湖南省麻阳县市场和质量监督管理局 419400
【摘 要】目的 建立测定天丹通络片中胆酸和猪去氧胆酸含量的HPLC-ELSD法。方法 采用HPLC-ELSD法，色谱柱：Shim-Pack VP-ODS柱，流动相：甲醇-1%冰醋酸溶液（75：25），检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度为80℃，空气流速为2.0mL·min-1。结果 胆酸进样量在2.2516μg～22.516μg范围内线性关系良好，r=0.99959，平均加样回收率为99.30%，RSD为0.77%（n=9）；猪去氧胆酸进样量在2.0338μg～20.338μg范围内线性关系良好，r=0.99994，平均加样回收率为99.21%，RSD为0.64%（n=9）。结论 本法操作简便，重复性好，分析结果准确，为天丹通络片质量标准的完善提供依据。
【关键词】高效液相色谱-蒸发光散射检测器；天丹通络片；胆酸、猪去氧胆酸；含量测定
Abstract：Objective To establish an HPLC-ELSD method for the determination of the Contents of Cholic acid and hyodeoxycholic acid in Tiandantongluo table.Methods The chromatographic separation was performed on a Shim-Pack VP-ODS with ELSD.The mobile phase consisted of methanol - 1% glacial acetic acid（70：30）.The temperature of the drift tube of the light scattering detector was set at 80℃and the flow rate of the gas was at 2.0mL·min-1.Results The linear range of cholalic acid was 2.2516μg～22.516μg with the average recovery of 99.30%（RSD=0.77%，n=9），and that of chlorogenic acid was 2.0338μg～20.338μg with the average recovery of 99.21%（RSD=0.64%，n=9）.Conclusion The mothod is specific，accurate and reproducible，and it can be used for the quality control.
Key words：HPLC-ELSD；Tiandantongluo table；Cholic acid；hyodeoxycholic acid；Content determination
天丹通络片是由川芎、豨签草、丹参、人工牛黄等十味药组成的制剂。具有活血通络，熄风化痰的功效。用于中风中经络，风痰瘀血痹阻脉络证。由于人工牛黄中胆酸、猪去氧胆酸为本方主要的药理活性成分之一，故本试验采用高效液相色谱-蒸发光散射器（HPLC-ELSD）法同时测定天丹通络片中胆酸和猪去氧胆酸的含量，样品不需要特殊处理，具有简便、准确、无干扰的特点。
1 仪器与试药
美国Waters 公司（Waters 2424ELS Detector检测器）；电子天平AUW-220D（日本岛津，d=0.01mg）；移液枪（Dragon laberatory instruments Limited）；CBL9960A超声波清洗器（上海科导超声仪有限公司）；对照品：胆酸（批号：100078-200414，含量：98.0%）、猪去氧胆酸（批号：100087-200610，含量：97.3%）（中国食品药品检定研究院），天丹通络片（某制药股份有限公司，1505321，1503311，1409326，均从药店购买）；甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Shim-Pack VP-ODS柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-1%冰醋酸溶液（75：25），检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度为80℃，空气流速为2.0mL·min-1，流速为1ml·min-1.理论板数按胆酸计不得少于6000，胆酸和猪去氧胆酸的分离度符合要求。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液制备
精密称取胆酸对照品28.72mg与猪去氧胆酸对照品26.13mg，置25mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成胆酸和猪去氧胆酸质量浓度分别为1.1258mg·mL-1和1.0169mg·mL-1的混合对照品溶液①；再精密量取混合对照品溶液①5ml，置50mL量瓶中，加甲醇使稀释至刻度，摇匀，制成胆酸和猪去氧胆酸质量浓度分别为0.1125mg·mL-1和0.1016mg·mL-1的混合对照品溶液②。
2.2.2 供试品溶液制备
取本品10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取0.4g，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇约20mL，超声处理（功率250W，频率40kHz）40 min，放冷，用甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备
按处方比例称取除胆酸、猪去氧胆酸外的其他药味，按制法项下方法制备阴性样品，同供试品溶液制备方法制得溶液，即为阴性对照溶液。
2.3 专属性试验
分别取混合对照品溶液②、阴性对照溶液、供试品溶液进样10μL，结果显示阴性对照溶液色谱中，在与对照品及供试品色谱对应保留时间处无相应色谱峰，表明其他组分对测定胆酸及猪去氧胆酸无干扰，见图1.
2.4 线性关系考察
精密吸取上述对照品混合溶液①2，4，8，10，12，15，20μL分别注入液相色谱仪测定，记录峰面积，以峰面积为纵座标，以进样量为横座标，绘制标准曲线，胆酸回归方程为：Y＝2.7859×105 X – 2.2418×104，r=0.99959，胆酸在2.2516μg～22.516μg范围内呈良好的线性关系；猪去氧胆酸回归方程为：Y＝2.3844×105X ＋7085.8，r=0.99994，猪去氧胆酸在2.0338μg～20.338μg范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
按上述色谱条件，用同一供试品溶液连续进样6次，每次10μL，分别测得各次峰面积。胆酸峰面积的RSD值为0.92%；猪去氧胆酸RSD值为1.01%。
2.6 稳定性试验
取同一对照品溶液在0，5，10，15，20，24h分别进样10μL，结果6次进样胆酸峰面积的RSD为0.91%；猪去氧胆酸峰面积的RSD为1.03%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。
A.对照品（control solution）；b.供试品（sample solution）；c.阴性对照品（blank sample solution）；
1.猪去氧胆酸（hyodeoxycholic acid）；2.胆酸（Cholic acid）；
图1 天丹通络片HPLC色谱图
Fig1 HPLC-ELSD chromatograms of Tiandantongluo table
2.7 重复性试验
取同一批样品，按供试品溶液制备方法，平行制备6份，依法测定，胆酸平均含量为0.3209 mg·片-1，RSD=0.97%；猪去氧胆酸平均含量为0.2768mg·片-1，RSD=1.01%，结果表明该方法的重复性好。
2.8 回收试验
取本品（批号：1505321，含量：胆酸0.3209 mg·片-1；猪去氧胆酸0.2768mg·片-1；平均片重：0.4160g）约0.2g，共9份，置25ml容量瓶中，精密加入质量浓度分别为（0.1125mg·mL-1和0.1016mg·mL-1）的胆酸与猪去氧胆酸的混合对照品溶液②1.0，1.0，1.0，1.5，1.5，1.5，2.0，2.0，2.0mL，加入甲醇适量，超声处理（功率250W，频率40kHz）40min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按2.1项下的色谱条件进行含量测定并计算回收率。结果见表1。
2.9 样品的测定
取3批样品，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取10μL，注入液相色谱仪测定，以外标法计算样品中胆酸、猪去氧胆酸的含量。测定结果见表2。
3 讨论
3.1胆酸类成分在醇类溶剂中具有较高溶解度，因此，供试品溶液的制备考察了乙醇、甲醇两种提取溶剂，结果用甲醇超声提取时胆酸和猪去氧胆酸的提取率高。
3.2胆酸和猪去氧胆酸属于甾体化合物，缺少共轭体系，仅在紫外末端有响应，测定时基线波动较大，ELSD的响应不依赖于样品的光学特性，因此选择ELSD作为检测器。
3.3人工牛黄由胆酸、猪去氧胆酸、胆红素等配制而成，胆酸是人工牛黄的主要成分，是评价人工牛黄品质优劣的依据，故考察胆酸的含量测定方法具有现实意义，也为含人工牛黄的中成药制剂质量标准研究提供了确切的依据。
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论文作者:张爱
论文发表刊物:《航空军医》2016年第9期
论文发表时间:2016/6/22
标签：胆酸论文; 溶液论文; 色谱论文; 含量论文; 甲醇论文; 牛黄论文; 检测器论文; 《航空军医》2016年第9期论文;