:体外培养人膝关节瘢痕来源的成纤维细胞和建立兔膝关节粘连动物模型,实验组给予不同浓度的他克莫司处理,观察他克莫司对成纤维细胞增殖的影响和减少膝关节瘢痕粘连的效果,并行RealtimePCR检测瘢痕组织中TGF－β和IL－４的表达.结果:他克莫司处理人瘢痕成纤维细胞后,发现能够抑制成纤维细胞增殖.局部应用他克莫司处理兔膝关节骨缺损区,发现能够抑制成纤维细胞增殖和减少膝关节术后瘢痕粘连,并降低瘢痕组织中TGF－β和IL－４的表达.结论:他克莫司能够抑制成纤维细胞增殖,并减少兔膝关节术后瘢痕粘连,可能是通过抑制TGF－β和IL－４表达来实现的. 【关键词】 膝关节粘连;成纤维细胞;他克莫司;增殖Theexperimentstudyoftacrolimusoninhibitingfibroblastsproliferationandpreventingintraarticualradhesionofknee 【Abstract】Objective:ToinvestigatetheeffectoftacrolimusoninhibitingfibroblastsproliferationandpreventingexperimentalkneeintraarticularscaradheＧsionofrabbits．Methods:Thehumanfibroblastsfromkneescartissueswerecultivatedinvitroandtheanimalmodelofrabbitkneeadhesionwasestablished．Aftertreatedbydifferentconcentrationoftacrolimus,theeffectsoftacrolimusoninhibitingfibroblastsproliferationandpreventingintraarticularscaradhesionofkneeweredetermined．TheexpressionsofTGF－betaandIL－４inscartissuesweredetectedbyRealtimePCR．Results:TacrolimuscouldinhibithumanscarfibroＧblastsproliferation．Topicalapplicationoftacrolimuscouldinhibitfibroblastproliferation,reduceintraarticularscaradhesionofkneeanddecreasetheexpressionofTGF－betaandIL－４inscartissue．Conclusion:Tacrolimuscaninhibitfibroblastsproliferationandreducethekneeintraarticualrscaradhesionofrabbits,which【Kiseyprwoobradbsly】byinhibitingtheexpressionofTGF－betaandIL－４． Kneeintraarticularadhesion;Fibroblasts;Tacrolimus;Proliferation 【中图分类号】R６２２【文献标识码】A 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０１５５－０２
膝关节瘢痕粘连是膝关节手术或创伤后较常见的并发症之一,可导致关节僵直、疼痛和严重残疾,影响术后的远期疗效[１,２].研究发现其主要与成纤维细胞大量增殖密切有关[３].他克莫司(FK５０６)是一种高效的免疫抑制剂,能抑制T细胞的活化,进而减少促纤维化炎症因子分泌,有效减少瘢痕形成[４,５]. 本研究通过体外培养成纤维细胞和建立兔膝关节术后瘢痕粘连动物模型,探讨他克莫司抑制成纤维细胞增殖、预防膝关节粘连的实验效果.
１ 材料与方法
１．１ 膝关节瘢痕成纤维细胞的培养 无菌条件下取因膝关节瘢痕粘连行松解手术患者的瘢痕组织,按照既往文献对瘢痕组织进行反复冲洗消毒、修剪和消化,制备成单细胞悬液.离心后接种于培养皿中,每２－３d换液一次,随后对成纤维细胞进行传代培养,选用４－５代细胞进行实验研究. １．２ 他克莫司对膝关节瘢痕成纤维细胞的影响 将成纤维细胞接种于培养板后培养２４h,待细胞完全贴壁后,吸弃培养液后以PBS溶液漂洗.分别加入１ml含１０ng/ml(低浓度组)、２０ng/ml(高浓度组)的他克莫司刺激成纤维细胞,其中无他克莫司为对照组,每组设置３个复孔.药物干预后２４小时在光镜下观察他克莫司对成纤维细胞增殖的影响.
１．３ 动物分组与用药处理 １２只新西兰大白兔,体重２．５－３．０Kg,随机分成３组,经耳缘静脉注射麻醉后,无菌条件下取膝关节前正中切口,切开皮肤及皮下筋膜,暴露股骨髁,用高速磨钻打磨股骨内外髁两侧,制成１０mm×１０mm 骨缺损区,直至显露松质骨,彻底止血后,实验组分别使用不同浓度(０．５、１mg/ml)的他克莫司棉片覆盖股骨内外侧髁骨缺损区１０min,对照组使用生理盐水处理,分别缝合切口.
１．４ 他克莫司对膝关节瘢痕粘连的影响 术后４周每组各取２只兔子进行局部解剖,观察膝关节内瘢痕组织生成情况及粘连程度.同时切取膝关节内瘢痕组织,行Real－timePCR检测瘢痕组织中TGF－β和IL－４的表达情况. 剩余动物处死后切取手术段组织(包含瘢痕组织),制备石蜡标本,切片后行HE染色,观察膝关节内粘连程度和成纤维细胞密度.
２ 结果
２．１ 他克莫司对成纤维细胞增殖的影响 使用不同浓度他克莫司刺激成纤维细胞后,发现能够抑制成纤维细胞增殖.随着他克莫司药物浓度的逐渐增加, 成纤维细胞生长受到抑制,细胞数目逐渐减少,密度逐渐降低.
３ 讨论
膝关节内瘢痕粘连是外伤或手术后机体过度反应的结果,主要与成纤维细胞大量增殖和细胞外基质代谢异常有关.成纤维细胞在骨缺损区聚集、增殖,合成胶原组织,形成瘢痕组织,从而导致膝关节内瘢痕粘连.国内外学者进行了大量的研究,采用各种方法来预防膝关节粘连,取得了较好实验和临床效果[６].目前治疗瘢痕的药物种类繁多,主要包括皮质激素类、抗增殖药物、免疫调节类、抗代谢类、生物制剂类、酶类等[７,８].由于使用药物预防瘢痕粘连的同时,各种局部和全身的并发症也相继出现,并可能导致切口愈合等可能, 其应用受到一定的限制. 他克莫司(FK５０６)是临床上常用的一种免疫抑制剂,能通过抑制钙调磷酶的活性,从而抑制T 细胞的活化,减少促纤维化炎症因子表达,如TGF－β和IL－４等[９].一些炎症因子和介质被证明能促进纤维化形成.其中TGF－β 的高表达已经被广大学者证实与瘢痕形成密切相关,而IL－４在纤维化疾病中的表达几乎是TGF－β的２倍.有报道称他克莫司能有效减少兔耳增生性瘢痕的形成,他克莫司治疗组的成纤维细胞数量、TGF－β和Collagen－a的表达均较对照组明显减少,他克莫司治疗兔耳瘢痕面积明显减少[１０]. 我们先前的研究中发现他克莫司能有效预防椎板切除术后硬膜外粘连.针对他克莫司所具有的药理学特点和先前的实验结果,提示他克莫司可能是预防膝关节术后瘢痕粘连的一个治疗手段.本实验通过体外细胞实验和体内动物实验来探讨他克莫司抑制成纤维细胞增殖预防膝关节瘢痕粘连的实验作用和机制. 本研究结果显示FK５０６能够抑制成纤维细胞增殖、减少膝关节术后瘢痕粘连,可能是通过抑制TGF－β和IL－４表达来实现的.不同浓度的他克莫司处理成纤维细胞后,能抑制成纤维细胞增殖,呈现出浓度依赖性.而局部应用他克莫司预防兔膝关节术后瘢痕粘连,大体观察和组织学观察可见膝关节内疏松的瘢痕粘连,提示能减少膝关节术后粘连.同时我们发现他克莫司能够减少瘢痕组织TGF－β和IL－４的表达,呈现浓度依赖性.考虑到TGF－β和IL－４较强的促纤维化作用,这可能是他克莫司抑制成纤维细胞增殖的机制之一.本 实验中大体及组织学观察手术切口愈合良好,无皮肤坏死和切口感染, 未发现实验动物死亡,提示在此浓度范围的他克莫司既能抗瘢痕粘连,又无明显的毒副作用.但作为一种免疫抑制剂,在发挥抗粘连作用的同时,不可避免会对周围组织造成影响.因此,药物的安全性有待进一步研究. 本实验通过体外培养人膝关节瘢痕成纤维细胞和建立兔膝关节粘连动物模型,给予不同浓度他克莫司处理,发现他克莫司能够有效抑制成纤维细胞增殖、减少膝关节术后瘢痕粘连,并能够抑制TGF－β和IL－４表达.本研究可为临床预防膝关节术后瘢痕粘连提供一种新方法,造福于广大患者,同时为其应用于眼科、外科等其他手术后减少并发症提供理论依据. 参考文献[１] 黄淑明,兰树华,郑荣宗,等．股骨远端骨折术后伸直性膝关节僵硬的治疗及影响因素分析[J]．中国骨与关节损伤杂志,２０１３,２８(７):６４４－６４６． [２] HallerJM,HoltDC,McFadden ML,etal．Arthrofibrosisofthekneefollowingafractureofthetibialplateau[J]．BoneJointJ．２０１５,９７－B(１):１０９－１１４． [３] HildebrandKA,ZhangM,BefusAD,etal．A myofibroblast－mastcell－neuropeptideaxisoffibrosisinpost－traumaticjointcontractures:aninvitroanalysisofmechanisticcomponents[J]．JOrthopRes．２０１４Oct;[ ３２(１０):１２９０－１２９６． ４] NaganoJ,IyonagaK,KawamuraK,etal．Useoftacrolimus,apotentantifibroticagent,inbleomycin－inducedlungfibrosis[J]．EurRespirJ．[ ２００６,２７(３):４６０－４６９． ５] LanCC,FangAH,WuPH,etal．TacrolimusabrogatesTGF－β１－inＧducedtypeIcollagenproductioninnormalhumanfibroblaststhroughsuppressingp３８MAPKsignallingpathway:implicationsontreatmentofchronicatopicdermatitislesions[J]．JEur Acad DermatolVenereol．[ ２０１４,２８(２):２０４－２１５． ６] 张琨,胡建华,赵劲民．无痛康复方案的开展对改良伸膝装置粘连松解术后疗效的影响[J]．医学信息．２０１５,２８(６):９８－９９． [７] WangJC,YanLQ,SunY．etal．AComparativeStudyofthePreventiveEffectsof Mitomycin CandChitosanonIntraarticularAdhesionafter[ KneeSurgeryinRabbits[J]．CellBiochemBiophys．２０１２,６２:１０１－１０５． ８] 梁远,颜连启,孙钰,等．羟基喜树碱对兔膝关节粘连中成纤维细胞的影响研究[J]．中华创伤骨科杂志,２０１５,１７(２):１５６－１５９． [９] WallemacqPE,VerbeeckRK．Comparativeclinicalpharmacokineticsoftacrolimusinpaediatricandadultpatients[J]．ClinPharmacokinet．２００１,[ ４０(４):２８３－２９５． １０] 曾海峰,韩晓霞,刘蓓,等．他克莫司抑制兔耳瘢痕增生的作用及其机制研究[J]．中国美容医学,２０１１,２０(１):６８－７０．
论文作者:孙钰 李小磊 颜连启 王静成 赵帅 何俊 戴纪杭
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/2
标签：瘢痕论文; 膝关节论文; 细胞论文; 纤维论文; 术后论文; 抑制论文; 组织论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;