邓敏捷, 伍宁丰, 梁果义, 初晓宇, 姚斌[1]2004年在《一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达》文中指出将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表 明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.
邓敏捷[2]2004年在《来源于Pseudomonas pseudoalcaligenes的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达》文中研究指明有机磷农药作为杀虫剂在国内外广泛使用，为农业丰收做出了很大贡献。但是，有机磷农药对人类健康的危害及其造成的环境污染也是不容忽视的。早在上世纪六七十年代，就有人发现在自然环境中微生物可以降解有机磷农药，这一发现为消除有机磷农约造成的污染提供了更好的途径。微生物之所以能降解农药是因为它们能分泌一种能水解磷酸酯键的酶一有机磷降解酶。 我们从农药厂被污染的土壤中分离到一株高效降解有机磷农药的菌株C2-1，经鉴定为假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)。对其分泌的有机磷降解酶OPHC2进行了分离和纯化以及酶学性质研究。该酶分子量为36 kD，以甲基对硫磷为底物，最适反应温度为65℃，最适反应pH为9，具有很好的热稳定性和pH稳定性，对大多数金属离子和化学试剂不敏感，但SDS能使其完全失活。对有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定，根据得到的氨基酸序列设计合成了简并性引物，通过PCR，得到了有机磷降解酶基因ophc2的部分序列；再根据已知序列设计特异性引物，进行反向PCR，最终从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2。编码基因全长975 bp，(G+C)含量为63％，有一个开放阅读框，编码324个氨基酸，其中前24个氨基酸残基为信号肽序列。编码基因的核苷酸序列分析表明，与目前已发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低，最高的也只有46％，说明这是一个新的有机磷降解酶基因。ophc2已在GenBank中登录，登录号为AJ605330。将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因，分别与载体pET-30a构建重组表达质粒，得到的表达产物具有正常的生物学活性。
张蕊[3]2011年在《天牛肠道细菌来源植酸酶的基因克隆、表达及其性质研究》文中提出植酸酶(Phytase,EC 3.1.3.8或EC 3.1.3.26)是一类能够降解植酸并释放无机磷和肌醇的磷酯酶。近些年,植酸酶作为一种新型的饲料添加剂和无机磷的替代物,在猪、鸡等单胃动物饲养业的应用价值已得到充分体现,而在水产养殖方面,具有应用价值的中性植酸酶亟需开发。昆虫肠道作为一个微生物数量众多且复杂多样的特殊环境,目前几乎没有相关植酸酶的报道。本论文的研究目的旨在从中性的昆虫肠道环境中获得具有新颖性和应用潜力的植酸酶。本研究从云斑天牛肠道环境来源细菌中挑选具有种属差异的20株细菌,利用简并PCR和TAIL-PCR技术,从其中3株细菌中克隆到4个植酸酶编码基因,分别为Pseudomonas sp. TN06来源的phyA06、Serratia sp. TN49来源的phyH49和phyB49、Janthinobacterium sp. TN115来源的phyA115。其中,phyH49为组氨酸酸性磷酸酶(HAP)基因,phyA06、phyB49和phyA115为β-折迭桶状植酸酶(BPP)基因。通过氨基酸序列比对分析,四个基因与已发表的植酸酶序列最高序列一致性为47–64%,叁个BPP基因相互之间的一致性为39–51%,说明这四个昆虫肠道来源的植酸酶基因均具有较高的序列新颖性。通过同源建模分析,叁个BPP植酸酶均具有双结构域,与大多数完成酶学性质分析的单结构域BPP植酸酶不同。Serratia sp. TN49是典型的肠杆菌科细菌,本研究首次从肠杆菌科中克隆得到BPP基因,并首次从单一菌株中克隆到多个植酸酶基因。进一步的系统进化树分析表明phyB49和与植物共生的Pseudomonas spp.来源的双结构域BPP植酸酶的亲缘关系最相近。四个植酸酶编码基因分别重组到pET-22b(+)载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。重组蛋白经Ni-NTA柱纯化达电泳纯后,进行了酶学性质分析。来源于Pseudomonas sp. TN06的PhyA06最适Ca~(2+)浓度是2 mM,最适pH值为7.0,最适温度是55°C,并在30°C保持50%左右的活性。PhyA06具有较好的热稳定性,在65°C处理1 h后,还保留70%以上的相对酶活。PhyA06对胰蛋白酶的降解有抗性,胰蛋白酶处理1 h,酶活保持不变。该酶的性质特点符合水产养殖业对植酸酶的需求,具有潜在的应用价值。来源于Serratia sp. TN49的重组植酸酶PhyH49和PhyB49最适pH值分别为5.0和7.5,最适温度分别为60°C和45°C,在30°C时相对酶活力为30%和60%左右。PhyB49最适Ca~(2+)浓度是1 mM。实验结果表明,同时具有两类植酸酶的Serratia sp. TN49在pH 2.0–9.0范围内都可以有效的利用植酸,增强了对不同生活环境的适应性。另外,从中性肠道微生物中分离得到中性植酸酶,也符合微生物对环境适应性和定向进化的趋势。来源于Janthinobacterium sp. TN115的PhyA115最适Ca~(2+)浓度是1 mM,最适pH值为8.5,最适温度是45°C。PhyA115活性与Ca~(2+)浓度、底物植酸浓度之间有密切的关系。在Ca~(2+)浓度和植酸浓度一致时,PhyA115具有最高的酶活。在植酸浓度极低(0.1 mM)且无Ca~(2+)时,PhyA115有较高酶活性,该现象至今尚未见报道。经结构和功能比较分析发现,不完整的N端结构域虽然没有降解植酸的能力,但可以改变PhyA115最适pH和pH作用范围。PhyA115是中性植酸酶基础理论研究及水产应用的良好材料。本研究首次对天牛肠道这个特殊生态环境中细菌来源的植酸酶进行了初步研究。结果表明该环境主要以双结构域BPP植酸酶为主。这些BPP植酸酶的序列和酶学性质具有较高的新颖性,为今后的基础研究和工业应用提供了良好的实验材料。
张双宇, 孙雯, 许丽, 田健, 初晓宇[4]2012年在《来源于Pseudomonas sp.1-7对硝基酚降解基因簇中的对苯二醌还原酶基因的克隆和功能鉴定》文中研究说明Pseudomonas sp.1-7可以利用对硝基酚(PNP)作为唯一的碳源,氮源和能源生长。为了鉴定菌株1-7代谢PNP的相关基因,本研究构建了菌株1-7基因组的Fosmid文库,并通过文库的筛选克隆得到一段长为12.3 kb的基因簇序列。序列分析显示,该基因簇中共有7个基因(pdcEDGFCBA)与PNP的代谢相关。其中PdcB与来源于Pseudomonas sp.WBC-3中的对苯二醌还原酶(PnpB)有98%的相似性。将pdcB基因在E.coliBL21中过量表达,并通过Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白PdcB。体外的酶活测定表明,PdcB为一个FAD和NADH依赖型的对苯二醌还原酶,能够催化对苯二醌降解并生成对苯二酚。
刘武[5]2019年在《假单胞菌脂肪酶的表达及调控机制研究》文中进行了进一步梳理脂肪酶是一种重要的工业用酶,广泛应用于化学品、食品、药品、洗涤剂、纺织、皮革、新型材料、乳制品、化妆品、造纸、污染处理和生物能源等工业领域中。在这些脂肪酶中,细菌脂肪酶较其它来源的脂肪酶在水相、有机相中催化的反应类型更多、反应活性及稳定性更高,其中又以假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶的性能最为优越。虽然细菌脂肪酶具有诸多优点,但其产量普遍较低,常规育种方法难以满足工业化生产的大量需求,因此市场价格昂贵、供不应求。综合文献分析,可采用两种策略提高细菌脂肪酶的表达,即针对不依赖折迭酶或者较少依赖折迭酶的细菌脂肪酶基因(如:荧光假单胞菌脂肪酶基因),采用异源表达的途径提高脂肪酶的产量;对于对折迭酶有较强依赖性的细菌脂肪酶(如:铜绿假单胞菌脂肪酶),则通过研究其基因表达调控机制来提高脂肪酶的表达量。为此,本论文以假单胞菌属脂肪酶为研究对象,对上述两个方面均做了有益探索,主要研究内容和结果摘要如下:1.在异源表达路径中,本研究以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Pf0-1的预测脂肪酶基因Pflip1为研究对象,分别将其在大肠杆菌和毕赤酵母中异源表达,获得对应的脂肪酶Pflip1a和Pflip1b,确认脂肪酶活性后,对Pflip1a酶学性质进行了系统研究,其最适pH值为8.0,最适底物为C8,最适温度为70°C,考察了多种金属离子、EDTA、表面活性剂和有机溶剂对酶活的影响,发现其对多种金属离子(Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)和Ba~(2+))、EDTA、非离子型表面活性剂(NP-40、Triton X-100、Tween20、Tween 40和Tween 80)和有机溶剂(正己烷、丙酮、丁醇、乙醇、甘油和甲醇)均具有较高的耐受性。进一步将Pflip1a和Pflip1b固定到磁性纳米颗粒上用于催化生物柴油转化研究,反应10 h后,固定化脂肪酶Pflip1a和Pflip1b的生物柴油转化率分别达80.5%和68.5%;经过10批次运行后,两种固定化脂肪酶仍保留了70%-82%的初始酶活力。这些结果表明上述脂肪酶在有机合成领域,尤其是生物柴油制备上,具有较大应用潜力。2.在基因表达调控机制的研究上,本研究选取了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1作为研究对象,对照组和橄榄油诱导组进行了转录组和蛋白组分析,发现了24个与其脂肪酶表达密切相关的基因,经过验证,其中pmrA和PA1397与脂肪酶基因表达相关性最大,随后通过实验研究了这两个基因在脂肪酶表达调控中的具体作用机制,获得如下调控路径:(1)通过lipC、PmrA、rsmY和rsmA的缺失突变,PmrA、rsmY和rsmA的过表达,lacZ融合表达、荧光定量PCR分析、EMSA、相对脂肪酶活力测定等研究,首次证明了PmrA能够直接与rsmY结合,并促进rsmY的表达,RsmY可抑制rsmA的表达,进而通过rsmA抑制lipA的翻译过程。(2)通过lipC、PA1397、rsmZ和rsmA的缺失突变,PA1397、rsmZ和rsmA的过表达,lacZ融合表达、荧光定量PCR分析、EMSA、相对脂肪酶活力测定等研究,首次证明了PA1397能够直接与rsmZ结合,并促进rsmZ的表达,RsmZ可抑制rsmA的表达,进而通过rsmA抑制lipA的翻译过程。上述异源表达和调控机制研究结果为构建高效表达细菌脂肪酶的基因工程菌,特别是假单胞菌属脂肪酶基因工程菌,奠定了坚实理论基础。
包剑锋[6]2017年在《来源于Pseudomonas sp.DS1001的聚己内酯解聚酶的分离纯化和酶学性质研究》文中提出聚己内酯(PCL)是由ε-己内酯聚合而成的高分子聚酯材料,能够在自然界中被微生物分泌的解聚酶完全降解。本实验室在前期研究中筛选了一株对PCL具有高效降解作用的菌株Pseudomonas sp.DS1001,该菌株能够产生多种对PCL具有降解作用的解聚酶。实验室前期已获得一种分子量为28.4kDa的PCL解聚酶I。本研究通过重新对该菌的发酵液进行分离纯化,优化了PCL解聚酶I的纯化流程,并获得了与PCL解聚酶I具有明显差别的PCL解聚酶Ⅱ,对其酶学性质进行了检测,对该酶的基因进行了克隆和序列分析,同时探讨了该酶对PCL的降解过程,为更好地阐述PCL的降解机制奠定了基础,具体研究内容及结果如下。(1)通过离子交换柱层析和分子筛层析纯化得到了PCL解聚酶I和PCL解聚酶Ⅱ,其中,PCL解聚酶I的纯化倍数为5.02,回收率为18.69%,PCL解聚酶Ⅱ的纯化倍数为4.01,回收率为12.93%。对PCL解聚酶Ⅱ的SDS-PAGE检测显示其分子量大小约为32.79kDa。(2)对PCL解聚酶Ⅱ的酶学性质进行了研究,结果显示该酶的最适反应温度为40℃,在20℃-60℃的范围内温度稳定性良好;该酶的最适反应pH为10.0,在pH6.0-12.0的范围内具有较好的稳定性;金属离子对酶活性具有不同程度的影响,在金属离子浓度为1mM时,Zn2+离子能够抑制酶活性,Mg2+、Na+、Ca2+以及Co2+等离子能够不同程度的提高酶活性;EDTA和PMSF对酶活性具有明显的抑制作用;Triton X-100和Tween-80强烈抑制酶活性;该酶对甲醇、乙醇和甘油等有机溶剂的耐受性良好。(3)对PCL解聚酶Ⅱ的底物特异性进行了研究,结果表明该酶对脂肪族聚酯PBS、PHB及叁丁酸甘油酯和不同碳链长度的pNP酯均具有降解活性;但对PLA和苹果皮粗角质无降解活性;分别以叁丁酸甘油酯和pNPC6为底物,能够检测到PCL解聚酶Ⅱ的脂肪酶“界面激活”效应。(4)对PCL解聚酶Ⅱ的基因进行了克隆,并在E.coli BL21中实现了异源表达。利用预测软件对重组酶Pclase Ⅱ的理化性质和结构进行了分析,结果显示,Pclase Ⅱ由317个氨基酸构成,理论分子量为33.1994kDa,理论等电点为6.59;其N端可能含有一个由25个氨基酸残基组成的信号肽序列,30-316位氨基酸具有α/β水解酶家族的保守序列;与其氨基酸序列相似性较高的蛋白多来源于Pseudomonas sp.的脂肪酶;二级结构中,无规则卷曲占53.94%,α-螺旋和β-折迭分别占36.90%和9.14%;以Pseudomonas aeruginosa PAO1的脂肪酶的PAL(1ex9.1.A)为模板进行了叁维模建,推测Pclase Ⅱ叁维结构中存在一个与其“界面激活”效应相关的可移动的α-螺旋“盖子结构”。(5)对PCL解聚酶Ⅱ的降解PCL的机制进行研究,实验结果表明,其对PCL乳化底物的降解终产物为羟基己内酯单体、二聚体、叁聚体和四聚体,在不完全降解阶段,还存在五聚体和六聚体。PCL膜片降解速率呈现先慢后快的趋势;SEM结果显示,随着酶解作用的进行,PCL的非结晶区优先降解,之后为球状结晶区,球晶的降解从中心开始,并逐渐向外周扩展。
邵娜[7]2008年在《来源于Pectobacterium wasabiae和Pedobacter sp.的植酸酶基因克隆、表达及其性质研究》文中研究表明植酸酶(肌醇六磷酸水解酶, EC. 3.2.1.8)是一类能把植酸(肌醇六磷酸)降解为肌醇和无机磷的磷酸水解酶,近些年来作为一种新型的绿色饲料添加剂被广泛研究。在动物饲料中添加植酸酶不但可以提高饲料的营养价值,降低饲料成本,而且可以减少植酸对环境的污染,因此被广泛的应用于饲料和食品工业。本研究的目的是从一些特殊环境分离得到的菌株出发来克隆具有特殊性质的植酸酶基因。本研究利用两步PCR (即简并PCR和热不对称交错PCR (TAIL-PCR))和构建基因组文库的方法,分别从五株菌中克隆到了五个植酸酶基因,包括筛选于雪莲根部土样的菌株Pedobacter sp. MJ11和Flavobacterium sp. MY8,筛选于池塘底泥菌株Pseudomonas sp. 206B,细胞胞外具有强蛋白酶活性的弗氏链霉菌Streptomyces fradiae var. k11 (S221)和植物腐败菌Pectobacterium wasabiae B189中,分别命名为phyMJ11、phyMY8、phy206B、phyS221和phyB189。经过序列分析和结构预测,确定phy206B和phyB189为组氨酸酸性植酸酶(HAP)基因, phyS221、phyMJ11和phyMY8为β-折迭桶植酸酶(BPP)基因。通过序列比对分析,克隆到的植酸酶基因所编码的氨基酸序列与已报道的植酸酶的序列一致性都在40–70%之间,可以初步确定这些基因都是新的植酸酶基因。除Pseudomonas属外,其他四个菌属都是第一次克隆到了植酸酶基因。来源于P. wasabiae B189的植酸酶与来源于Pseudomonas syringae的组氨酸酸性植酸酶PhyM具有最高的一致性(48.5%)。将phyB189在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行了表达,并对重组植酸酶r-PhyB189进行纯化和性质测定。成熟蛋白的分子量为45 kD,最适pH值是5.0,最适温度为50℃,比活为1,072 U·mg~(–1),动力学分析结果表明其Km值为0.17 mM, Vmax为1,714μmol·min~(–1)·mg~(–1)。来源于Pedobacter sp. MJ11的植酸酶与来源于Desulfuromonas acetoxidans的假定β-折迭桶植酸酶蛋白序列具有最高的一致性(63.0%)。将phyMJ11在大肠杆菌中表达,并对重组植酸酶r-PhyMJ11进行了纯化以及性质的测定。其成熟蛋白的分子量为37.3 kD,最适Ca~(2+)浓度为1 mM;最适pH值是7.0,最适温度为45℃,比活为24.35 U·mg~(–1),动力学分析结果表明其Km为1.28 mM, Vmax为71.9μmol·min~(–1)·mg~(–1);在豆粕水解实验中,r-PhyMJ11在20℃中性条件下水解豆粕的能力比其他目前工业上使用的植酸酶更有优势,因此在水产养殖中更具有应用潜力。
沈文静[8]2011年在《Pseudomonas putida DLL-E4对硝基苯酚代谢基因簇的克隆、功能分析和表达调控的研究》文中认为对硝基苯酚(p-Nitrophenol, PNP)是重要的环境污染物,进入环境的PNP会长期残留在深层土壤和地下水中,对动植物和人类的健康造成严重的危害。大量能够降解PNP的微生物已被分离,同时在微生物许多种属中PNP代谢途径已经得到相应的研究,但与PNP降解基因和调控机制相关的报道甚少,特别是在革兰氏阴性菌中。本研究以本实验室分离的PNP降解菌株Pseudomonas putida DLL-E4为材料,通过SEFA PCR扩增偏叁苯酚1,2-双加氧酶基因(pnpC)的侧翼序列,获得12kb的片段。序列分析发现该片段中存在10个参与PNP代谢的ORF,并预测了每个ORF的功能。这10个ORF可以分为叁个部分,第一部分是催化PNP脱硝基形成对苯二酚的相关基因,包括pnpA和pnpB,这一部分是整个PNP降解基因簇的关键部分；第二部分是与对苯二酚开环及催化开环产物进入TCA循环的相关基因,包括pnpC1、pnpC2、pnpD、 pnpE、pnpC、pnpX1和pnpX2;第叁部分是调控PNP降解基因簇表达的基因,只有属于LysR家族的调控基因pnpR。因此我们认为克隆到的片段包含了P. putida DLL-E4代谢PNP的所有必需的功能基因,这些基因在基因组中成簇排列,因此把克隆得到的12kb的片段命名为对硝基苯酚基因簇(pnp基因簇)。与革兰氏阳性菌中双组分脱硝基单加氧酶不同,P. putida DLL-E4中的PNP4-单加氧酶(PnpA)是单组分酶,由基因pnpA编码。我们利用表达载体pET-29a将pnpA在大肠杆菌BL21中进行了表达。通过Ni-NTA亲和层析以及分子筛纯化了PnpA,在此基础上对PnpA6勺酶学特性进行了研究。PnpA催化PNP生成苯醌和亚硝酸根。PnpA的活性依赖于FAD和NADH。 PnpA催化PNP的最佳反应条件为pH8.0,温度20℃。PnpA对PNP的活力是2.57±0.04U·-mg-1, Km值为302μM。过渡金属离子(Cu2+、Ni2+、 Zn2+、Fe2+、Fe3+和Cr3+)对PnpA活性有明显抑制作用,金属螯合剂(EDTA, EGTA,1,10-phenanthrolin)对PnpA活性没有影响,结合文献报道,我们认为PnpA是非金属酶。构建了PnpA的系统发育树,PnpA在进化上和其它黄素单加氧酶相距较远,可能有不同的起源。通过同源重组,敲除了P. putida DLL-E4中pnpA,敲除菌株丧失了降解PNP能力,说明DLL-E4中只存在一个PNP单加氧酶即PnpA。P. putida DLL-E4中对苯二酚双加氧酶复合体是由a亚基(PnpC1)和β亚基(PnpC2)组成的。分别表达PnpCl和PnpC2,纯化后在体外重聚试验中未能获得具有对苯二酚开环活性的酶复合体。通过多顺反子表达载体成功获得了有活性的对苯二酚双加氧酶复合体(PnpC1C2BL21)。PnpC1C2BL21能够催化对苯二酚生成4-羟基粘康酸半醛(4-hydroxymuconic semialdehyde),但对其它酚类化合物没有催化能力。与来源于原始菌株DLL-E4的对苯二酚双加氧酶复合体(PnPC1C2DLL-E4)相比,PnpC1C2BL21存在活性不稳定,瞬间催化的问题。在排除大量因素后,结合PnpC1C2DLL-E4的催化对苯二酚不同的动力学行为和活性特性,我们推测造成该现象的原因是不同宿主表达的对苯二酚双加氧酶复合体在结构上存在差异。P. putida DLL-E4中的PnpC1C2DLL.E4催化对苯二酚的活性存在产物(4-羟基粘康酸半醛)抑制,该抑制能够在高浓度底物条件下被解除,此时催化反应的Vmax不变。因此认为该抑制为竞争性抑制。4-硝基儿茶酚只有在PNP存在的条件下,形成混合底物才能够被DLL-E4代谢。通过酶活分析和突变子降解试验,我们认为P. putida DLL-E4中pnp基因簇不仅参与PNP的代谢,同时也参与菌株降解和利用4-硝基儿茶酚的过程。P. putida DLL-E4中的pnp基因簇混合了菌株代谢不同物质(PNP和4-硝基儿茶酚)的基因,是一个杂合的代谢基因簇。pnp基因簇中的调控基因pnpR敲除突变子DLL-△pnpR丧失了对苯二酚降解能力,但是仍可以降解PNP,并积累对苯二酚。通过RT-PCR证明Pnp(?)(?)是在转录水平上调控pnp基因簇中的对苯二酚代谢相关基因(pnpC1C2DE),对pnp基因簇中的脱硝基相关基因(onpBA)无调控作用,PnpR调控方式为正调控。对PnpR氨基酸进行序列分析,发现PnpR在N端存在DNA结合保守域(HTH),在C端存在诱导物作用保守域。结合PnpR的序列分析信息和在P. putida DLL-E4中的生物学功能,把PnpR归类为LysR家族调控蛋白。pnpA替换为氨基糖苷磷酸转移酶Ⅱ基因(aph2II,卡那霉素抗性基因)的突变菌株DLL-A-aph,必须在PNP诱导条件下才能够在含有10mg/L的卡那霉素的无机盐培养基中生长,说明了pnpA的表达需要PNP的诱导。经RT-PCI(?)验证,该诱导是在转录水平上控制pnpA的表达。RT-PCR结果揭示了DLL-E4不能够单独降解4-硝基儿茶酚的原因是其不能够诱导pnpA的转录。
杨升[9]2016年在《假单胞菌多铜氧化酶CumA和CopA的漆酶活性以及锰离子氧化活性研究》文中研究表明细菌漆酶有着真核漆酶所不具备的优势,如基因序列简单,没有真核生物漆酶基因的外显子——内含子复杂结构,酶蛋白中也没有糖基化修饰等。同时一些细菌漆酶具有广泛的底物特异性、良好的热稳定性以及偏碱的最适pH值范围等。这些都使得细菌漆酶可能是一种有利的生物催化剂,应用于真菌漆酶不适合的地方,弥补了传统漆酶的不足,扩大了漆酶的应用范围。本研究从Pesudomonas sp.593中分别克隆出多铜氧化酶cumA593和copA基因,并将cumA593和copA分别转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达后,目的蛋白通过钴离子琼脂糖凝胶柱纯化,并对纯化好的两种蛋白分别做了漆酶活性的酶学研究。多铜氧化酶CumA593的最适反应pH对于底物DMP(2,6-dimethoxyphenoI)是pH 5.0,SGZ(syringaldazine)是 pH 7.5,ABTS(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid))是pH 5.0。CumA593的最适反应温度对于底物DMP是55℃,SGZ是60℃,ABTS是60℃。CumA593的pH稳定性研究发现,酶蛋白在在偏弱碱性条件下比较稳定,在pH 9.5保存24小时后,其相对酶活仍保留60%左右的活力,而相反的,在pH 3.0保存12小时后,基本检测不到酶活力。CumA593的热稳定性并不是太好,当温度在60℃保存2小时,CumA593相对酶活仅仅剩余10%左右。二价金属离子对CumA593漆酶活力的影响发现Cu~(2+)能极大的促进CumA593酶活力。相反的,Fe~(2+)对CumA593酶活具有明显的抑制作用。对于底物DMP,CumA593的Km为4.38×10-4mol/L,Vmax等于1.187×10-6 mol·L-1·min-1,kcat为 0.056 s-1;对于底物 SGZ,Km为 1.714×10-5 mol/L,Vmax等于 0.705×10-6 mol·L-1·min-1,kcat 为 0.03 s-1;对于底物 ABTS,Km 为 1.06×10-4 mol/L,Vmax 等于 2.807×10-6 mol·L-1·min-1,kcat为 0.393 s-1。多铜氧化酶CopA和CumA593在氨基酸序列上具有21.75%的相同性,二者在蛋白结构和漆酶活性的酶学性质上都不相同。多铜氧化酶CopA的最适反应pH对于底物DMP是pH 7.5,SGZ是pH 7.5,ABTS是pH 3.5。CopA的最适反应温度对于底物DMP是50℃,SGZ是42℃,ABTS是50℃。CopA的pH稳定性研究发现,酶蛋白在中性条件下(pH 7.0)比较稳定。CopA的热稳定并不是太好,当温度在60℃保存0.5小时,CopA相对酶活仅仅剩余40%左右,而继续保存到3小时时,酶活力就基本检测不到了。二价金属离子对CopA漆酶活力的影响发现Cu~(2+)能极大的促进CopA酶活力,不加铜离子或加其它二价金属离子CopA显示出很微弱的漆酶活性。对于底物DMP,CopA的Km为1.41×10-4mol/L,Vmax等于4.54×10-6mol·L-1·min-1,kcat为2.2s-1;;对于底物8GZ,Km为0.25×10-4mol/L,Vmax等于0.7×10-6mol·L-1·min-1,kcat为0.87 3-1;对于底物 ABTS,Km为2.81×10-4mol/L Vmax等于 3.02×10-6mol·L-1·min-1,为 1.8 s-1。同时为了揭示多铜氧化酶CumA本身是否具有锰离子氧化能力,本研究分别从来源于具有锰离子氧化能力的Pesudomonas sp.593和非锰离子氧化能力的Pseudomonas aeruginosa 27853克隆了两种多铜氧化酶基因cumA593和cumA27853,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLyS中进行了表达,相关蛋白进行了纯化。在体外证实了不管来源的宿主菌是否具有锰离子氧化能力,两种多铜氧化酶本身都能够催化氧化二价锰离子,并对二者相关酶动力学做了研究。CumA27853和CumA593虽然在氨基酸序列上仅有81%的相同性,但对于锰离子氧化的最适反应pH都是7.5,也都在30～37℃,酶活力相对较大,加入Cu~(2+)也都能极大的促进酶活力。CumA27853的Km为27.27μmol/L,Vmax等于0.124μmol·L-1·min-1,kcat 为 0.016 s-1;而 CumA593 的 Km 为 42.75 μmol/L,Vax 等于 0.153μmol·L-1·min-1,kcat 为 0.035 s-1。
孙雯[10]2009年在《来源于假单胞菌1-7对硝基酚降解相关基因的克隆和功能鉴定》文中认为4-硝基酚是一类在自然条件中极难降解的芳香族类污染物,严重地抑制生物的生长并威胁人类的健康。然而自然界中存在着一些微生物能够利用这类污染物作为唯一的碳源和氮源来生长,并能将这些污染物完全降解。这些微生物的这一特性使其在污染土壤的生物修复中发挥着重要的作用,因此越来越受到人们的重视,同时针对这些微生物相关代谢途径的研究也成为目前微生物研究中的一个热点。本研究从农药厂废水曝气池中收集活性淤泥作为研究样本,根据已发表的偏苯叁酚1,2-双加氧酶及其相关序列设计简并引物,扩增活性污泥样本中偏苯叁酚1,2-双加氧酶基因部分片段,克隆获得68条目的基因片段。经序列分析发现共含有12种不同的偏苯叁酚1,2-双加氧酶相关的基因序列片段,其中编号T11的片段占所克隆序列总数的比例最高,达55.9%。其与来源于假单胞菌PNP5(Pseudomonas sp. PNP5)的1,2,4-benzenetriol 1,2-dioxygenase氨基酸序列一致性达90%。这些结果表明,该活性污泥中可能含有多种具有降解硝基酚能力的菌。通过富集培养的方法从活性污泥中筛选到了一株既具有甲基对硫磷降解活性又能有效降解4-硝基酚的高效菌株1-7,经16SrDNA初步鉴定该菌为假单胞菌的一种,暂定名为假单胞菌1-7(Pseudomonas sp.1-7)。以假单胞菌1-7的基因组DNA为模版,利用之前设计的简并引物扩增该菌的偏苯叁酚1,2-双加氧酶基因的中间片段,再利用TAIL-PCR克隆得到4-NP降解相关基因簇下游的2个基因:偏苯叁酚1,2-双加氧酶基因dio1和马来酰乙酸还原酶基因mal。通过对偏苯叁酚1,2-双加氧酶基因dio1的序列分析表明,其与之前克隆获得的T11基因片段的序列一致性达到100%。偏苯叁酚1,2-双加氧酶基因dio1全长873bp,编码290个氨基酸,酶蛋白理论分子量为32.8 kD。马来酰乙酸还原酶基因mal全长1068bp,(G+C)含量为65.92%,编码355个氨基酸,成熟蛋白理论分子量37.25kD。dio1和mal均已在GenBank中登录,登录号分别为FJ821776和FJ821777。将偏苯叁酚1,2-双加氧酶基因dio1和马来酰乙酸还原酶基因mal分别克隆入原核表达载体pET-30a,获得重组质粒pET-dio1和pET-mal,转化大肠杆菌BL21进行原核表达。再将表达产物进行纯化和酶活性测定。其中偏苯叁酚1,2-双加氧酶Dio1能够氧化偏苯叁酚产生马来酰乙酸,酶活性测定显示偏苯叁酚吸收峰从289nm向245nm偏移。而马来酰乙酸还原酶Mal将马来酰乙酸还原为酮己二酸(p-ketoadipate)。马来酰乙酸还原酶Mal的纯化效率为58.9%,纯酶的比活达到193.04U/mg,相比粗酶液比活149.64U/mg有所提高。本研究初步探讨了假单胞菌1-7的4-硝基酚降解机制,为阐明硝基酚的降解途径奠定了基础,同时也为由硝基酚引起的环境问题的生物修复研究提供了理论依据。
参考文献：
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[4]. 来源于Pseudomonas sp.1-7对硝基酚降解基因簇中的对苯二醌还原酶基因的克隆和功能鉴定[J]. 张双宇, 孙雯, 许丽, 田健, 初晓宇. 中国农业科技导报. 2012
[5]. 假单胞菌脂肪酶的表达及调控机制研究[D]. 刘武. 华中科技大学. 2019
[6]. 来源于Pseudomonas sp.DS1001的聚己内酯解聚酶的分离纯化和酶学性质研究[D]. 包剑锋. 东北师范大学. 2017
[7]. 来源于Pectobacterium wasabiae和Pedobacter sp.的植酸酶基因克隆、表达及其性质研究[D]. 邵娜. 中国农业科学院. 2008
[8]. Pseudomonas putida DLL-E4对硝基苯酚代谢基因簇的克隆、功能分析和表达调控的研究[D]. 沈文静. 南京农业大学. 2011
[9]. 假单胞菌多铜氧化酶CumA和CopA的漆酶活性以及锰离子氧化活性研究[D]. 杨升. 湖北大学. 2016
[10]. 来源于假单胞菌1-7对硝基酚降解相关基因的克隆和功能鉴定[D]. 孙雯. 中国农业科学院. 2009