王云[1]2002年在《剪切力对脐静脉内皮细胞凋亡的影响》文中认为血管内皮细胞作为血管的最内层，生活在血流环境中，终生受到血流的作用。血流的变化必将引起内皮细胞不同水平的变化。从对动脉粥样硬化的临床及病理研究中，我们已确定动脉粥样硬化好发于血管的分支及弯曲处，该处血流方式不同于血管的其他部位。因此血流动力学环境的改变是造成内皮细胞损伤，引发动脉粥样硬化的原因之一。我们从细胞力学的角度，曾对血管内皮细胞在剪切力作用下的代谢、形态、结构及功能等进行过系统研究，但剪切力与内皮细胞凋亡的相关研究尚属首次，我们希望通过探讨细胞凋亡与剪切力大小及作用时间的关系，为探索剪切力对血管内皮细胞信号转导的影响及作用机理提供有价值的参考数据和实验资料。 我们通过建立HUVEC体外培养模型，以中浓度LPS(50ug／ml)刺激，观察其损伤效应。结果发现，LPS加入细胞培养中可明显诱导HUVEC的凋亡，并随着作用时间的延长，细胞凋亡率也相应增加。 在此基础上，将两种不同大小剪切力与LPS共同作用于细胞，发现高水平剪切力(15dyn／cm~2)可以抑制LPS诱导的凋亡，而低水平剪切力(4dyn／cm~2)的效果则不明显。我们通过已有的相关研究推断，剪切力对LPS诱导凋亡的抑制效应可能是由于剪切力与LPS的信号传导中存在共同的通路，而不是由于剪切力诱导bFGF分泌抑制凋亡的。其对凋亡信号的调节可能发生在ICE基因水平或其上游。 与此同时，由于动脉粥样硬化是一种具有慢性炎症反应特征的病理过程，必定涉及细胞因子的调节作用。由于以往实验结果提示剪切力调节一氧化氮、前列腺素、内皮素、TNFβ及白介素等细胞因子的释放，因此我们在循环开始后，在设定时间点收集循环液200μl，同时设静态对照的培养液200μl，通过放免分析法，检测灌流液中IL-6及IL-8的分泌量。结果显示，当剪切力为4dyn／cm~2时，IL-6在3小时左右达到高峰，8小时后降至基点，之后继续下降。当剪切 摘要力为15dyn儿mz时，IL－6在6小时内缓慢达到高峰，之后以较快速度下降。当时间一定时，剪切力为4dyn八寸时各时间点的浓度值较剪切力为1Myn八m’时高。且两种大小剪切力抑制 LPS诱导的几－6分泌量低于 LPS单独诱导几－6分泌的量。同时我们发现剪切力对IL－8的影响弱与IL－6，高水平剪切力组的分泌高峰比低剪切力组要提前。这个实验结果进一步支持剪切力抑制LPS诱导内皮细胞凋亡的实验。剪切力抑制IL－6的分泌减少了促炎因子对细胞的损伤。且高水平剪切力的抑制能力要高于低水平剪切力，这一点与高水平剪切力抑制凋亡发生的能力强于低水平剪切力相吻合。但细胞因于决不会是剪切力抑制凋亡的主要原因，其调节机理还有待于进一步研究。 以上研究证明剪切力可以在多个水平影响内皮细胞的结构和功能。生理水平的剪切力对内皮细胞的功能是有保护作用的，它可以从转录水平，翻译水平，蛋白质加工与最后分泌出细胞的环节上影响凋亡的发生。
金启辉[2]2018年在《重组人脑钠肽改善糖尿病小鼠下肢缺血病变的作用及机制研究》文中提出背景糖尿病血管病变是糖尿病最常见的慢性并发症之一,也是糖尿病患者致残致死的重要原因。糖尿病血管病变主要发病机制之一是高血糖引起的血管内皮细胞受损。由于糖尿病血管病变广泛而弥漫,且病理机制复杂,使得目前众多的治疗方法都存在一定局限性,因此深入研究糖尿病状态下机体内在生物活性物质改变对血管病变的作用及机制显得更有意义。脑利钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)是由心室肌细胞产生,能介导一系列效应,包括利尿、利钠、扩血管、抑制交感神经系统及肾素-血管紧张素-醛固酮系统的活性、减少心肌细胞凋亡等作用。近来有临床研究发现,BNP与糖代谢相关,也与糖尿病血管病变的发生、下肢血流的改变密切相关。BNP对糖尿病血管病变的作用及高糖环境下对血管内皮细胞的效应及作用机制究竟如何,未见有研究。目的本研究通过建立体外高糖诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)自噬、凋亡模型及体内糖尿病小鼠下肢缺血模型,研究重组人脑钠肽(recombinant human brain natriuretic peptide,rhBNP)通过促进高糖诱导下HUVECs自噬,抑制细胞凋亡的作用,并深入探讨rhBNP的自噬调节作用在糖尿病下肢缺血病变中的效应和机制。方法通过腹腔注射链腺佐菌素(streptozocin,STZ)方法建立糖尿病小鼠模型,采用结扎股动脉构建糖尿病小鼠下肢缺血模型。分为模型组和rhBNP处理组,模型组予每日腹腔注射生理盐水0.3-0.4ml,rhBNP处理组每日腹腔注射rhBNP 0.3-0.4ml(25μg/kg)。定期观察记录下肢坏疽率,术前及术后第0、3、7、14、21天激光多普勒评估下肢血流情况。术后第3天分别处死模型组和处理组各8只糖尿病小鼠,取双下肢腓肠肌,Western blot检测LC3、ERK、AKT、Bcl-2等相关蛋白表达情况。术后第21天,处死模型组10只和处理组10只糖尿病小鼠,取双下肢腓肠肌,采用HE染色、TUNEL试剂盒和CD31、SMA免疫荧光染色观察炎症浸润、组织坏死、细胞凋亡和血管新生情况。western blot检测缺血下肢促血管生长因子HGF、VEGF蛋白表达。在体外,利用高糖诱导HUVECs凋亡模型,分别予rhBNP、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA)、自噬增强剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)干预,观察rhBNP对高糖诱导的HUVECs自噬、凋亡及其相关信号通路的影响。结果实验结果表明rhBNP处理组小鼠HGF、LC3、p-ERK明显高于模型组,断肢、坏疽情况显着少于模型组,激光多普勒检测表明rhBNP处理组下肢缺血改善情况明显好于模型组。TUNEL染色发现内皮细胞凋亡较模型组减少,CD31及SMA染色表明血管新生增加,HGF表达增多,以上结果表明rhBNP改善糖尿病小鼠下肢缺血效果显着。体外高糖诱导HUVECs,细胞增殖被抑制,凋亡增加,LC3-Ⅱ/Ⅰ水平下降、ERK通路活性减弱,HGF的含量显着下降,结果提示高糖诱导后可能通过抑制ERK蛋白表达抑制自噬促进凋亡进而抑制HUVECs的生物学活性。rhBNP干预后细胞活性及增殖能力显着增强,LC3-Ⅱ/Ⅰ升高,Bax、caspase-3凋亡蛋白减少,ERK蛋白表达增加,HGF的含量有升高,提示rhBNP可能通过增强ERK蛋白表达促进自噬进而调节HUVECs的生物学活性。结论高糖抑制HUVECs增殖,抑制自噬,促进凋亡,抑制ERK信号通路。rhBNP具有促进血管生成的潜能,能有效改善糖尿病小鼠下肢缺血病变,其机制可能与激活ERK/LC3信号通路活性,提高自噬,减少凋亡相关。
秦伟栋[3]2013年在《聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在低剪切力诱导的动脉粥样硬化中的作用及机制研究》文中认为研究背景及目的动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性疾病,最先发生于血流动力学紊乱的血管分叉或狭窄的部位。局部血流变化与这种部位特异性密切相关,其中一个重要的因素是剪切力(WSS)。剪切力是血液在血管中流动时对血管内膜产生的一种摩擦力。剪切力的大小与血液流速成正比,比管腔半径成反比。生理剪切力的大小介于0.5-1.2Pa,小于0.5Pa或者大于1.2Pa分别称为低剪切力和高剪切力。剪切力作用于内皮细胞能引起胞内各种信号转导分子的激活,如蛋白激酶C(PKC)、丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)等。此外,低剪切力能够促进促动脉硬化物质在管腔和管壁之间的转运,因此能促进动脉粥样硬化的发生。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)是一种高度保守的DNA结合蛋白。作为一种核酶,PARP-1参与了DNA损伤后的修复。一旦与损伤的DNA结合,PARP-1会被激活并催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)裂解为尼克酰胺和ADP核糖,从而在DNA修复、基因转录、细胞周期、细胞死亡、染色体功能和遗传稳定性中发挥重要的作用。然而,PARP-1过度活化会引起细胞内NAD+和ATP的耗竭,导致细胞能量危机、细胞毒性和细胞死亡。研究证实氧化应激引起的PARP-1过度活化与各种疾病的发生密切相关,如内皮功能障碍、休克、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等。此外,作为核因子κB (NF-κB)的激活物,ⅠPARP-1能够调节各种关键炎症因子的表达,如单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等。在以往研究的基础上,我们提出如下假设：1)低剪切力能引起氧化应激并导致DNA损伤,从而激活PARP-1;2) PARP-1在低剪切力引起的炎症反应中发挥了重要作用。本研究正是基于以上思路,拟应用低剪切力刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以验证这一假说。旨在探讨PARP-1在低剪切力引起的脐静脉内皮细胞炎症反应中的作用和可能的机制,以期寻找到与低剪切力相关的炎症性疾病的预防和治疗靶点。材料与方法1.细胞培养及剪切力模型建立：本实验采用内皮细胞培养基(ECM)培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为研究对象；低剪切力(0.4Pa)刺激以诱导脐静脉内皮细胞发生炎症反应,静态状态下培养的脐静脉内皮细胞作为实验对照。2.细胞内基因蛋白表达的干预：采用PARP-1抑制剂ABT888或瞬时转染PARP-1小干扰RNA片段的方式实现对脐静脉细胞内PARP-1表达的干预；采用SP600125,SB203580和U0126抑制剂来抑制,NK、 P38和ERK的活性。3.实时定量逆转录PCR(Real-time RT-PCR):收集各组细胞,提取RNA,进行逆转录和实时定量PCR,检测各组细胞中iNOS和ICAM-1mRNA的表达水平。4.蛋白印迹(Western blotting):收集各组细胞,提取蛋白,分别检测ICAM-1、iNOS、PARP-1、PAR、 nitrotyrosine、H2A-X、p-H2A-X、c-Jun、p-c-Jun、MAPKAPK-2、 p-MAPKAPK-2、ERK、p-ERK、Sirt1、IκBα口p-p65等蛋白的表达水平。5.细胞免疫荧光：显示细胞超氧阴离子的生成,细胞内的NF-κB P65亚基的表达及转位情况。6.分光光度法：收集各组细胞,使用相应试剂盒以检测细胞内NAD+勺水平和Sirtl的活性。7.彗星实验(comet assay):收集各组细胞,检测细胞DNA损伤程度。8.电泳迁移率检测(EMSA):收集各组细胞,提取各组细胞核蛋白,检测细胞内核转录因子NF-KB的活性。研究结果1.低剪切力诱导脐静脉内皮细胞内iNOS和ICAM-1mRNA和蛋白的表达具有时间依赖性：应用低剪切力(0.4Pa)刺激HUVECs Oh、4h、8h、12h、16h、24h和36h,RT-PCR和蛋白印记结果显示,与正常对照组相比,LSS能够诱导HUVECs细胞内iNOS和ICAM-1的表达。在LSS刺激4h后,iNOS mRNA和蛋白表达开始升高；在LSS刺激12h后,iNOS mRNA和蛋白达到峰值,此时ICAM-1mRNA和蛋白的表达也明显升高。2.LSS刺激增加了脐静脉内皮细胞中PARP-1的蛋白表达和活性：与正常对照组相比,LSS能够显着增加细胞中PARP-1蛋白的表达量,而PARP-1的siRNA可以下调PARP-1的表达；此外,LSS刺激能增加PARP-1的活性,即上调PAR的生成,加入PARP-1抑制齐ABT888或siRNA后,PAR的生成明显减少。3.LSS刺激增加了细胞中超氧阴离子(02-)和3-NT的合成：为了显示细胞内的氧化应激水平,我们检测了细胞内超氧阴离子和硝基酪氨酸的合成。DHE染色和蛋白印记结果显示,与正常对照组相比,LSS刺激下的HUVECs细胞,O2-的合成和3-NT的表达明显增加。4.LSS刺激引起细胞DNA损伤：彗星实验结果显示,低剪切力刺激能显着增加尾部DNA的含量,而静态条件下尾部几乎没有DNA;此外,LSS还能增加细胞中P-H2A-X的表达,说明了LSS刺激能诱导细胞DNA损伤。5.LSS能够通过MEK/ERK通路激活PARP-1:与正常对照组相比,LSS能够活化JNK、p38和ERK通路,增加其磷酸化蛋白的表达。应用SP600125、SB203580、U0126抑制剂能够抑制JNK、p38、ERK的磷酸化,但是只有MEK/ERK抑制剂U0126能够减少PAR的生成。6.抑制PARP-1能够减少炎症因子iNOS和ICAM-1的表达：蛋白印迹结果显示,与正常对照组相比,LSS刺激能够显着增加iNOS和ICAM-1的蛋白表达量；应用ABT888或siRNA抑制PARP-1后,炎症因子的表达明显减少。7.抑制PARP-1通过上调胞内NAD+的水平而上调Sirtl的活性：与正常对照组相比,LSS刺激能够显着减少细胞内NAD+的水平和Sirt1的活性；抑制PARP-1后,细胞内NAD+水平明显升高,伴随Sirt1活性的增加,而其蛋白表达量没有明显变化。8.抑制PARP-1通过抑制NF-KB的核转位和活性而减少炎症因子的表达：免疫荧光结果显示,静息状态下,NF-KB的亚单位p65主要存在于胞浆中,而LSS刺激能够诱导p65亚基的核转位；抑制PARP-1后,LSS诱导的p65亚基核转位受到明显抑制。EMSA结果显示,LSS刺激能够增加NF-KB的转录活性,而抑制PARP-1能够显着降低NF-κB的活性。此外,蛋白印迹结果显示,LSS能减少IkBα的表达,增加p65亚基的磷酸化；而抑制PARP-1能够减少p65亚基的磷酸化,对IkBα勺表达无显著作用。结论及意义1.低剪切力能够诱导人脐静脉内皮细胞的炎症反应；2.低剪切力能够引起细胞内氧化应激和DNA损伤；3.低剪切力可以通过MEK/ERK途径激活PARP-1;4.抑制PARP-1能够减轻LSS诱导的脐静脉内皮细胞炎症反应,这一作用主要通过以下两个机制实现：(1)上调胞内NAD+水平而增加Sirt1的活性；(2)抑制NF-κB的核转位和活性,以及p65亚基的磷酸化。5.在本实验研究中,我们对PARP-1在低剪切力诱导的人脐静脉内皮细胞炎症中的作用及其机制做了系统的阐述,相关结果提示聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1或许是治疗动脉粥样硬化疾病的靶基因。研究背景及目的在西方发达国家,动脉粥样硬化性疾病依然是患病率和死亡率的首要原因。随着我国人民生活水平的提高和饮食结构的改变,动脉粥样硬化(AS)也成为我国人民的主要死亡原因。动脉粥样硬化的发病是多因素的,深入的了解动脉粥样硬化对其早期预防和治疗具有重要的意义。动脉粥样硬化通常被认为是一种系统性疾病,其发病机制与许多经典的危险因素密切相关,如高血压,高血脂,糖尿病和吸烟等。动脉粥样硬化斑块好发于血管弯曲、分叉和分支部位,提示血流动力和血管形态在斑块形成中发挥了重要的作用。许多体内体外实验已经研究了血管中血流的状态并寻找斑块好发部位与血流动力学之间的可能联系。随着研究的不断深入,剪切力在动脉粥样硬化发病中的作用日益受到重视。在平直血管中,血液在各处血管的流速是不一致的。在血管轴心处血液流速最快,越靠近血管壁流速越慢。流动的血液会与血管发生摩擦,这种摩擦会产生一种平行作用于血管内膜的力,称为剪切力(WSS)。剪切力是一种十分重要的血流动力,它能够引起血管活性物质的释放,改变基因的表达、细胞代谢和细胞形态等。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(ⅠPARP-1)是PARP家族中含量最多的一种高度保守的核蛋白。氧化应激引起的DNA损伤能够激活PARP-1。在细胞核中,活化的PARP-1催化裂解NAD+为ADP核糖并将其转移到靶蛋白上。在正常情况下,PARP-1参与了DNA损伤的修复；但是在病理条件下,PARP-1的过度活化会引起细胞内NAD+和ATP的耗竭,导致细胞能量危机和功能障碍甚至死亡。大量研究证实PARP-1的过度激活与各种疾病的发生密切相关,如休克、心衰、缺血再灌注损伤和糖尿病等。在以往研究的基础上,我们提出如下假设：1)在动脉粥样硬化形成的早期,抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够延缓低剪切力诱导的动脉粥样硬化斑块形成；2)抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1减少低剪切力诱导的动脉粥样硬化斑块形成是通过抑制内皮细胞炎症反应来实现的。本研究正是基于以上思路,在小鼠体内设计实验以验证这一假说。旨在探讨PARP-1在动脉粥样硬化斑块形成中的作用,以期为抑制斑块形成、预防心血管急性事件的发生防治寻找新的契机和治疗靶点。研究方法1.实验动物：先将ApoE和PARP-1敲基因小鼠合笼繁殖得到ApoE+/-PARP-1+/-小鼠,然后将ApoE+/-PARP-1+/-杂合子合笼繁殖,应用PCR鉴定其子代基因型,最后得到ApoE+/-PARP-1+/-双基因敲除小鼠。2.动物模型的建立：8周龄雄性ApoE和ApoE/PARP-1敲基因小鼠,采用高脂喂养+右侧颈动脉套管的方法,构建动脉粥样硬化模型；实验动物共分为叁组：对照组,ApoE敲基因小鼠胃饲生理盐水；抑制剂组,ApoE敲基因小鼠胃饲PARP-1抑制剂ABT888;敲基因组,ApoE/PARP-1敲基因小鼠。3.聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的干预：采用基因敲除和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1抑制剂ABT888降低PARP-1基因表达。4.心率和血压：实验结束后,应用无创方法检测各组小鼠的心率和血压。5.血脂参数：实验结束后,收集小鼠血清,检测总胆固醇(TC)、甘油叁脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。6.H&E和油红O染色：收集左侧颈动脉和右侧颈动脉近心端,制备小鼠颈动脉切片,进行H&E和油红O染色,分别显示斑块的大体结构和斑块内脂质含量。7.免疫荧光检测：制备小鼠颈动脉近心端切片,进行免疫荧光染色,检测斑块组织内炎性因子ICAM-1的表达情况。8.蛋白印迹：收集颈动脉近心端,提取蛋白,用于检测组织内聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的蛋白及其活性、炎性因子ICAM-1的表达量。9.DHE染色：收集小鼠颈动脉,制备颈动脉切片,用于检测斑块内超氧化物阴离子的生成量。研究结果1.各组小鼠的一般情况：实验结束后,检测各组小鼠心率、血压和血脂水平,结果显示各组小鼠心率血压、血清TC.TG.LDL-C和HDL-C的浓度水平无显着统计学差异。这些结果提示PARP-1基因干预抑制动脉粥样硬化斑块形成与血脂之间没有直接关系。2.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够减少低剪切力诱导的颈动脉斑块形成：实验结束后,我们应用H&E和油红O染色检测各组小鼠颈动脉斑块及脂质的形成情况。与正常对照组的生理剪切力(左侧颈动脉)相比,低剪切力(右侧近心端)明显促进了动脉粥样硬化斑块和脂质的生成(p＜0.05,VS生理剪切力)。与对照组低剪切力相比,(?)PARP一1抑制或敲除明显抑制了实验组套管侧近心端斑块的形成和脂质的含量(p<0.05,VS.对照组低剪切力)。3.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够抑制低剪切力诱导的炎症反应：实验结束后,我们检测小鼠颈动脉炎症因子ICAM-1的表达情况。免疫荧光结果显示,与生理剪切力(对照组左侧颈动脉)相比,低剪切力(对照组套管近心端)能够明显促进ICAM-1的表达(p＜0.05,VS生理剪切力)；而在各实验组中,(?)PARP-1抑制或敲除能够明显抑制低剪切力诱导的ICAM-1表达(p<0.05,VS.对照组低剪切力)。蛋白印迹显示了类似的结果,且基因敲除引起的效果较抑制剂明显。这些结果说明抑制PARP-1减少低剪切力诱导的斑块形成是通过抑制内皮细胞炎症反应来实现的。4.低剪切力能够增加聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表达和活性：实验结束后,我们检测了小鼠颈动脉中PARP-1和PAR的表达情况。蛋白印迹结果显示,与生理剪切力(对照组左侧颈动脉)相比较,低剪切力(对照组套管近心端)能够明显增加ⅠPARP-1和PAR的表达量(p<0.05,VS.对照组生理剪切力)。在实验组套管侧近心端,抑制剂组小鼠PARP-1的表达无明显变化,而PAR的表达明显下降；双基因敲除组小鼠体内没有PARP-1和PAR的表达(p<0.05,VS.对照组低剪切力)。5.低剪切力能够增加氧化应激反应：实验结束后,我们应用DHE染色显示组织中超氧阴离子的形成状况。DHE染色结果显示,与生理剪切力(对照组左侧)相比,低剪切力(对照组套管近心端)能够明显增加组织超氧阴离子的生成,且PARP-1基因敲除或抑制对此没有明显影响。结论及意义1.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够减轻低剪切力诱导的动脉粥样硬化斑块形成；2.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够减轻低剪切力诱导的内皮炎症反应；3.低剪切力能够增加聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表达和活性；4.低剪切力能够增加氧化应激；5.该研究为进一步阐明PARP-1在AS斑块形成中的作用和机理,从而为相关的心血管急性事件的防治提供新的思路及有效的治疗靶点。研究背景及目的糖尿病(DM)是一种代谢综合征,以机体相对或绝对胰岛素不足或胰岛素抵抗而出现高血糖为特征。据统计目前全球约有1亿8千万糖尿病患者,预计到2025年这一数字将增加到3亿。随着人民生活水平的改善和饮食结构的变化,我国糖尿病的患病率也达到了相当高的水平,大约是9.7%。由冠状动脉病变和高血压引起的心血管疾病(CAD)是糖尿病患者死亡的首要病因。然而,科学研究发现在冠心病和高血压等危险因素不存在的情况下,糖尿病患者也出现了心衰症状,临床上将导致上述现象出现的疾病称为糖尿病心肌病(DCM)。作为糖尿病的早期并发症,糖尿病心肌病能够导致心肌收缩和舒张功能异常。尽管糖尿病心肌病的发病机制仍然不明确,但是氧化应激在其中发挥了重要的作用。高血糖引起的氧化应激诱导微血管病变的发生,导致心肌细胞死亡、肥大、纤维化和功能障碍。此外,氧化应激引起DNA链的断裂并激活了聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)。PARP-1是PARP家族中研究最为广泛的一种核酶。PARP-1具有3个功能结构域：DNA结合结构域、自我修饰结构域和催化结构域。正常情况下,PARP-1参与了机体DNA损伤的修复和遗传物质的稳定。然而,当PARP-1被过度激活时,它会快速消耗胞内NAD以便将聚ADP核糖转移到靶蛋白上。为了重新合成NAD,细胞会过度消耗ATP,从而导致能量耗竭和细胞死亡。抑制PARP-1可以减少细胞能量消耗而减少细胞死亡。此外,最近研究显示抑制PARP-1还能够诱导Akt磷酸化,激活抗凋亡信号转导通路。在心脏中,胰岛素样因子1(IGF-1)可以通过诱导胰岛素样因子1受体的磷酸化保护心脏功能,而后者的磷酸化能够激活PI3K/Akt信号通路。在以往研究的基础上,我们提出如下假设：1)抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够减少高糖诱导的心肌细胞凋亡；2)抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1减少凋亡的作用是通过激活IGF-1R/Akt信号通路来实现的。本研究正是基于以上思路,我们设计了体外实验以验证这一假说。旨在探讨聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在糖尿病心肌细胞凋亡中的作用和可能机制,以期寻找到糖尿病心肌病新的预防和治疗靶点。材料与方法1.细胞培养及模型建立：应用DMEM培养大鼠H9c2心肌细胞,以低糖(5.5mM)和高糖(33mM)分别刺激细胞。2.基因和蛋白表达的干预：体外采用瞬时转染PARP-1siRNA的方式抑制PARP-1的基因表达；分别应用IGF-1和PPP以促进或抑制IGF-1R的磷酸化水平。3.激光共聚焦显微镜：分别检测大鼠心肌细胞内超氧阴离子(O2-)和活性氧簇(ROS)的含量。4.流式细胞术：检测各刺激组心肌细胞的凋亡水平。5.实时定量逆转录PCR (Real-time RT-PCR):检测大鼠心肌细胞中PARP-1的基因表达水平。6.蛋白印迹(western blotting analysis):分别检测大鼠心肌细胞中PARP-1蛋白,IGF-1R和Akt蛋白的磷酸化水平。研究结果1.高糖诱导大鼠心肌细胞的氧化应激具有时间依赖性：应用高糖DMEM (33mM)分别刺激大鼠心肌细胞24h、36h(?)48h,应用DHE和DCF进行细胞染色,激光共聚焦显微镜拍片检测细胞中超氧阴离子和ROS的生成水平。结果显示,应用高糖刺激24h后,心肌细胞中的氧化应激水平与正常对照组(5.5mM)相当；应用高糖刺激36h,与正常对照组相比,超氧阴离子和ROS的生成分别增加了将近1倍和3倍(p＜0.05,VS. control);应用高糖刺激48h后,超氧阴离子和ROS的生成分别增加了将近3倍和4倍(p＜0.01,VS.control)。2.高糖刺激增加了心肌细胞内PARP-1的表达和活性：分别应用高糖刺激心肌细胞24h.36h口48h后,检测细胞中PARP-1的表达与活性水平RT-PCR结果显示,与正常对照相比,高糖刺激24h后PARP-1基因表达无明显变化,高糖刺激36h和48h能够明显增加心肌细胞中PARP-1的基因表达量。蛋白印迹结果显示,高糖刺激24h后PARP-1和PAR蛋白表达无明显变化,高糖刺激36h和48h明显增加了PARP-1和PAR蛋白的表达量,且呈现时间依赖性。这些结果显示高糖能够增加PARP-1的表达和活性。3.PARP-1siRNA减少了PARP-1基因和蛋白的表达量：实验中我们应用了PARP-1的siRNA来抑制PARP-1的表达,并用RT-PCR和蛋白印迹的实验方法检测了干扰效率。RT-PCR结果显示与正常对照相比,PARP-1siRNA明显减少了PARP-1基因的表达；蛋白印迹结果显示应用PARP-1siRNA使PARP-1蛋白表达量减少到正常对照的一半。PARP-1siRNA的阴性对照对其基因和蛋白表达没有明显影响。这些结果显示PARP-1siRNA能有效抑制PARP-1的表达。4.抑制PARP-1减少了高糖诱导的胞内NAD+消耗：一旦被DNA损伤激活,PARP-1就会以胞内NAD+为底物进行聚ADP核糖化反应。我们应用NAD检测试剂盒测定各组细胞NAD+的水平。分光光度结果显示与正常对照组相比,高糖能够明显降低胞内NAD+的含量；而抑制PARP-1能够减少高糖诱导的NAD+消耗。这些结果说明PARP一1参与了高糖诱导的胞内NAD+消耗。5.抑制PARP-1减少了高糖诱导的心肌细胞凋亡：随后我们应用流式细胞术检测了各种心肌细胞的凋亡状况。结果显示与正常对照相比,高糖能够增加细胞的凋亡水平；应用IGF-1能够减少高糖诱导的细胞凋亡,而PPP却能够增加高糖引起的细胞凋亡；抑制PARP-1后,高糖诱导的心肌细胞凋亡水平明显减少。这些结果显示,与IGF-1一样,抑制PARP-1也能够减少心肌细胞凋亡。6.抑制PARP-1增加了Akt磷酸化水平：在接下来的实验中,我们研究了抑制PARP-1减少细胞凋亡的可能机制。考虑到Akt在抗凋亡中的重要作用,我们检测了细胞中Akt的表达。蛋白印迹结果显示,各组细胞总Akt的表达没有明显变化；但是与高糖刺激组相比,应用IGF-1和PARP-1siRNA能够增加Akt的磷酸化水平；应用PPP却减少了磷酸化Akt的表达。这些结果显示Akt参与了抗凋亡机制。7.抑制PARP-1增加了IGF-1R的磷酸化水平：随后我们检测了IGF-1R的表达量。蛋白印迹结果显示,各组细胞总的IGF-1R表达没有明显变化；但是与高糖刺激组相比,应用PPP减少了磷酸化IGF-1R的表达,应用IGF-1和PARP-1siRNA却能够增加IGF-1R的磷酸化水平。这些结果显示抑制PARP-1减少凋亡是通过激活IGF-1R/Akt细胞通路来实验的。结论及意义1.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能够减少高糖诱导的心肌细胞凋亡；2.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1减少凋亡的作用是通过激活IGF-1R/Akt通路实现的；3.通过对高糖诱导的大鼠心肌细胞凋亡的研究,我们发现聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1或许是未来治疗糖尿病心肌病的新靶点。
乔元华, 王云, 曾衍钧, 颜光涛, 胡金麟[4]2005年在《剪切力对脐静脉内皮细胞凋亡的影响》文中研究表明内皮细胞的炎症反应和凋亡是动脉粥样硬化过程中的关键环节 ,因此通过建立HUVEC(人脐静脉内皮细胞 )体外培养模型 ,以LPS(脂多糖 )刺激 ,观察其损伤效应。并在此基础上施加两种大小剪切力 ,以探讨流体动力学对血管内皮细胞凋亡的影响。同时 ,观察此过程中IL 6及IL 8的变化。结果显示 ,LPS加入细胞培养中可明显诱导HUVEC的凋亡 ,并随着作用时间的延长 ,细胞凋亡率也相应增加。在此基础上 ,将两种大小剪切力与LPS共同作用于细胞 ,发现剪切力 (15dyn/cm2 )可以抑制LPS诱导凋亡 ,而剪切力 (4dyn/cm2 )效果则不明显。同时 ,剪切力与LPS这两种均能单独诱导IL 6及IL 8分泌的刺激因素并不能协同作用 ,剪切力会抑制LPS诱导的IL 6分泌。且剪切力 (15dyn/cm2 )比剪切力 (4dyn/cm2 )时的抑制作用要强。
曹雪飞, 董国, 杨树森[5]2016年在《剪切力对血管内皮功能影响及机制研究进展》文中认为动脉粥样硬化好发于动脉分叉外侧壁和弯曲内侧壁,与流体力学密切相关,其中剪切力对动脉粥样硬化斑块的定位起决定性作用。血管内皮是血流和血管壁之间的重要介质,在剪切力作用下将机械刺激转化成细胞内信号,以影响细胞功能和基因表达。本文就剪切力作用下内皮细胞功能改变及分子生物学机制的研究进展作一综述。
孙国举[6]2006年在《非诺贝特对LPC诱导的血管内皮细胞增生和凋亡的影响及机制探讨》文中指出非诺贝特对LPC诱导的血管内皮细胞增生和凋亡的影响及机制探讨 研究背景 血管内皮细胞为衬覆于血管内腔面的单层扁平细胞，依靠其正常的增殖和凋亡平衡，保证血管的结构和功能正常。近年研究表明，越来越多的心血管疾病的发生发展与内皮细胞增殖及凋亡失衡有关。动脉粥样硬化性疾病是危害人类健康的一大类疾病，内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)形成的始动环节。研究显示：氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)作用于内皮细胞膜，引起一系列过氧化链式反应并产生大量的脂质过氧化物。这些脂质过氧化物不仅直接损伤细胞的DNA，还诱导内皮细胞凋亡。ox-LDL是内皮细胞损伤的关键因素之一，而溶血卵磷脂(LPC)是ox-LDL的主要活性成分，因此，本课题以培养的人脐静脉内皮细胞为实验对象，观察LPC对细胞增殖和凋亡的影响及非诺贝特的干预作用。 血管内皮细胞不仅是血液和组织之间的屏障，还是一个十分活跃的代谢及内分泌器官，合成并分泌多种活性物质，在机体自身防病中发挥重要的调节作用。一氧化氮(nitric oxide，NO)是内皮细胞合成的一个重要舒血管活性物质，能保持血管依赖性舒张活动，调节组织血流灌注，预防血管痉挛，抑制血管平滑肌细胞增殖，防止内膜异常增生等。而内皮型一氧化氮合酶(eNOS)是内皮细胞合成NO的关键酶，因此eNOS是研究NO合成和作用的一个主要环节。 细胞凋亡(apoptosis)是基因调控下的细胞自我消亡过程。细胞凋亡对心血管系统的许多疾病具有重要意义，但现在对于调控细胞凋
戈程[7]2014年在《剪切力调节血管内皮细胞PDCD4表达的机制及内皮细胞增殖和凋亡的变化》文中指出研究背景动脉粥样硬化斑块多发生在大血管的分叉和弯曲处等涡流及病理震荡剪切力作用区域,而在大血管直行区域,平稳血流对血管壁产生单向的、大小高于震荡剪切力的生理脉冲剪切力。血管内皮细胞是在血管对剪切力的应答过程中起最重要作用的细胞。大量研究表明,紊乱的血流会通过增强内皮细胞的氧化应激反应和炎症反应、促进细胞周期进程和细胞增殖等促进动脉粥样硬化斑块的发生发展,而脉冲剪切力则使内皮细胞保持较低的增殖水平、较低的氧化应激反应和炎症反应水平,维持其相对稳定的状态,抑制动脉粥样硬化斑块的发生发展。程序性细胞死亡4(Programmed Cell Death4, PDCD4)主要通过抑制肿瘤蛋白的翻译过程起到抑制肿瘤发生发展的作用。PDCD4蛋白可直接与靶基因(MYB/c-MYB)的mRNA编码区域结合或通过与真核细胞翻译起始因子(Eukaryotic Translation Initiation Factor, eIF)4G竞争性结合eIF4A抑制靶蛋白的翻译起始过程。通过该机制,PDCD4可以影响多种蛋白的表达,从而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、转化、侵袭以及自噬等生物学行为。PDCD4抑制肿瘤发生发展的具体作用及机制因肿瘤和细胞种类的不同而有所差异。近期研究发现,PDCD4还影响心血管系统各类细胞的生物学功能。但是,在血管内皮细胞稳态的维持中PDCD4发挥怎样的作用尚无研究报道。在对PDCD4和载脂蛋白E (Apolipoprotein E, ApoE)双基因敲除小鼠(PDCD4-/-ApoE-/-)的研究中发现,PDCD4基因的敲除可明显减少血管壁的动脉粥样硬化斑块,说明PDCD4有促进动脉粥样硬化发生发展的作用,具体机制尚不明确。研究目的(1)体内、外实验明确不同剪切力对血管内皮细胞PDCD4表达的影响；(2)明确PDCD4对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响；(3)明确PDCD4在不同剪切力引起的血管内皮细胞增殖和凋亡中的作用.研究方法1.小鼠主动脉的en face免疫荧光染色C57BL/6、鼠经腹腔注射深度麻醉后,灌注,固定,分离主动脉弓及胸腹主动脉,去除周围结缔组织,纵向剖开主动脉弓,封闭后,两种一抗共同孵育4℃过夜,不同荧光标记的两种相应二抗共同37℃避光孵育,封片,共聚焦显微镜下观察。2.人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的提取和培养无菌条件下获取剖宫产新生儿脐带,用胰酶消化法获取HUVECs,用20%M199培养基(20%胎牛血清+400μl/ml贝复济+青-链霉素)于37℃、5%CO2培养箱中培养,一代之后换10%M199培养基(10%胎牛血清+400μl/ml贝复济+青-链霉素)培养。3.体外剪切力干预体外培养的4-8代HUVECs用于实验。将HUVECs接种至铺有Ⅰ型鼠尾胶原的培养载片上,经完全培养基培养24小时后,继续静止培养或给予0、1、3、6、9、12小时的脉冲或震荡剪切力刺激,观察剪切力对HUVECs中PDCD4表达以及细胞功能的影响,不同剪切力描述如下：(1)脉冲剪切力：12dyne/cm2大小,频率为1Hz；(2)震荡剪切力：0±4dyne/cm2大小,频率为1Hz。4.蛋白质印迹(Western Blotting,WB)提取细胞蛋白,煮沸,经SDS-PAGE电泳,湿转法转膜,封闭,一抗4℃C孵育过夜,相对应的二抗孵育,化学发光法发光后,分析蛋白条带灰度值。5.免疫荧光染色给予培养载片上培养的HUVECs以12小时的脉冲剪切力、12小时的震荡剪切力或静止培养作对照,经固定、打孔、封闭、一抗4℃孵育过夜、荧光标记二抗37℃避光孵育、染核、封片后,共聚焦显微镜下观察不同组内皮细胞PDCD4的表达差异。6.细胞转染p-EGFP-C1-PDCD4和p-EGFP-C1-Mock质粒来自纽约大学Olubunmi Afonja博士的友情馈赠,分别用于HUVECs中过表达PDCD4和阴性对照。PDCD4的小干扰核糖核酸(Small Interfering RNA, siRNA)和Negative Control购自上海吉玛公司,序列如下：质粒和siRNA的转染均采用脂质体转染法,步骤遵照Lipo-2000说明书进行。7.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)法检测PDCD4在剪切力调节HUVECs增殖中的作用HUVECs的增殖功能检测运用BrdU法,所用试剂盒为美国罗氏公司的BrdU标记及检测试剂盒I (Cat. No.11296736001),实验步骤遵照试剂盒说明书进行：将HUVECs种在培养载片上进行不同刺激和处理,在刺激结束前6小时以1：1000的比例向培养基中加入BrdU labeling medium,刺激结束后用95%乙醇固定,经anti-BrdU4℃孵育过夜、Anti-mouse-Ig-fluorescei或nAlexa flour647标记的山羊抗小鼠免疫荧光二抗37℃避光孵育、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, DAPI)染核后封片,共聚焦显微镜下观察不同组HUVECs增殖功能的差异,计数并计算BrdU阳性细胞率。8.脱氧核苷末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测PDCD4在剪切力调节HUVECs凋亡中的作用HUVECs的凋亡情况检测运用TUNEL法,所用试剂盒为美国Millipore公司的ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Cat. No. S7101),实验步骤遵照试剂盒说明书进行：将HUVECs种在培养载片上培养,予以不同刺激和处理,之后依次经免疫染色固定液固定、预冷的乙醇／乙酸液(乙醇：乙酸=2：1)-20℃C孵育、TdT酶37℃孵育、抗异羟基洋地黄毒苷过氧化物酶结合液室温孵育、二氨基联苯胺(3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydroch-loride, DAB)显色、甲基绿染核、脱水封片后镜下观察不同组HUVECs凋亡的差异,计数并计算TUNEL阳性细胞率。9.统计学分析数据均以均数±均数标准误(mean±SEM)的形式表示,使用SPSS统计学软件进行数据分析,两组之间的比较采用非配对t检验,多组之间的比较运用单因素方差分析,P<0.05为统计学有显着性差异。研究结果1.小鼠体内促动脉粥样硬化血流作用区域内皮细胞PDCD4的表达量高于抗动脉粥样硬化血流作用区域胸主动脉直段的内皮细胞受抗动脉粥样硬化的脉冲剪切力作用,呈长梭状,沿血管长轴规律排列,而主动脉弓小弯侧的内皮细胞受促动脉粥样硬化的震荡剪切力及低剪切力作用,呈多向不规则状排列。主动脉弓小弯侧的内皮细胞PDCD4的表达量(以荧光强度表示)高于胸主动脉直段内皮细胞(P<0.05),说明在体内,抗动脉粥样硬化的剪切力下调内皮细胞PDCD4的表达,而促动脉粥样硬化的剪切力则上调内皮细胞PDCD4的表达。2.脉冲剪切力下调HUVECs中PDCD4的表达,震荡剪切力上调HUVECs中PDCD4的表达脉冲剪切力作用下的内皮细胞PDCD4蛋白水平随时间延长而逐渐下调,与静止对照组(0小时组)比较,脉冲剪切力作用3小时至12小时PDCD4蛋白水平下调有统计学意义(P<0.05)；在震荡剪切力作用下,PDCD4蛋白水平随时间延长而逐渐上调,与静止对照组(0小时组)比较,震荡剪切力作用6小时至12小时PDCD4蛋白上调有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色结果也显示,脉冲剪切力作用后HUVECs中PDCD4的含量明显降低(P<0.05),而震荡剪切力作用后HUVECs中PDCD4的含量明显升高(P<0.05)。3. PDCD4促进HUVECs的增殖和凋亡与空载体对照组比较,转染pEGFP-C1-PDCD4以过表达PDCD4下调p21Wafl/cip1的表达(P<0.05),促进细胞的增殖(P<0.05)；而转染siRNA将PDCD4沉默,与阴性对照组比较,则上调p21Wafl/Cip1的表达(P<0.05),抑制细胞的增殖(P<0.05),表明PDCD4促进内皮细胞的增殖。与对照组比较,过表达PDCD4上调激活的Caspase-3(P<.05),促进细胞的凋亡(P<0.05),而沉默PDCD4,与阴性对照组比较,则抑制激活的Caspase-3(P<0.05),抑制细胞的凋亡(P<0.05),表明PDCD4促进内皮细胞的凋亡。4. PDCD4参与不同剪切力对内皮细胞增殖的调节,不参与其对凋亡的调节与静止对照组比较,脉冲剪切力上调p21Wafl/Cipl的表达(P<0.05),抑制内皮细胞的增殖(P<0.05)；而过表达PDCD4,与空载体阴性对照组比较,能够阻断脉冲剪切力对p21Waf1/cip1的促进(P<0.05)和对增殖的抑制作用(P<0.05)。与静止对照组比较,震荡剪切力抑制21Wafl/Cipl的表达(P<0.05),促进内皮细胞的增殖(P<0.05)；而沉默PDCD4,与阴性对照组比较,能够阻断震荡剪切力对p2iWaf1/Cipl的抑制(P<0.05)和对增殖的促进作用(P<0.05)。与静止对照组比较,脉冲剪切力抑制激活的Caspase-3(P<0.05),抑制内皮细胞的凋亡(P<0.05)；但过表达PDCD4,与空载体阴性对照组比较,不能阻断脉冲剪切力对对激活的Caspase-3的抑制及对凋亡的抑制。与静止对照组比较,震荡剪切力促进激活的Caspase-3(P<0.05),促进内皮细胞的凋亡(P<0.05)；但沉默PDCD4,与阴性对照组比较,不能阻断震荡剪切力对激活的Caspase-3及对凋亡的促进。以上结果表明,PDCD4参与不同剪切力对内皮细胞增殖的调节,但是不参与其对内皮细胞凋亡的调节。结论(1)脉冲剪切力下调血管内皮细胞PDCD4的表达,而震荡剪切力上调其表达；(2) PDCD4促进血管内皮细胞的增殖和凋亡；(3)PDCD4参与不同剪切力对血管内皮细胞增殖的调节作用,不参与剪切力对血管内皮细胞凋亡的调节作用。研究背景血流流经血管管腔产生剪切力作用于血管壁内表面的内皮细胞,激活血管内皮细胞胞膜上以及周围细胞外基质中的相关受体,改变细胞内的信号转导通路,影响多种基因表达和蛋白活性,维持血管内皮细胞在体内的相对稳定状态。在血管弯曲、分叉及狭窄处,血流受到干扰,剪切力由脉冲和层流剪切力变为震荡的低剪切力,引起内皮细胞功能障碍,促进动脉粥样硬化斑块形成,使这些部位成为动脉粥样硬化斑块的好发部位。近期研究发现,抑癌基因程序性细胞死亡4(Programmed Cell Death4, PDCD4)在心血管系统中同样发挥重要作用,如抑制血管平滑肌细胞、心肌细胞和成纤维细胞的增殖并促进其凋亡等。我们的前期工作发现PDCD4能同时促进血管内皮细胞的增殖和凋亡。我们在体内和体外实验中均证实剪切力能够调节血管内皮细胞PDCD4的蛋白含量,但其调节机制尚不明了。对众多肿瘤细胞和一些心血管系统细胞的研究发现,微小核糖核酸-21(microRNA-21, miR-21)与PDCD4的表达负相关。在PDCD4基因的3’非编码区有一个保守的miR-21结合位点,miR-21可直接与PDCD4的信使核糖核酸(Messenger Ribonucleic Acid, mRNA)结合抑制其表达。同时,其他研究发现肿瘤刺激物12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)以及给饥饿处理的细胞重新添加血清均可引起PDCD4蛋白的泛素化降解。以上两条途径均在转录后水平对PDCD4进行调节,而PDCD4在转录水平是如何被调节的鲜有报道。有研究发现小鼠的pdcd4基因序列中有一个可能的核转录因子κB (Nuclear Factor kappa B, NF-κB)结合位点,但该位点是否发挥作用尚不清楚。目前为止,对内皮细胞PDCD4表达调节机制的研究很少且存在争议。剪切力调节血管内皮细胞PDCD4表达的机制尚不明确,而niR-21、泛素-蛋白酶体系统及其他途径是否参与介导剪切力的作用也有待研究证实。研究目的(1)明确泛素-蛋白酶体系统在不同剪切力调节HUVECs PDCD4表达中的作用；(2)明确miR-21在HUVECs中对PDCD4表达的调节作用；(3)明确NF-κB在震荡剪切力上调HUVECs PDCD4表达中的作用。研究方法1.人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)的提取和培养无菌条件下获取剖宫产新生儿脐带,胰酶消化法获取HUVECs,20%培养基(20%胎牛血清+400μl/ml贝复济+青-链霉素)置于37℃、5%CO2培养箱中培养。一代之后更换10%培养基(10%胎牛血清+400μl/ml贝复济+青-链霉素)培养。2.体外剪切力干预体外培养的4-8代HUVECs用于实验。将HUVECs接种至铺有Ⅰ型鼠尾胶原的Flexcell培养载片上,经10%培养基培养24小时后,予以适当处理,继续静止培养或给予脉冲或震荡剪切力刺激,观察剪切力对HUVECs中目的蛋白表达的影响,不同剪切力描述如下：(1)脉冲剪切力：12dyne/cm2大小,频率为1Hz；(2)震荡剪切力：0±4dyne/cm2大小,频率为1Hz。3.蛋白质印迹(Western Blotting, WB)提取细胞蛋白,煮沸,经SDS-PAGE电泳,湿转法转膜,封闭,一抗4℃孵育过夜,相对应的二抗孵育,化学发光法发光后,分析蛋白条带灰度值。4.实时荧光定量聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)分析PDCD4mRNA的表达给予种在培养载片上的HUVECs以0、1、3、6、9、12小时的脉冲剪切力或震荡剪切力后,运用TRIzol法提取细胞总核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA),运用PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time (TaKaRa Code:DRR037A)互补脱氧核糖核酸(Complementary Deoxyribonucleic Acid, cDNA)合成试剂盒将总RNA逆转录成cDNA,再使用SYBR Premix Ex Taq GC (Perfect Real Time)实时定量PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR以测定各组内皮细胞PDCD4mRNA的表达。5.细胞转染β转导素重复包含蛋白(β-Transducin Repeat-Containing Protein, β-TrCP)和p65的小干扰核糖核酸(Small Interfering RNA, siRNA)、microRNA的模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)以及Negative Control (N.C)均购自上海吉玛公司,序列如下：siRNA及microRNA的模拟物和抑制物的转染均采用脂质体转染法,步骤遵照Lipo-2000说明书进行。6.免疫共沉淀对种在培养载片上的HUVECs予以刺激后,用Western及IP细胞裂解液提取细胞总蛋白,取出少量煮沸保存留作对照,向剩余提取液中加入Protein A/G PLUS Agarose和兔抗PDCD4单抗4℃C孵育过夜后收集琼脂糖凝胶珠,清洗后加入2×SDS上样缓冲液煮沸,取上清,进行Western Blotting检测其中相应的蛋白相对含量。7.统计学分析数据均以均数±均数标准误(mean±SEM)表示,使用SPSS统计学软件进行数据分析,多组之间的比较采用单因素方差分析,两组之间的比较采用非配对t检验,P<0.05为统计学有显着性差异。研究结果1.脉冲剪切力在转录后水平下调HUVECs中PDCD4的表达检测脉冲剪切力作用时间梯度下PDCD4的蛋白及mRNA水平,结果显示：与未经脉冲剪切力作用的0小时组比较,在脉冲剪切力作用下,PDCD4蛋白水平随时间延长而逐渐下调(P<0.05),但是其mRNA水平无明显变化(P>0.05),提示脉冲剪切力对HUVECs中PDCD4表达的下调作用发生在转录后水平。2.脉冲剪切力通过泛素-蛋白酶体通路下调PDCD4蛋白在剪切力刺激前1小时向培养基中加入蛋白酶体抑制剂MG-132(10μM)或乳胞素(10μM),二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide, DMSO)作阴性对照；将E3配体β-TrCP的siRNA转染入HUVECs中将其沉默。结果显示：与DMSO组比较,蛋白酶体抑制剂和(3-TrCP的干扰下调均可阻断脉冲剪切力对PDCD4的下调(P<0.05),但在静止培养条件下均不影响PDCD4的表达(P>0.05)。免疫共沉淀结果显示：与静止对照组和震荡剪切力组比较,脉冲剪切力明显增加PDCD4的泛素化(P<0.05)。在细胞中转染miR-21的模拟物或抑制物(PTEN为HUVECs中miR-21的靶基因,作阳性对照),与转染阴性对照比较,并不影响PDCD4蛋白的表达(P>0.05)。3.磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidyl Inositol3-Kinase, PI3K)/Akt通路介‘导脉冲剪切力对PDCD4的降解在进行剪切力刺激之前,用P13K抑制剂ⅠY294002(10μM)预处理细胞1小时,结果显示在LY294002作用下,和DMSO组比较,脉冲剪切力引起的Akt磷酸化被阻断(P<0.05),p70-S6K的激活及PDCD4磷酸化也被阻断(P<0.05),从而PDCD4的蛋白水平稳定并有上调趋势(P<0.05)。4.震荡剪切力在转录水平上调HUVECs中PDCD4的表达检测震荡剪切力作用时间梯度下PDCD4的蛋白及mRNA水平,结果显示：与未经震荡剪切力作用的0小时组比较,在震荡剪切力作用下,PDCD4蛋白水平随时间延长而逐渐上调(P<0.05),其mRNA水平也上调,在6小时达到峰值(P<0.05),提示震荡剪切力对HUVECs中PDCD4表达的上调作用发生在转录水平。5.泛素-蛋白酶体系统引起的PDCD4降解不参与震荡剪切力对PDCD4的上调作用在剪切力刺激前1小时向培养基中加入蛋白酶体抑制剂MG-132(10μM), DMSO作阴性对照,结果显示：与DMSO组比较,蛋白酶体抑制剂并不使PDCD4蛋白表达量进一步增加,反而阻断震荡剪切力引起的PDCD4上调(P<0.05),提示震荡剪切力可能不引起PDCD4的泛素化降解。免疫共沉淀结果显示,和静止对照组比较,震荡剪切力未明显改变PDCD4的泛素化(P>0.05)。另外,震荡剪切力不抑制反而上调Akt磷酸化(P<0.05),上调程度与脉冲剪切力比较无明显差别(P>0.05),该结果提示PI3K/Akt通路不参与震荡剪切力对血管内皮细胞PDCD4的上调。6. NF-κB参与震荡剪切力对PDCD4的上调作用在震荡剪切力刺激前1小时向培养基中加入NF-κB抑制剂MG-132(10μM), DMSO作阴性对照；将p65的siRNA转染入HUVECs中将其沉默,结果显示：与阴性对照组比较, NF-κB抑制剂和p65的干扰下调均阻断震荡剪切力对PDCD4的上调(P<0.05),表明NF-κB参与震荡剪切力对PDCD4的上调作用。结论(1)脉冲剪切力通过PI3K/Akt通路介导的泛素化降解下调血管内皮细胞PDCD4的蛋白；(2)震荡剪切力在转录水平上调血管内皮细胞PDCD4的表达,且NF-κB参与其中。
于海波[8]2016年在《剪切力对动静脉内瘘血管内皮细胞的影响》文中研究说明血液透析是终末期肾病患者重要的治疗方法,动静脉血管内瘘是维持性血液透析患者首选的血管通路。长期稳定的血管通路对维持性血液透析患者的生活质量和生存时间意义重大。从手术建立动静脉血管内瘘到其发展成熟为具有充足的血流量可以用于穿刺透析,需要一段时间的成熟期。在内瘘成熟的过程中,动静脉血管内血流动力学发生了巨大变化,并促使吻合的血管产生一系列的病理和生理学变化。血流剪切力为影响内瘘成熟的重要因素。第一部分平行板流动室流场的建立和数值模拟研究目的:动静脉内瘘是人为将动脉与静脉血管吻合后形成的非生理性产物。内瘘建立后,动脉血和或部分静脉血混合后流经静脉端返回心脏。由于血管径、血流量和内瘘夹角各不相同,且动静脉内瘘血流复杂,往往难以分析和研究。本研究应用平行板流动腔模拟管腔和血流,CFD软件分析平行平板流动腔内流体类型、剪切力的大小和分布。为分析内瘘复杂血流做理论和实践准备。方法:应用平行平板流动腔模拟动静脉血管内瘘内的血流动力学变化。应用CFD软件建模并分析流动腔内流体模式及剪切力的分布。结果:(1)由于本算例为压差驱动流,流场的压强分布在x、z方向上没有太大的差异,沿着流动方向压强逐渐减小。(2)整个计算域为层流流动,速度在圆管入口经过一段发展后形成抛物状分布,而后在狭窄长方体物块中,流体进行掺混、紊乱的流动并有涡流的存在,进入底面流动腔室(底板)后,流体为稳定均匀的流动状态,速度沿着y、x方向几乎无变化,但在z方向上呈现抛物线型分布(典型的泊肃叶流动特征),中间速度最大。(3)壁面切应力在底板中央层流区域均匀分布且数值较大。靠近壁面区域由于有涡流的存在且速度垂向梯度较小,因此该区域壁面切应力较小。在上述两个区域之间存在一个区域,由于存在较大的速度梯度,壁面切应力达到峰值,但该区域很小,对内皮细胞培养的影响也相对较小。(4)流动腔室中速度梯度与壁面切应力呈正比例关系。结论:(1)流动腔内流体为压差驱动流,压强的分布沿血流方向逐渐减低。(2)流体进入底面流动腔室(底板)后,成为稳定均匀的流动状态,速度沿着y、x方向几乎无变化。(3)入口流量越大,流动腔室中速度梯度越大,壁面切应力也越大。剪切力和速度梯度成正比,由于本研究中流体速度较小,剪切力和速度也近似呈正比关系。第二部分生理状况下剪切力对静脉内皮细胞的影响目的:内皮细胞呈单层贴覆于血管内表面,是各种力学变化的主要受力者。小窝蛋白是分布于内皮细胞表面的力学感受器,当剪切力作用于内皮细胞时,会引起膜表面蛋白表达及分布的变化。在生理状况下,血流剪切力直接作用于血管内皮细胞,内皮细胞表面的力学感受器在接受刺激后,将力学信号转换为生物信号并传递到细胞核,从而影响内皮细胞的生物学功能。本研究通过不同剪切力不同时间的刺激,研究血管内皮细胞功能的变化,评估其在内瘘内膜增生中的作用。方法:应用平行平板流动腔模拟动静脉内瘘静脉端管腔,培养基模拟血流产生剪切力,以脐静脉内皮细胞模拟静脉血管内皮细胞。低于生理水平剪切力、生理水平剪切力和超生理水平剪切力叁种力作用于静脉血管内皮细胞。剪切力作用时间分别为0小时、6小时、12小时和24小时。应用Western blotting和RT-PCR等方法检测不同剪切力和不同时间下Cav-1、p-ERK、t-ERK、NF-κB等的表达水平。结果:在生理性剪切力作用下,随着时间的延长内皮细胞表达Cav-1水平逐渐下降,而细胞因子NF-κB、p-ERK的水平随时间延长表达水平增多。而在不同剪切力作用12小时情况下,内皮细胞表达Cav-1的水平随作用力的增强而增多,细胞因子NF-κB、p-ERK的表达在低于生理性剪切力的作用下明显较多且具有统计学意义,其他剪切力情况下表达差异无统计学意义。结论:剪切力的作用时间和剪切力的强度对Cav-1的表达均有明显的影响。细胞因子NF-κB、p-ERK的表达具有时间依赖性,且低剪切力的作用对表达的影响较大。因此低剪切力和长期的作用对内皮细胞功能的影响较大,可能与内瘘血管的内膜增生、血栓形成和局部平滑肌细胞的迁移有关。第叁部分尿毒症环境下剪切力对静脉内皮细胞的影响目的:终末期肾病患者在CKD晚期开始出现血肌酐、钙磷代谢紊乱和代谢性酸中毒等并发症。而这些因素在一定程度上影响了血管内皮细胞功能,造成内皮细胞损伤。因此研究尿毒症环境中,血流剪切力对内皮细胞的影响至关重要。方法:在培养基中加入一定浓度尿毒症患者血清模拟尿毒症环境,应用平行平板流动腔模拟血流剪切力。低于生理水平剪切力、生理水平剪切力和超生理水平剪切力叁种力作用于静脉血管内皮细胞。剪切力作用时间分别为0小时、6小时、12小时和24小时。应用Western blotting和RT-PCR等方法检测不同剪切力和不同时间下Cav-1、p-ERK、t-ERK、NF-κB等的表达水平。结果:在尿毒症环境中,在生理性剪切力作用下,随着时间的延长内皮细胞表达Cav-1水平也呈逐渐下降,但整体表达水平均较低。细胞因子NF-κB、p-ERK的水平随时间延长表达水平增多,但是12小时后增速变缓。而在不同剪切力作用12小时情况下,内皮细胞表达Cav-1的水平随作用力的增强而增多,细胞因子NF-κB、p-ERK的表达在低于生理性剪切力的作用下明显较多且具有统计学意义,其他剪切力情况下表达差异无统计学意义。结论:在尿毒症环境中,剪切力的作用时间和剪切力的强度对Cav-1的表达均有影响。作用时间越长,细胞因子NF-κB、p-ERK的表达越多。低剪切力对细胞因子NF-κB、p-ERK表达的影响较大。因此,在尿毒症环境中,低剪切力和长期的作用仍是内皮细胞功能活化的有效刺激因素,其与内瘘血管的内膜增生、血栓形成和局部平滑肌细胞的迁移有关。
于红梅[9]2001年在《剪切力对单核细胞趋化蛋白-1合成和分泌的影响》文中研究表明动脉粥样硬化是一个长期的，复杂的病理过程，多发生于大中型血管管壁。动脉粥样硬化的发生发展过程中包括内皮细胞的活化，脂质沉积，单核细胞、淋巴细胞浸润，平滑肌细胞迁移，细胞外基质增生和血栓形成等。其中，各种致病因素引起的血管内皮细胞损伤被认为是动脉粥样硬化的最早，也是最关键的环节。血管内皮细胞作为血管的最内层，一生生活在血流环境中，终身受到血流的作用。血流的变化必将引起内皮细胞不同水平的变化。从对动脉粥样硬化的临床及病理研究中，我们已确定动脉粥样硬化好发于血管的分支及弯曲处，该处血流方式不同于血管的其他部位。因此血流动力学环境的改变是造成内皮细胞损伤，引发动脉粥样硬化的原因之一。我们从细胞力学的角度，研究了流体剪切力对血管内皮细胞代谢、形态、结构、功能等的影响。以探讨剪切力在动脉粥样硬化中的作用。 在动脉粥样硬化最早期的病理改变之一，即血液中的单核细胞、淋巴细胞进入血管内皮下的过程，是由许多物理化学因子共同参与完成的。其中，一个重要的细胞因子是单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），它能够特异性的趋化单核细胞在内皮细胞下聚集。MCP-1可以由多种细胞合成，但在动脉粥样硬化早期，则主要由血管内皮细胞合成。因此，在实验中，我们以MCP-1为主要的观察对象，来分析剪切力对血管内皮细胞的影响。 本实验主要以体外培养的人脐静脉血管内皮细胞为实验对象，通过特殊的流动装置，施加不同水平的流体剪切力，运用免疫学方法观察和分析血管内皮细胞合成与分泌MCP-1的规律。 首先，采用免疫组化方法，观测不同时间和大小的剪切力作用下细胞胞浆中合成的MCP-1，图象分析结果表明，MCP-1的合成是随剪切力大小和作用时间的变化而变化的。剪应力大小为4 dyn/cm~2时，与正常对照组相比，内皮细胞胞浆的灰度值在剪切力作用0.5h时较高，2h和5h灰度值较低，6h后灰度值重新升高。说明在一定剪切力作用下，MCP-1的合成由少到多，然后又减少。而当剪应力为10 dyn/cm~2时，细胞胞浆灰度值有相似的变化规律。但在同时期内，剪应力为4 dyn/cm~2时的灰度值较剪应力10 dyn/cm~2时低。说明相同时间时，剪应力为4 dyn/cm~2时，内皮细胞合成MCP-1较多。因此，MCP-1的合成对剪切力大小有依赖性。 其次，采用酶联免疫吸附法，检测不同时间内皮细胞分泌出的MCP-1量。在剪应力为4 dyn/cm~2时得到的MCP-1分泌变化曲线显示，分泌在2hr后明显增多，5小时左右达到高峰，之后以较快速度减少，6hr后降至低点，并保持在该水平，不再增多，显示MCP-1 北京工地大学硕士学位快又蛋白的合成及分泌呈累积性增加。而当时间一定时，剪应力为 4 dyn／cm‘时各时间点的MCPI分泌量较剪应力10 dyn／。m‘时多。 以上的研究证明剪切力可以在多个水平影响内皮细胞的结构和功能，在对细胞因子如MCP－l的调控中，可以从转录水平，翻译水平，蛋白质的加工与最后分泌出细胞的环节上影响MCP－l的产生，从而引发动脉粥样硬化的形成。
成敏[10]2005年在《低剪切力上调内皮细胞IL-8 mRNA信号转导途径的实验研究》文中指出研究背景 血液流动对血管产生力的作用,这对于心血管系统稳态的维持有着重要的意义,这些力分为沿血流方向与血管平行的剪切力,垂直于血管壁的压应力和沿血管壁周向的拉应力。此外,它们也在心血管疾病,如动脉粥样硬化等的发生、发展过程中扮演着重要的角色。剪切力,作为血流动力的水平分量,不仅会影响内皮细胞的形态、迁移、分化和增殖,而且还通过调节内皮细胞不同基因的表达,在心血管系统的病理和生理过程中起重要作用。在内皮细胞,已发现多种受剪切力调节的基因,根据它们的生物学特性,大致可以分为血管活性物质、生长因子、粘附分子、趋化因子、凝血因子和原癌基因等。我们前期工作表明层流状态的低剪切力(4.20 dyne/cm~2)可诱导培养的人脐静脉内皮细胞IL-8 mRNA的表达。显然,从最初的剪切力这种物理刺激到最终的IL-8基因的表达之间必然存在着复杂而精细的信号转导过程。 鉴于力学信号的转导过程包括力学耦联(mechanocoupling),作用在细胞上的外界应力使胞外基质产生形变,成为能被细胞所感知的局部信号;生化耦联(biochemical coupling),细胞将局部信号转化为细胞内的生物化学信号并最终影响基因的表达或蛋白的活化等过程。我们拟从以下几个方面探讨低剪切力上调内皮细胞IL-8 mRNA的信号转导途径:1)研究整合素在低剪切力上调内皮细胞IL-8基因表达中的作用:2)研究细胞骨架在低剪切力上调内皮细胞IL-8基因表达中的作用;3)研究低剪切力上调内皮细胞IL-8基因表达过程中胞内信号转
参考文献：
[1]. 剪切力对脐静脉内皮细胞凋亡的影响[D]. 王云. 北京工业大学. 2002
[2]. 重组人脑钠肽改善糖尿病小鼠下肢缺血病变的作用及机制研究[D]. 金启辉. 浙江大学. 2018
[3]. 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在低剪切力诱导的动脉粥样硬化中的作用及机制研究[D]. 秦伟栋. 山东大学. 2013
[4]. 剪切力对脐静脉内皮细胞凋亡的影响[J]. 乔元华, 王云, 曾衍钧, 颜光涛, 胡金麟. 中国生物医学工程学报. 2005
[5]. 剪切力对血管内皮功能影响及机制研究进展[J]. 曹雪飞, 董国, 杨树森. 中华实用诊断与治疗杂志. 2016
[6]. 非诺贝特对LPC诱导的血管内皮细胞增生和凋亡的影响及机制探讨[D]. 孙国举. 中南大学. 2006
[7]. 剪切力调节血管内皮细胞PDCD4表达的机制及内皮细胞增殖和凋亡的变化[D]. 戈程. 山东大学. 2014
[8]. 剪切力对动静脉内瘘血管内皮细胞的影响[D]. 于海波. 天津医科大学. 2016
[9]. 剪切力对单核细胞趋化蛋白-1合成和分泌的影响[D]. 于红梅. 北京工业大学. 2001
[10]. 低剪切力上调内皮细胞IL-8 mRNA信号转导途径的实验研究[D]. 成敏. 四川大学. 2005
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