殷琦[1]1991年在《周围神经损伤后神经、肌肉运动终板退变及再生的临床、实验研究》文中研究说明周围神经损伤的治疗由来已久，国内外学者已公认，早期修复神经能产生最佳效果。在早期修复时机中，对于一期修复神经还是留待二期修复神经，何者能获得更优效果仍是争论的课题。著名的奥地利神经学专家Millesi曾于1981年提出：一期修复神经还是二期修复神经，何者能为再生提供更好的机会。目前，乃至今后仍将是讨论的课题，其基本问题是哪个更具有真正的优越性。 在人类，对于一年以上神经损伤进行修复，由于失神经区域严重退行性改变，国内外许多学者持否定态度。早在40年代，Seddon就从周围神经伤的病人中观察到：1年以后修复神经，效果极差。Scarff 1958年提出：20个月是神经修复的平均最高时限，1986年Birch指出：尺神经损伤一年后修复无指望，Crenshaw(1963～1987)在历版Campbell矫形外科手术学上均认为高位神经伤超过9个月、低位神经伤超过12个月修复，功能恢复无指望(正中、尺神经)。桡神经损伤超过15个月，功能恢复无指望。因此，“神经损伤一年以上无修复价值”的观点一直在学术界占统治地位。尽管如此，国内外仍有不少学者对晚期神经伤的病人进行试偿性修复并获得成功。Marble，Hamlin报道了2—4年修复神经仍能得到较好的效果，Sakellarides认为3年以上修复神经仍能得到有价值的恢复。Trail报道尺神经全断9年后修复，运动、感觉恢复的病例。但以上均例数较少，更缺乏相关实验研究。 我们首次从临床，实验进行系统神经退变及不同时间修复神经后再生实验研究，从组织学、多项组织化学、电生理、超微结构、HRP示踪技术等多方面研究，一期、早二期修复能获得同样的效
杨绍安[2]2007年在《aFGF预防失神经支配运动终板退变及肌萎缩的实验研究》文中研究说明研究背景很多研究发现肌细胞正常结构与功能维持需靠一些神经营养因子的作用，运动神经损伤后，骨骼肌失神经支配后最大变化便是这种神经营养因子丢失，同时骨骼肌废用，最终导致肌肉形态结构和生理生化等方面改变，组织形态学上表现为运动终板退变、肌细胞浆丢失及直径减小，并随时间延长而加重。目前，运动神经损伤后功能的重建主要还是集中在恢复神经的连续性上，忽视了对其靶器官的保护，由于神经漫长的再生过程、再生过程中神经出现再退变、损伤部位的阻挡因素、修复后肢体固定等原因，即使及时修复神经，肌肉失神经支配时间很长，神经对肌肉的营养作用丧失，运动终板逐渐退变，给神经肌肉接头的重建带来极大的困难，临床常见肌肉呈念珠状变性、横纹消失，肌肉萎缩，时间过长肌肉坏死、消失；而且，肌肉失用、萎缩亦会影响运动终板的形态，二者之间形成恶性循环，成为目前严重阻碍运动神经修复后功能恢复的最重要因素之一。因此，如何预防运动终板退变及肌萎缩已成为当前临床运动神经损伤后功能重建过程中急需解决的难题。迄今对运动终板退变的预防研究甚少，治疗方法不多。临床常用的方法是提倡功能锻炼，但其只能避免肌肉废用不能提供神经营养、且外科修复病例早期常需固定肢体而无法开展，作用有限。曾经有学者提出电刺激可以替代失神经肌肉的兴奋性，并提出了实验鼠模拟正常运动终板兴奋的电刺激模式，取得了一定的效果，但电刺激作用不能持久，并有诸多不便。近年在药物实验研究方面取得了一些成果：有作者报道大鼠腹腔注射地塞米松可以减缓减轻非离断性神经损伤支配运动终板的退变；口服氨哮素可以防止失神经支配运动终板的退变，防止肌肉萎缩，其作用可能是通过某种途径使肌卫星细胞产生一种胰岛素样生长因子(IGF)的营养物质模仿神经对肌肉的营养作用；此外，神经断端间应用神经生长因子(NGF)及肝细胞生长因子(HGF)可减轻运动终板的退变；1996年，Margaret等报道在Ⅱ期修复神经的同时将酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)纤维蛋白凝胶植入其支配的萎缩肌腹，初步研究可以诱导运动终板的再生，但对不修复神经者无明显作用，其结果仅仅说明aFGF的作用是在修复神经的前提下，没有说明能否保护失神经支配的运动终板，也没有探讨其对功能恢复效果的作用。aFGF具有广泛的生物学效应，如促进细胞增殖与分化，促进组织修复，也是一种形态发生因子；其靶细胞有成肌细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等；在重建神经肌肉接头时能激活静止的未分化神经靶细胞形成基底膜，有促进血管生成改善微循环，对多种组织有体内营养作用。成纤维细胞有促进肌细胞基底膜形成的作用，而骨胳肌基底膜是神经肌肉接头形成的重要条件，因此，aFGF促进成纤维细胞的分化对神经肌肉接头的形成具有重要作用；很多研究表明肌肉萎缩的原因主要是肌膜受到不同程度的脂类过氧化作用，这一因素也将累及运动终板，因此，促进基底膜的形成有助于补充受损的膜性结构。亦有研究表明aFGF能调节细胞内钙离子的流出与流入过程，有利于促进黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，从而有力于自由基的清除而保护膜性结构如运动终板。此外，对成肌细胞的促进分化可以形成肌细胞并分化成肌管，有助于防止肌肉萎缩；作用于血管内皮细胞有助于改善血循环。aFGF对运动神经损伤后运动终板退变及肌萎缩的预防是否有作用尚无报道，本研究试图探讨aFGF对失神经支配运动终板退变及肌萎缩的预防作用及其作用机理。研究目的1、建立为失神经支配运动终板及肌肉提供替代性神经营养的aFGF缓释系统。2、建立aFGF纤维蛋白凝胶预防失神经支配运动终板退变及肌萎缩的动物模型。3、探讨aFGF纤维蛋白凝胶预防失神经支配运动终板退变及肌萎缩的形态学及机能学效果。4、初步探讨aFGF纤维蛋白凝胶预防失神经支配运动终板退变及肌萎缩的作用机理。材料和方法1、纤维蛋白凝胶复合aFGF缓释系统的制备：将冻干人纤维蛋白原及抑肽酶直接溶于注射用水，其浓度分别为60mg．ml~(-1)，3000 KIU．ml~(-1)，得溶液Ⅰ；凝血酶用40mmol．L~(-1)CaCL_2溶液配成250 U．ml~(-1)，为溶液Ⅱ。每支aFGF(50μg／支)和0.5ml溶液Ⅰ混合，使aFGF充分混悬后加等体积溶液Ⅱ，在模具中制成形状为圆柱形、半透明、乳白色复合物。将等体积溶液Ⅰ与溶液Ⅱ直接混合制备纤维蛋白凝胶。2、制做动物模型及分组：155只成年纯系Sprague-Dawley大鼠在全麻(10％水合氯醛腹腔注射)下切断右侧腓总神经胫前肌分支(距神经入肌点约1cm)，随机分为5组：修复神经植入aFGF组(NR+aFGFgel)：缝合神经外膜+胫前肌植入aFGF纤维蛋白凝胶(aFGF 25μg／只)；修复神经植入凝胶组(NR+gel)：缝合神经外膜+胫前肌植入纤维蛋白凝胶；未修复神经植入aFGF组(aFGFgel)：胫前肌植入aFGF纤维蛋白凝胶(aFGF 25μg／只)；单纯修复神经组(NR)：缝合神经外膜；未修复神经未植入组(Blank)：神经肌肉不做处理。NR+gel、NR、Blank为三个对照组。术后观察6周。3、形态学研究：采用肉眼形态学检查观察肌肉的外观形态，测量胫前肌湿重，采用氯化金法染色显示运动终板，采用超薄切片、铅铀染色、透射电镜观察运动终板超微结构，统计各组运动终板均数及其退变率并进行统计学分析。观察aFGF纤维蛋白凝胶在体内的降解及异常反应。4、机能学研究：采用Karnovsky-Roots亚铁氰化铜法显示运动终板乙酰胆碱酯酶(AchE)，观察各组运动终板AchE变化情况。退变终板计数：每例随机观察30个运动终板，计数Ache染色显示活性减弱的运动终板数量并进行统计学分析。图像分析：染色切片在400X光镜下经摄像头摄入，利用计算机图像分析软件计算运动终板Ache平均染色面积及灰度值，每例随机测10个运动终板，取均数。采用诱发电位肌电图仪进行神经低频重复电刺激检测：刺激坐骨神经，记录胫前肌肌电波波幅，在脉冲电流刺激频率为3～5Hz的条件下连续刺激9次，观察有无衰减，以第五个肌电波波幅比第一个降低10％以上为阳性，统计各组第五次刺激肌电波波幅衰减率均数。5、机理研究：采用超薄切片、铅铀染色、透射电镜观察各组运动终板附近胫前肌肌卫星细胞的形态，每例随机观察20个超薄切片视野，统计肌卫星细胞数量并进行统计学分析。采用免疫组织化学染色检查aFGF受体(aFGFR)表达部位；统计每例aFGFR阳性血管表达率；图像分析仪测量毛细血管壁内aFGFR平均灰度。6、试验结果统计学分析：采用SPSS13.0软件包(第一军医大学生物统计学教研室)对结果进行统计学分析(计量资料采用One-WayANOVA进行分析，多重比较采用LSD法；计数资料采用R×C表资料的x~2检验进行分析)，差异显著性水准置于0.05。结果1、肉眼形态学检查：NR+aFGFgel组：自身对照可见两侧胫前肌对称且无明显肌萎缩，肌张力正常；NR+gel组及NR组表现相近：右侧胫前肌明显萎缩，肌张力下降；aFGFgel组：右侧胫前肌略有萎缩，但不如NR+gel组及NR组明显，肌张力消失；Blank组：右侧胫前肌明显萎缩，肌张力消失。NR+aFGFgel组、MR+gel组、aFGFgel组纤维蛋白凝胶植入局部组织无异常反应。2、胫前肌湿重：NR+aFGFgel组胫前肌湿重为1.26±0.10g，aFGFgel组胫前肌湿重为1.20±0.12g，两组胫前肌湿重高于三个对照组，统计学分析有显著性意义。3、终板染色检查：NR+aFGFgel组可见运动终板结构完整、形态正常；NR+gel组及NR组表现相近：失神经肌纤维上的终板形态不规则，轴索终末分支减少而杂乱，终板呈细条状或点状；aFgFgel组：未见轴突，运动终板形态大致正常，但区域缩小。Blank组：未见轴突，运动终板数量明显减少，形态不规则。4、电镜检查：NR+aFGFgel、aFGFgel组运动终板的数量较多，容易辨认，结构基本正常，运动终板退变例数少。三个对照组运动终板数量减少，结构退变，运动终板退变例数多。NR+aFGFgel组运动终板数量为12.00±2.24，aFGFgel组运动终板数量为11.40±1.14，两组运动终板数量高于三个对照组，统计学分析有显著性意义。NR+aFGFgel组运动终板退变率为26.67，aFGFgel组运动终板退变率为33．33，两组运动终板退变率低于三个对照组，统计学分析有显著性意义。5、神经低频重复电刺激检查：NR+aFGFgel组所有大鼠神经低频重复电刺激时没有出现大的肌电波波幅衰减反应，衰减率为5.70±3.13％，没有出现阳性情况；NR+gel、NR组大鼠低频电刺激时出现较大的肌电波波幅衰减反应，阳性率均为90％。NR+aFGFgel组衰减率低于对照组，统计学分析有显著性意义。6、运动终板AchE活性：NR+aFGFgel、aFGFgel组运动终板染色深，显示AchE活性强，结构接近正常，NR+aFGFgel组AchE染色面积为1693.98±168.16μm~2，灰度为24.81±1.44，aFGFgel组AchE染色面积为1520.60±303.00μm~2，灰度为24.93±1.54，AchE活性高于对照组，统计学分析有显著性意义；NR+aFGFgel组运动终板退变率为20.42％，aFGFgel组运动终板退变率为24.17％，运动终板退变率低于对照组，统计学分析有显著性意义。7、肌卫星细胞观察：NR+aFGFgel、aFGFgel组肌卫星细胞体积增大，数量多。NR+aFGFgel组MSC数量为11.00±3.00，aFGFgel组MSC数量为10.40±1.14，MSC数量高于对照组，统计学分析有显著意义。8、免疫组织化学检查：aFGFR阳性部位主要定位在毛细血管壁内，NR+aFGFgel、aFGFgel组显示毛细血管aFGFR表达密度高，毛细血管密集，对照组毛细血管aFGFR表达密度低，毛细血管稀少。NR+aFGFgel组毛细血管aFGFR表达阳性率为87.50％，aFGFgel组毛细血管aFGFR表达阳性率85.00％，两组aFGFR表达阳性率高于对照组，统计学分析有显著性意义。NR+aFGFgel组毛细血管壁aFGFR表达灰度为25.92±1.55，aFGFgel组毛细血管壁aFGFR表达灰度为26.85±1.23，两组毛细血管壁aFGFR表达量高于对照组，统计学分析有显著性意义。结论1、实验证实aFGF纤维蛋白凝胶可做为失神经支配运动终板及肌肉提供替代性神经营养的药物缓释系统，未见异常反应。2、联合神经修复及应用aFGF纤维蛋白凝胶可明显减轻大鼠运动神经损伤后运动终板退变，减轻肌萎缩。3、即使神经未及时修复，应用aFGF纤维蛋白凝胶可有效保护大鼠运动神经损伤后所支配的运动终板、减轻肌萎缩。4、神经重复电刺激检查神经肌肉问传导功能表明：运动神经损伤后联合神经修复及应用aFGF纤维蛋白凝胶保护运动终板可有效改善神经肌肉接头间传导。5、酶组织化学检查运动终板Ache活性表明：运动神经损伤后应用aFGF纤维蛋白凝胶保护运动终板可有效维持运动终板Ache活性，有利于神经递质的正常代谢，有利于神经冲动的正常传递。6、应用aFGF纤维蛋白凝胶处理组MSC数量高于对照组，说明aFGF纤维蛋白凝胶预防运动终板退变及肌萎缩的作用与aFGF促MSC增殖作用有关。7、应用aFGF纤维蛋白凝胶处理组运动终板附近分布了较多毛细血管，微循环良好；而未经aFGF纤维蛋白凝胶处理的运动终板附近毛细血管稀疏，微循环较差；说明aFGF具有明显的促血管形成及改善微循环作用。8、应用aFGF纤维蛋白凝胶处理组运动终板附近毛细血管aFGFR表达阳性率及表达量高于未经aFGF纤维蛋白凝胶处理组，进一步说明aFGF纤维蛋白凝胶预防运动终板退变及肌萎缩的途径在于其作用于毛细血管，改善运动终板附近微循环，弥补失神经支配肌的神经营养作用。9、本实验通过肌卫星细胞及运动终板附近微循环的形态观察提示给运动终板及肌肉人工提供“替代性”神经营养是防止失神经支配运动终板退变及肌萎缩的有效途径。
蔡进奎[3]2012年在《aFGF基因转染MSCs预防运动终板退变及肌萎缩研究》文中认为[研究背景]大量研究发现肌细胞正常结构与功能维持需要靠一些神经营养因子的作用。运动神经损伤后,骨骼肌失神经支配最大变化便是这种神经营养因子丢失,同时骨骼肌废用性萎缩,最终导致肌肉形态结构和生理生化等方面改变,组织形态学上表现为运动终板退变、肌细胞浆丢失、直径减小,并随时间延长而逐渐加重。目前关于运动神经损伤后功能重建主要还是集中在恢复神经连续性上,忽视了对其靶器官的保护,由于神经漫长的再生过程、再生过程中神经出现再退变、损伤部位阻挡因素、修复后肢体固定等原因,即使及时修复神经,肌肉失神经支配时间仍然很长,神经对肌肉的营养作用丧失,运动终板逐渐退变,给神经肌肉接头重建带来极大的困难。临床常见肌肉呈念珠状变性、横纹消失,肌肉萎缩,时间过长肌肉坏死、消失,而且肌肉失用、萎缩亦会影响运动终板的形态,二者之间形成恶性循环,成为目前严重阻碍运动神经修复后功能恢复的最重要因素之一,由此导致的肢体伤残严重损害患者的身心健康及劳动能力,给个人、家庭、社会带来沉重的负担。因此,致力于精确修复神经、促进神经生长同时应采取有效措施预防运动终板退变及肌萎缩已成为共识,如何预防失神经支配运动终板退变及肌萎缩已成为当前运动神经损伤后功能重建过程中急需解决的难题。近年来为了防止或延缓失神经支配后运动终板退变及肌萎缩,提高周围神经损伤的疗效,国内外学者从多个角度对其开展了研究,创造出一系列方法,包括：①被动锻炼；②神经纤维、神经元肌肉内植入；③脉冲式磁疗、电刺激；④药物：各种神经生长因子、激素等。被动锻炼是临床上最常用的方法,有研究证实,采取被动活动能促使瘫痪肌肉被动性缩短和拉长,这样做一方面促进了肌肉血液循环,减轻组织水肿,缩短了血液中氧和营养物质与肌细胞间的弥散距离,另一方面通过机械性肌纤维拉长与缩短,使肌肉保持一定弹性,防止关节僵硬、废用性骨质疏松与肌萎缩,为再生的神经纤维到达靶器官做准备,但临床上实现常会遇见一些困难,如修复神经早期、骨折早期等常需施行早期固定肢体,加之患者长期被动锻炼难以持久配合,常造成退变不可避免[4-6]。脉冲磁疗、电刺激预防终板退变及肌萎缩观点被越来越多临床医生接受,并把电刺激、磁疗逐渐应用于临床。Shimada、Boonyarom等发现磁疗、电刺激可明显减轻神经损伤后肌细胞的凋亡、增加Ⅰ型肌纤维和Ⅱ型肌纤维直径、减缓肌肉重量的减轻,从而延缓运动终板退变及肌萎缩。但由于设备难以普及、临床疗效缓慢且不确切等原因,临床上推广并不顺利。近年在药物研究方面取得了一些显著成果：国内外研究显示神经断端间应用神经生长因子(NGF)或肝细胞生长因子(HGF)可减轻运动终板退变,其作用机理可能通过轴浆运输与靶器官相应受体结合来实现,然而神经断端间应用药物仅适应于Seddon分类Ⅲ度神经损伤,对适合于非手术疗法治疗者或Seddon分类Ⅰ、Ⅱ度神经损伤无法采用,且神经断端间使用缓释系统难度大,无法保证药物的长效作用,研究前景暗淡[10-15]。口服氨哮素可以防止失神经支配后运动终板退变、肌肉萎缩,其作用可能是通过某种途径使MSCs产生一种胰岛素样生长因子(IGF)的营养物质模仿神经对肌肉的营养作用。有作者报道地塞米松有保护膜性结构的作用,大鼠腹腔注射可以减缓非离断性损伤神经支配运动终板的退变,但地塞米松系激素类药物,长期应用副作用明显,仅限于实验研究,不宜长期应用于神经损伤患者,临床应用前景暗淡。基因治疗是近年来一门新兴学科,它是指将外源基因导入靶细胞并有效表达,通过移植靶细胞达到治疗疾病目的。基因治疗常常需要借用干细胞来携带外源基因,MSCs就是常用干细胞之一,它于1961年就被Mauro等首次在蛙骨骼肌中发现,是一种具有增殖和自我更新能力的成肌前体细胞或肌源性干细胞,在出生后骨骼肌损伤修复和维持中起着重要的作用。有研究报道：肌肉失神经支配后初期MSCs数量增加,但以后其数量明显降低、体积缩小,长期失神经支配MSCs增生潜力显著降低,MSCs数量逐渐减少,部分研究认为这种进行性降低是由于失神经支配状态下MSCs发生了凋亡,因为神经的营养作用对维持MSCs含量和功能是非常重要。Viguie等推测其下降的原因为：长期失神经支配MSCs凋亡后无再生替代、MSCs合并到萎缩或新生肌纤维中的速度快于其增殖的速度。根据这一变化,许多学者认为MSCs数量的逐渐减少是影响长期失神经支配后骨骼肌功能恢复的一个重要原因。人们通过对骨骼肌再生过程研究发现,生长因子参与MSCs不同细胞周期的调节。利用细胞培养技术,已经检测出多种生长因子影响MSCs的生长调节,它们或者单独作用,或者多种细胞因子联合作用,研究较多的有以下几种生长因子：体外培养发现,IGF(胰岛素样生长因子)-Ⅰ和IGF-Ⅱ可以增加MSCs的增殖和分化,给细胞注射IGF-Ⅰ,可促进MSCs增殖和肌肉数量的增加肝细胞生长因子(HGF)对MSCs的调节作用表现在多个方面,包括作为一个潜在的趋化因子、MSCs的激活因子和成纤维细胞分化的抑制因子,HGF能激活和有选择性地促使MSCs增殖；Yablonka-Reuveni等证实FGF可促进幼年鼠及成年鼠MSCs增殖；McFarland等在对MSCs培养中发现FGF家族对MSCs增殖的详细作用,在FGF家族9种常见亚型中,FGF-1(即aFGF)、FGF-2、FGF-4、FGF-6和FGF-9被证实可以刺激MSCs增殖,同时HGF和FGF-2、FGF-4、FGF-6或FGF-9的协同作用,能提高增殖效率。Kastner, Dong等也在不同时期分别报道aFGF能促进MSCs增殖和分裂,本课题组在前期aFGF蛋白缓释系统保护运动终板及预防肌萎缩亦观察到aFGF具有维持MSCs数量作。基于以上理论和实验基础,我们认为MSCs与aFGF二者关系密切,拟行aFGF基因转染MSCs,然后通过移植来预防运动终板退变及肌萎缩,目的在于持久有效维持失神经支配期间骨骼肌神经营养作用,同时稳定骨骼肌MSCs数量,试图从根本上有效预防运动终板退变及肌萎缩,从而提高运动神经损伤修复效果。[目的]1.探索MSCs分离、纯化、培养及鉴定方法。2.探讨aFGF基因转染MSCs方法,检测其表达情况。3.研究移植aFGF基因转染的MSCs预防失神经支配运动终板退变及肌萎缩作用。[方法]1.MSCs分离、培养及鉴定：取Wister成年大鼠后肢肌肉,两步酶消化法结合差速贴壁培养法分离纯化MSCs,观察细胞生长特性并做免疫组织化学鉴定；2.真核表达载体构建：提取人类肌肉组织总RNA,RT-PCR法调取aFGF基因,然后用无模板自扩增技术合成人类白细胞介素2信号肽序列(signal peptide sequence, SPS),通过基因融合得到SPS-aFGF,再通过定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,最终得到重组质粒PEGFP-Nl-SPS-aFGF,对重组质粒做测序和酶切鉴定；3.体外实验分组、基因转染及检测表达情况：经鉴定正确的细胞随机分为3组：目的基因组(aFGF+N1)、空载质粒组(N1)、空白对照组(Blank),前两组分别加入质粒PEGFP-N1-SPS-aFGF与pEGFP-N1质粒,空白对照组不加入任何质粒,均在脂质体Lipofectamine2000TM Reagent介导下转染,转染后荧光显微镜统计发绿色荧光的细胞占各组细胞比例,计算转染效率；转染2天后更换为含有G418的生长培养基进行稳定筛选；转染72h后利用实时荧光定量PCR与Western blot检测aFGF基因在MSCs中表达情况。4.动物神经损伤模型制作及检测移植细胞疗效：40只成年纯系Wister大鼠在全麻(10%水合氯醛腹腔注射)下切断右侧腓总神经胫前肌分支(距神经入肌点约1.5cm),缝合神经外膜,然后将大鼠随机分为4组：A组：胫前肌植入(aFGF+N1)组细胞；B组：胫前肌植入(N1)组细胞；C组：胫前肌植入(Blank)组细胞；D组：植入等量生理盐水。A组为实验组,B组、C组、D组为对照组,术后观察4周,4周后肉眼观察肌肉的外观形态、测量肌肉湿重、氯化金染色观察运动终板形态、诱发电位肌电图仪进行神经低频重复电刺激检测运动终板传导功能,具体方法为刺激坐骨神经,记录胫前肌肌电波波幅,在脉冲电流刺激频率为3-5Hz的条件下连续刺激9次,观察有无衰减,以第5个肌电波波幅比第一个降低10%以上为阳性,统计各组第五次刺激肌电波波幅衰减率均数。[结果]1.分离纯化细胞经免疫组织化学鉴定为MSCs;2.构建携带有aFGF基因真核表达质粒测序结果与GenBank公布的序列一致,酶切鉴定条带与实际大小相符；荧光显微镜观察到细胞转染6h后即有绿色荧光发出,荧光强度和表达细胞总数在72h达到高峰,传代后仍可观察到绿色荧光蛋白表达；G418筛选细胞最佳浓度为(?)00μg/ml,筛选30天仍然观察到存活细胞；转染后72h,实时荧光定量PCR结果显示目的基因组表达量平均相对比值(aFGF+N1)组(1464.96)显著高于N1组(1.016)、Blank组(1.000),差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测显示aFGF表达呈极强阳性,而N1组及Blank组aFGF表达极弱。3.肉眼观察到A组自身对照可见两侧胫前肌对称且无明显肌萎缩,肌张力正常；B组、C组表现相近：右侧胫前肌部分萎缩,肌张力下降；D组：右侧胫前肌明显萎缩,肌张力下降最明显。胫前肌湿重：A组胫前肌湿重为1.213±0.101g,B组胫前肌湿重为0.950±0.085g,C组胫前肌湿重0.932±0.070g,D组胫前肌湿重0.761±0.131g。A组明显高于三个对照组,统计学分析有显著性意义。神经低频重复电刺激检查：A组所有大鼠神经低频重复电刺激时没有出现大的肌电波波幅衰减反应,衰减率为6.01±1.50%,没有出现阳性情况；B组、C组大鼠低频电刺激时出现较大的肌电波波幅衰减反应,但不及D组,3组阳性率均为90%。A组衰减率低于对照组,统计学分析有显著性意义。终板染色检查：A组可见运动终板结构完整、形态正常：B组、C组表现相近：失神经支配的运动终板形态不规则,轴索终末分支减少而杂乱,终板呈细条状或点状；D组：未见轴突,运动终板数量明显减少,形态不规则。[结论]1.两步酶消化法结合差速贴壁法提取大鼠MSCs方法可行；2.真核表达载体构建正确,基因表达正常；3.aFGF基因转染MSCs预防运动终板退变及肌萎缩方法可行。
唐永祥[4]2012年在《bFGF对大鼠脊髓损伤后脊髓前角运动细胞及运动终板退变的影响》文中进行了进一步梳理目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脊髓损伤后脊髓远端运动神经元及运动终板退变的保护作用,并分析其可能的机制。方法：取SD大鼠45只,用完全随机法将大鼠分为三组：A组(假手术组,n=5)；B组(实验组,SCI后bFGF干预组,n=20)；C组(对照组,SCI后NS对照组,n=20)。又将不同观察时间1、2、4、8w把B组和C组随机各分为B1、B2、B3、B4和C1、C2、C3、C4组。B、C组建立SCI模型并置蛛网膜下腔导药管。A组仅打开椎板不损伤脊髓及置管。术后各时相(A组仅1w)行BBB评分后取脊髓组织及胫前肌行HE染色病理学观察、CGRP、AchE免疫组化染色,OD值进行统计分析。结果：1.BBB评分：B2>C2,B3>C3,B4>C4(P<0.05)；C4>C3>C2(P<0.05)。2.HE染色：SCI后B1组较C1组炎症反应轻；B2组神经元萎缩且炎症反应较C2组轻；B3组较C3组恢复较好；B4组较C4组疤痕形成少。3. CGRP OD值：脊髓：B1>C1,B2>C2,B3>C3,B4>C4(P<0.05)；C4>C3>C2(P<0.05)。胫前肌：B2>C2,B3>C3,B4>C4(P<0.05)；C4>C3>C2>C1(P<0.05)。4.AchE OD值：脊髓：B3>C3,B4>C4(P<0.05)；C4>C3>C2(P<0.05)。胫前肌：B3>C3,B4>C4(P<0.05)；C4>C3>C2(P<0.05)。结论：1.bFGF减少SCI后损伤远端前角运动神经元损伤可能与其减轻远端炎症反应有关。2.bFGF早期通过减轻SCI后脊髓远端前角运动神经元内CGRP和AchE的下降,后期促进前角运动神经元CGRP和AchE的表达从而保护运动终板,防止其退变,促进其恢复。
参考文献：
[1]. 周围神经损伤后神经、肌肉运动终板退变及再生的临床、实验研究[D]. 殷琦. 第四军医大学. 1991
[2]. aFGF预防失神经支配运动终板退变及肌萎缩的实验研究[D]. 杨绍安. 第一军医大学. 2007
[3]. aFGF基因转染MSCs预防运动终板退变及肌萎缩研究[D]. 蔡进奎. 南方医科大学. 2012
[4]. bFGF对大鼠脊髓损伤后脊髓前角运动细胞及运动终板退变的影响[D]. 唐永祥. 中南大学. 2012