（1.湖南省人民医院/湖南师范大学第一附属医院；2.长沙市妇幼保健院）
摘要：目的 先天性心脏病（Congenital heart disease，CHD）是婴幼儿心脏疾患中最常见的疾病。大多数CHD是由遗传因素和环境因素相互作用引起的多基因遗传病。本文探讨湖南地区汉族人群MTHFR基因C677T多态性与先天性心脏病的关系。方法 运用PCR+ Sanger测序技术检测湖南地区180例正常对照组及167例无血缘关系汉族人群先天性心脏病组中MTHFR SNP C677T多态性。结果 MTHFR SNP C677T 中T等位基因的频率在先天性心脏病人中为65.27%，正常人群中为44.44%。基因型频率和等位基因频率在先天性心脏病组和正常对照组间具有统计学意义（P<0.05）。结论 湖南地区汉族人群MTHFR基因C677T多态性与先天性心脏病具有相关性。
关键词： 先天性心脏病；MTHFR；基因多态性
先天性心脏病（CHD）是婴幼儿心脏疾患中最常见的疾病。它是指出生时就存在的心血管结构或功能异常，是由于胎儿时期心血管发育异常或发育障碍以及出生后应退化的组织未能退化造成的心血管畸形。除少数CHD 是由单基因突变和染色体畸变引起外，大多数 CHD 是由遗传因素和环境因素相互作用引起的多基因遗传病。大量研究结果提示，高同型半胱氨酸血症可能与CHD 的发生有关，而叶酸与同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）代谢密切相关。亚甲基四氢叶酸还原酶 （MTHFR）是叶酸和同型半胱氨酸（Hcy）代谢的关键酶之一。自1994年Goyette等首次将人类MTHFR基因成功克隆并定位以来，MTHFR基因及其多态性的研究引起了人们的广泛关注[1]。研究最多的关于MTHFR基因多态性是677位核苷酸的胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）置换[2]。已有研究报道，MTHFR参与高胱氨酸尿症[3]，阿尔茨海默病、抑郁症等神经精神类疾病的发生[4，5]。但在先天性心脏病的发生中研究较少，从分子遗传学水平明确致病基因遗传多态性及其在疾病中的作用，对于先天性心脏病的研究和治疗具有重要意义。因此，我们采用PCR+ Sanger测序和相关分析方法分析湖南汉族人群中MTHFR基因C677T多态位点在先天性心脏病与正常人群中的分布频率，研究MTHFR基因多态性与先天性心脏病的发病的关系，为先天性心脏病的精准诊断和治疗提供新的途径。
1.对象与方法
1.1 研究对象 所有研究对象均为2012-2017年湖南省人民医院收治的患者。其中对照组为经生物化学检查、胸片、心电图、超声心动图检查排除心脏疾患。CHD患者经过彩色多普勒超声或核磁共振成像确诊。总共180例正常和167例先天性心脏病患儿被收集。临床信息见表一。
根据本课题所收集到的正常对照及先天性心脏病患者临床资料，分析研究对象临床特征，在年龄，身高，脉搏，呼吸频率各项指标利用组与组直接t检验，其P>0.05，均无统计学意义。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA抽提 抽取外周血1mL，利用红细胞裂解去除红细胞，加核裂解液，SDS及蛋白酶K消化过夜后，利用酚氯仿淬提得到DNA。
1.2.2 PCR：UCSC查找MTHFR相关基因序列，利用在线引物设计软件Primer3（http：//primer3.ut.ee/）设计PCR引物，由上海生工生物工程技术公司合成。其引物相关序列分别5’-CTTTGAGGCTGACCTGAAGC-3’ （forward）and 5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’（reverse），PCR反应体系10ml：正反向引物各1ml（30ng/ml），2XPremix Ex Hotstar DNA polymerase Mix 5ml，去离子水加至10ml。反应在PCR扩增仪上进行，PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳，嗅化乙锭染色，紫外灯下观察结果。
1.2.3 Sanger测序 PCR产物送湖南博尚测序公司进行测序，并利用DNA序列分析软件DNAstar进行结果比对。
1.3 统计学方法 所有统计学分析均采用SPSS11.5 分析软件，SNP位点的等位基因频率在组间的差异分析采用x2检验，以P < 0.05具有统计学意义。
2.结果
利用Sanger测序得到个样品碱基序列，分析MTHFR C677T位点碱基情况，如表3所示，其中各等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。在MTHFR C677T位点分析中，我们发现其C/C在对照组及先天性心脏病组中的基因型频率分别为80.56%及91.62%，C等位基因频率在正常对照及冠心病中分别为55.56%及34.73%，T等位基因频率在正常对照及冠心病中分别为44.44%及65.27%，根据卡方检验，均具有统计学意义（p<0.05）。说明在湖南地区汉族人群中，MTHFR 677 C > T 在先天性心脏病者群中T/T基因型明显多于正常对照人群，对照人群中C/C基因型明显多于冠心患者群（p<0.05），等位基因分布分析提示T 等位基因在先天性心脏病患者群中多见，携带MTHFR 677 C > T 等位基因的人群中先天性心脏病发生率明显增加（p<0.05）。。
3讨论
MTHFR 基因编码一个叶酸代谢的关键酶。该基因位于染色体1p36.22位置，具有12个外显子。该基因的缺失，可直接导致亚甲基四氢叶酸还原酶的缺失[6]。20世纪70年代，开始有亚甲基四氢叶酸还原酶的缺失病例的报道，表型从严重的神经系统病变、早期死亡到无症状的成年人。20世纪90年代，利用PCR，RT-PCR和单链构象多态性方法（SSCP），发现了一系列的突变与冠心病、神经管缺失、结肠癌、神经发育、男性不育等多种疾病相关。其中MTHFR-C677T是常见的MTHFR单核苷酸多态性基因。C677T位于MTHFR催化区域，这种功能性的突变直接影响MTHFR酶的活性和耐热性，表现为不同程度的酶活性和耐热性降低，与CC野生型相比，TT纯合子型活性降低70%，TC杂合子型活性降低35%。在对362例日本男性冠心病患者和778例正常对照人群的研究中，发现MTHFR-C677T多态在患者中有较高的频率[7]。相似的结果也在555例澳大利亚人群中发现。在对以色列，美国和荷兰人的研究中，发现MTHFR-C677T TT基因型的频率在神经管缺陷的病人中高于对照人群。但在英国人群中并没有发现TT 基因型在神经管缺陷的病人中与对照人群有差异[8]。这显示MTHFR-C677T多态性，在人种之间可能有差异性。相反，在肿瘤患者中，尤其是结肠癌和白血病患者中，这两种肿瘤快速增值的特性需要大量的DNA合成，因此对叶酸代谢的需求较高，有意思的是，MTHFR-C677T TT基因显示了保护作用[9]。
最近也有研究报道MTHFR基因 C677T在先天性心脏病中可能起重要作用[10]。利用PCR和限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）技术，证实MTHRF C677T多态可能是先天性心脏病的风险基因。也有研究报道利用高分辨率溶解曲线方法，在147例先天性心脏病患者研究中发现，MTHFR基因 C677T TT基因型在先天性心脏病患者中高于正常对照组，这与我们的研究结果一致。同时我们的研究结果显示中国人群中的T等位基因的频率在先天性心脏病人种为65.27%，正常人群中为44.44%。这与Wang等报道中中国人群频率接近[11]。PCR+PCR+测序是检测基因型和突变的金标准，随着测序技术的飞速发展，测序的成本大大降低，测序时间也缩短。因此PCR+测序技术将为临床应用提供了快速，准确的方法。
参考文献
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论文作者:刘震宇1,闫淑媛2
论文发表刊物:《航空军医》2017年第8期
论文发表时间:2017/6/26
标签：基因论文; 心脏病论文; 先天性论文; 多态性论文; 频率论文; 叶酸论文; 天性论文; 《航空军医》2017年第8期论文;