刘秀艳, 徐向阳, 叶敏, 项硕[1]2008年在《光合细菌利用工业有机废水产生5-氨基乙酰丙酸》文中指出【目的】利用本实验室筛选的5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)高产紫色非硫红假单胞菌株,以味精、柠檬酸、啤酒和豆制品生产废水作为底物,进行光合细菌利用废水产生ALA并去除化学需氧量(CODcr)的研究。【方法】光合细菌培养温度为30℃,光照强度为3000Lux,进行乙酰丙酸、甘氨酸、琥珀酸的添加与否和废水灭菌与否的处理,用比色法测定菌液光密度,ALA检测采用Ehrlich’s试剂分光光度检测法。【结果】在不添加乙酰丙酸(levulinic acid,LA)、甘氨酸和琥珀酸的条件下,菌株99-28的菌体生长在72～96h达到稳定期,ALA产量在96h最高,在4种废水中,味精废水的ALA产量最高,CODcr去除率也最高;添加LA、甘氨酸和琥珀酸显着提高ALA产量,但CODcr去除效果不好。废水不灭菌略微降低99-28菌株的生长和CODcr的去除能力,在添加LA、甘氨酸和琥珀酸的条件下的,ALA产量明显下降。ALA高产突变菌株L-1在有机废水中的生长状况、对有机废水的CODcr去除与菌株99-28表现一致,在不添加和添加LA、甘氨酸和琥珀酸的条件下,突变株L-1的ALA产量明显比菌株99-28高。【结论】本实验室筛选的紫色非硫红假单胞菌株能利用有机废水作为底物产生ALA并降解CODcr。
刘秀艳[2]2001年在《光合细菌利用工业有机废水产生5-氨基乙酰丙酸的研究》文中研究指明5—氨基乙酰丙酸（ALA）是一种无公害绿色的除草剂、光动力学剂、杀虫剂、抗微生物药剂、植物生长促进剂。光合细菌生物合成ALA因工艺简单、产率高，具有工业化生产潜力，倍受国外研究者及产业界的关注。本论文主要研究了产ALA光合细菌的分离和选育及其利用有机废水产生ALA的潜力。 从不同生境分离的36株光合细菌菌株中，经初筛获得7株ALA产量较高的菌株。经复筛，发现99-28菌株的ALA产量较高，达3.145mg/l。对99-28菌株进行形态、生理生化鉴定，确定该菌株属紫色非硫红假单胞菌属。该菌株的最适培养条件：pH7.5，光照强度3000Lux，酵母膏浓度0.2％。 采用紫外线对出发菌株99-28进行诱变处理，从大量诱变菌株中筛选出高产菌株L-1。L-1菌株产ALA的最适影响因子：pH7.5，光照强度3000Lux，接种量10％。在此条件下，L-1菌株的最大ALA产量为7.266mg/L。 甘氨酸、琥珀酸是ALA生物合成的前体，而乙酰丙酸（LA）是ALA脱水酶（ALAD）的抑制剂。本试验结果表明：甘氨酸是ALA生物合成必需的前体，加入LA抑制ALAD活性，能显着提高ALA产量，光照培养后48h，3次加入基本达到效果。在GM培养基，pH7.5，3000Lux光照，培养48h后加入LA30mmol/L、甘氨酸30mmol/L和琥珀酸30mmol/L，99-28菌株的ALA产量可达9.154mg/L，菌株L-1的ALA产量可达22.15mg/L。 选用味精、柠檬酸、啤酒、豆制品生产废水作为产生ALA的底物，废水中不加入LA、甘氨酸和琥珀酸时，99-28菌株培养120h去除CODcr与产生ALA的结果：味精废水CODcr去除率为93.5％，ALA产量2.578mg/L；豆制品废水CODcr去除率为94.8％，ALA产量为1.428mg/L；啤酒废水CODcr去除率为92.4％，ALA产量1.651mg/L；柠檬酸废水CODcr去除率为73.5％， 浙江大学硕士学位论文 摘 要ALA产量工刀29 mg／L。在加入LA、甘氨酸和掳拍酸的条件下，99上8菌株的 ALA产量明显提高，培养 96 h产生 ALA的结果：味精废水为 3．488 mg／L、豆制品废水为 2．458 mg／L、啤酒废水为 2刀97 mg／L、柠檬酸废水为 2．801mg／L；但加入LA、甘氨酸和掳帕酸后，CODcr基本上不再下降。 Ll菌株在味精废水中产 ALA最适条件为：pH 7．5，接种量 10％h八人光照强度3000Lux。 在不加入 LA、甘氨酸和琉琅酸的条件下，L－1菌株培养 120 h去除有机废水 CODcr与产生 ALA的结果如下：味精废水去除率为 91石％，ALA产量2．819 mg／L；豆制品废水去除率为 91．8％，ALA产量为 1．531 mg／L；啤酒废水去除率为 91．5％，ALA产量 2．166 mg／L；柠檬酸废水去除率为 73．4％，ALA产量2．424 mg／L。在加入LA、甘氨酸和掳琅酸的条件下，LJ菌株的ALA产量明显提高，培养4天产生ALA的结果如下：味精废水为6．493 mg／L，豆制品废水为 1．994 mg／L，啤酒废水为 7．266 mg／L，柠檬酸废水为 5．394mg／L；但加入LA、甘氨酸和掳琅酸后，CODCr基本上不再下降。 本研究结果对光合细菌菌株资源的深度开发及工业有机废水的资源化利用具有一定的实际意义。
刘锦妮[3]2008年在《枯草芽孢杆菌谷氨酰t-RNA还原酶基因（hemA）和谷氨酰t-RNA合成酶基因（hemL）表达载体的构建及优化》文中研究指明5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,简称ALA)是生物合成四吡咯的前体,而四吡咯是构成生物体必不可少的物质。ALA对人畜无毒性,在环境中易降解、无残留,是一种无公害的绿色农用化学品。在医学领域,ALA可作为抗癌药物的中间体,作为检验铅中毒的主要试剂。1999年12月,美国FDA正式批准ALA为治疗皮肤癌前期的光动力药物,ALA在治疗其它表皮癌症中的应用也得到了越来越多科学家的兴趣。作为第二代光动力药,ALA的显着优点是副作用小、渗透性好、疗效确切、对疾病的适用范围广及价格低等。本研究以NCBI数据库(M57676)的枯草芽抱杆菌基因组中的hemA和hemL基因序列为模板设计PCR引物,经PCR扩增得到hemA和hemL基因片段,并克隆到pGEM-T-Vector载体上,得到重组质粒pGEM-T-hemA和pGEM-T-hemL。酶切回收hemA和hemL基因片段并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体(pGJ113)的Pglv启动子下游EcoR?和Not?位点间,构建hemA和hemL基因的表达载体pGJ216和pGJ218。将两个表达载体分别电转化至B. subtilis 1A747感受态细胞中,用麦芽糖进行诱导表达,SDS-PAGE凝胶扫描分析显示,目标蛋白HemA和HemL分别占胞内总可溶性蛋白的11 %和13 %,实现了hemA和hemL基因的高效表达。重组菌B. subtilis(pGJ216)和B. subtilis(pGJ218)的发酵液上清中5-氨基乙酰丙酸含量分别达到26.31 mg/L和24.47 mg/L,菌液呈红色,紫外分光光度检测验证显色的为卟啉类物质。试验表明,表达的重组蛋白具有生理活性并促进了枯草芽孢杆菌中5-氨基乙酰丙酸的合成,并且分解代谢途径也加快。对构建的表达载体pGJ216和pGJ218进行优化,将突变的Pglv启动子-PglvM分别克隆到pGJ216和pGJ218中hemA和hemL基因的上游,替换Pglv启动子,得到表达载体pGJ216M和pGJ218M,将其电转化至B. subtilis 1A747感受态细胞中,用麦芽糖进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,pGJ216M和pGJ218M的表达蛋白在50 KD附近有一条明显的条带,而对照菌没有明显的蛋白条带,结果表明得到较大量的谷氨酰t-RNA还原酶蛋白和谷氨酰t-RNA合成酶蛋白,并且在枯草芽孢杆菌中实现了高效表达。优化后的表达载体pGJ216M和pGJ218M比表达载体pGJ216和pGJ218的诱导表达效果更好,生成的5-氨基乙酰丙酸含量更多。诱导表达促进了5-氨基乙酰丙酸的生物合成代谢途径,并加快了5-氨基乙酰丙酸的合成速度。
刘天佳[4]2013年在《过量合成5-氨基乙酰丙酸工程菌的构建》文中指出5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid ALA)是一种光动力化合物。在医学上,ALA用于癌症的光动力学治疗和诊断,具有促进血红素生成的作用,是痤疮治疗的外用药,并且可以作为生发剂使用；在农业上,ALA是一种绿色无公害的除草剂、杀虫剂、抗微生物药剂和植物生长促进剂,具有促进植物生长,对害虫、致病菌高效,对人畜无毒、对环境无污染等优点,在生物农药和肥料领域具有广泛的应用前景。与化学合成法相比生物合成法生产ALA,工艺简单,生产原料低廉,可减少环境污染。基于生物合成法的优势及ALA广泛的应用前景,本论文主要对5-氨基乙酰丙酸的生物合成展开研究,包括ALA合成酶基因(hemA)的克隆、表达,工程菌发酵条件的优化以及运用代谢工程原理和技术构建具有新的ALA生物合成途径的大肠杆菌工程菌。主要实验结果如下：(1)从筛选得到的光合菌中,克隆了ALA合成途径中的关键酶ALA合成酶的基因(hemA),测序结果表明该基因长度为1224 bp。与NC_007493 USA Rhodobacter sphaeroides进行比对,发现有一个碱基的差异(第1204位点由C突变为T),一致性为99.92%。将基因序列翻译为氨基酸序列进行比对,有一个氨基酸的差异(第335位由丙氨酸变为缬氨酸),一致性为99%(2)构建了原核表达载体pET30a-hemA,转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中,进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示,pET30a-hemA诱导后表达出的蛋白分子量约为45 kDa,与理论相对分子质量(44.7 kDa)相符,说明该蛋白诱导表达成功。(3)对pET30a-hemA/E.coli BL21(DE3)的发酵培养基和培养条件进行了优化,确定了最优培养基为TB培养基,最佳诱导温度为16℃,同时添加前体物质甘氨酸和琥珀酸终浓度均达到100 mM有助于菌体生长和ALA的合成,ALA的产量达到528 mg/L。(4)采用代谢工程策略,以大肠杆菌为宿主,系统考虑ALA C4生物合成途径的限速步骤、前体供给及产物分泌等问题,对ALA合成酶基因(hemA)、辅酶A转移酶基因(Cat)以及ALA分泌基因(YBi)进行基因操作,借助pETDuet-1共表达载体,构建了一株共表达hemA、Cat和YBi基因的工程菌E.coli ACY,胞外ALA的产量达到1124mg/L。
赵春晖[5]2004年在《光合细菌和重组大肠杆菌生物合成5-氨基乙酰丙酸的研究》文中认为5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，简称ALA)是生物合成四吡咯的前体，而四吡咯是构成生物体必不可少的物质(血红素，细胞色素，维生素B_(12))。对ALA的深入研究表明，ALA对人畜无毒性，在环境中易降解、无残留，是一种无公害的绿色农用化学品。在医学领域，ALA可作为抗癌药物的中间体，作为检验铅中毒的主要试剂，对吡咯紫质沉着症的临床诊断也有一定效果。1999年12月，美国FDA正式批准ALA为治疗皮肤癌前期的光动力药物，ALA在治疗其它表皮癌症中的应用也得到了越来越多科学家的兴趣。作为第二代光动力药，ALA的显着优点是副作用小、渗透性好、疗效确切、对疾病的适用范围广及价格低等。 国外已经研究了采用化学方法以及微生物发酵合成ALA的各种工艺路线。我国对化学方法以及微生物发酵法生产ALA的研究基本上仍属空白。 本论文对5—氨基乙酰丙酸的生物合成展开研究，主要包括光合细菌的筛选和诱变育种，光合细菌摇瓶发酵的研究，基因工程菌摇瓶条件和发酵罐上的研究。 我们利用van Niel培养基从杭州市四堡废水处理厂的活性污泥中分离得到四株光合细菌，选取其中产生ALA能力最佳的菌株(ALA产生能力为7.35mg／L)进行菌种鉴定，确定该菌株属红假单胞菌属。采用亚硝基胍，紫外线以及磷酸二乙酯和氯化锂协同作用对该菌株进行诱变处理，得到产量为21.2mg／L的菌株C-2。 对培养基组成和培养条件进行了初步优化，发现葡萄糖是最佳碳源、磷酸铵为最佳氮源。在培养基中加入的葡萄糖质量浓度为15g／L、磷酸铵质量浓度为2g／L、接种量为10％、100mL摇瓶装液量为20mL、调节初始pH7.0进行培养时，ALA的最高积累量可达24.9mg／L；进一步对前体的最佳添加量进行优化，发现甘氨酸的最佳添加浓度为100mmol／L、琥珀酸的最佳浓度为20mmol／L，同时加入脱水酶抑制剂乙酰丙酸20mmol／L时，ALA的最高产量达到38.9mg／L。 由于常规诱变工作量大，效率低。通过几轮诱变后发现进一步提高光合细菌产ALA的能力十分困难，于是本实验室构建了以E.coli DH5α为宿主的工程菌GT48，产ALA能力为19.8mg／L的，在摇瓶条件下对GT48菌株的培养特性进行了浙江大学硕士学位论文暴摘要初步考察，结果表明:最佳的初始pH为6.5，最佳诱导时间为稳定前期，适当的葡萄搪浓度对ALA的积累有较大的促进作用。确定甘氨酸的加入对于ALA的积累有一定效果。随后在高百特5L罐上研究了丑co了z’GT48的间歇培养规律。把产ALA能力提高到47.smg/L。 为了进一步提高细胞密度及ALA产量，在5L高百特发酵罐中进行了流加培养，探讨了不同流加培养基，发酵罐溶氧对大肠杆菌累积ALA的影响。最终确定以恒定的流速向发酵罐中流加补料时，流加速度为smL/hr(相当于每小时加入1g葡萄糖和0.59甘氨酸)，发酵罐装液量为3L，通气量为svvm，ALA的累积量达到72.gmg/L。 本文工作只是对生物合成5一氨基己酞丙酸的初步探索，结果也不尽如人意，但为5一氨基乙酞丙酸的深入研究打下了基础。
傅维琦[6]2009年在《产5-氨基乙酰丙酸重组菌的优化和发酵过程调控研究》文中研究表明5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)是生物合成叶绿素、血红素、卟啉和维生素B_(12)等四吡咯化合物的前体物质。ALA除作为一种环境相容性及选择性很高的新型光动力学农药外,还在临床上广泛用作光化疗剂和诊断剂。代谢工程技术在ALA的开发中显示出很大的前景,但此前获得的工程菌产量与诱变菌株相比还比较低,底物的转化率不高,并且工艺尚不成熟,离产业化尚有距离。本工作的目的是运用代谢工程原理和技术,构建高效率产ALA的重组大肠杆菌,并优化工程菌的发酵条件和过程控制策略,提高ALA的生产水平,降低ALA的生产成本,为该产品的工业化生产及其在农业和医学领域的大规模应用奠定坚实的基础。本文首先克隆了类球红细菌的hemA基因,构建了重组质粒pET28a(+)-Rs.hemA。然后通过Red同源重组技术敲除大肠杆菌MG1655的琥珀酸脱氢酶基因(sdhAB),获得了MG1655(sdhAB~-)。大肠杆菌MG1655和MG1655(sdhAB~-)经过溶源化处理后,构建了工程菌MG1655(DE3)/pET28a(+)-Rs.hemA和MG1655(sdhAB~-)(DE3)/pET28a(+)-Rs.hemA用于ALA的生产。考虑到培养基中葡萄糖、甘氨酸和琥珀酸的浓度对于ALA的合成具有重要影响,通过响应面设计优化了培养基中这些成分的浓度并考察了其交互作用。工程菌经过摇瓶试验优化,发现sdhAB缺陷型菌株具有更好的ALA合成潜力。采用工程菌MG1655(sdhAB~-)(DE3)/pET28a-Rs.hemA在151发酵罐上进行批次发酵,ALA的积累量达到2.1 g/l,相对琥珀酸的摩尔转化率达40.1%。采用pKD46介导的Red同源重组技术,成功将嗜热栖热菌的ALA脱水酶基因敲入到大肠杆菌BW25113中替换了大肠杆菌自身的ALA脱水酶基因,获得了ALA脱水酶基因替换菌株。考虑到表达的ALA合成酶在大肠杆菌BW25113和MG1655等菌株中的活力比较低,提高ALA合成酶的活力成为进一步研究的首选目标。重组类球红细菌ALA合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行了表达优化,其中Rosetta(DE3)为稀有密码子优化型菌株。对ALA合成酶表达条件和培养基条件进行了优化,结果表明,相比于宿主BL21(DE3),Rosetta(DE3)表达的ALA合成酶活力更高,ALA产量也更高。在51发酵罐上进行了ALA合成的实验,以工程菌Rosetta(DE3)/pET28af+)-Rs.hemA为出发菌株,ALA积累量最高达3.8 g/l(29 mM)。对工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET28a(+)-Rs.hemA合成ALA进行了系统研究。在批次发酵中,确定了葡萄糖和甘氨酸的添加能够有效促进ALA的合成。对于前体流加策略进行了研究,确定了合适的前体配比,ALA的产量最高达4.1g/l。考虑到流加发酵过程的pH控制对于细胞生长和ALA合成有重要影响,设计了新型的两阶段pH反馈控制的流加策略,发酵前6h的pH值控制在5.9随后利用前体流加控制pH值在6.2,ALA积累量最高达6.6g/l(50 mM)。为了增强来源于放射形土壤杆菌(A.radiobacter zju-0121)的ALA合成酶基因的表达,根据此前的研究结果,选择大肠杆菌Rosetta(DE3)作为宿主构建了高效表达的重组菌。对重组菌细胞破碎液中的ALA合成酶进行了蛋白电泳分析和活力分析,结果发现,宿主Rosetta(DE3)表达的ALA合成酶活力比此前BL21(DE3)表达的酶活力提高了20%。采用优化的培养条件,在151发酵罐上进行了流加发酵研究,ALA的产量可达6.5g/l。采用亲和层析和凝胶过滤层析纯化获得了重组ALA合成酶。研究了ALA合成酶的基本特性,并通过比较研究筛选得到ALA脱水酶的抑制剂D-葡萄糖和D-木糖。将D-木糖用于151发酵罐进行ALA的合成,积累量最高达7.3g/l(56 mM)。
刁宁宁, 张建国, 李保国[7]2015年在《豆制品废水资源化利用研究进展》文中研究指明豆制品生产过程中会产生大量的有机废水。由于豆制品废水中含有丰富的营养物质,所以它具有可以资源化利用获得经济效益和保护环境的潜在价值。豆制品废水资源化利用不仅可以大幅度降低化学需氧量,而且可以获得高附加值物质,例如:大豆异黄酮、大豆皂甙、大豆低聚糖、大豆乳清蛋白等。而且,通过微生物发酵的方法可以获得单细胞蛋白、生物能源的原料等有用物质。本文综述了从豆制品废水中回收利用的多种生物活性物质,以及利用微生物发酵的方式得到有用物质的研究进展。这些物质都是豆制品废水的资源化利用的有益去向。
参考文献：
[1]. 光合细菌利用工业有机废水产生5-氨基乙酰丙酸[J]. 刘秀艳, 徐向阳, 叶敏, 项硕. 微生物学报. 2008
[2]. 光合细菌利用工业有机废水产生5-氨基乙酰丙酸的研究[D]. 刘秀艳. 浙江大学. 2001
[3]. 枯草芽孢杆菌谷氨酰t-RNA还原酶基因（hemA）和谷氨酰t-RNA合成酶基因（hemL）表达载体的构建及优化[D]. 刘锦妮. 西北农林科技大学. 2008
[4]. 过量合成5-氨基乙酰丙酸工程菌的构建[D]. 刘天佳. 河北科技大学. 2013
[5]. 光合细菌和重组大肠杆菌生物合成5-氨基乙酰丙酸的研究[D]. 赵春晖. 浙江大学. 2004
[6]. 产5-氨基乙酰丙酸重组菌的优化和发酵过程调控研究[D]. 傅维琦. 浙江大学. 2009
[7]. 豆制品废水资源化利用研究进展[J]. 刁宁宁, 张建国, 李保国. 食品与发酵科技. 2015
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