一、大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建（论文文献综述）
张可煜[1]（2013）在《喹烯酮体外细胞毒性机制解析》文中认为喹恶啉-1,4-二氧化物类（quinoxaline1,4-dioxide）兽药是全世界使用量最大的非激素类动物饲料添加剂。我国自主研发、国际首创的国家一类新兽药喹烯酮（quinocetone）属于该类药物。由于同类药物卡巴氧、喹乙醇等已被发现具有遗传毒性和潜在的致癌性，喹烯酮的安全性也备受关注。本研究从化学结构因素、氧化损伤、遗传毒性和基因调控水平的毒性机制等方面解析喹烯酮的体外细胞毒性机制，从而为正确合理评价喹烯酮的安全性提供依据。为解析喹烯酮细胞毒性的化学结构因素，本研究首先合成制备出喹烯酮、脱二氧喹烯酮以及它们的结构类似化合物等27个，并对其进行抗菌活性和细胞生长抑制作用的比较研究，结果发现：喹烯酮结构类似化合物的抗菌活力与喹烯酮相似，支链羟基修饰化合物抗菌活性还略优于喹烯酮，但母核脱氧后的化合物抗菌活性迅速消失殆尽；喹烯酮及其结构类似化合物对HepG2、Chang Liver、Vero等细胞的生长抑制作用都很大，远大于喹乙醇、MQCD等同类化合物，但所有母核脱氧化合物的细胞毒性也显着下降。结果证实喹烯酮母核N→O基团是其生物活性所必须，并且支链上双键、羰基对喹烯酮细胞毒性有重大影响。进一步利用LC/MS/MS技术对部分化合物在HepG2细胞内的代谢途径进行研究，结果发现：在体外细胞能通过母核脱氧、支链上双键和羰基还原等方式对喹烯酮进行代谢与解毒。这佐证了母核N→O基团与其支链上双键、羰基是共同构成喹烯酮细胞毒性大的主要化学因素。通过喹烯酮对HepG2细胞抗氧化系统的影响研究和胞内活性氧水平研究发现：喹烯酮能显着升高细胞内的活性氧水平，破坏细胞抗氧化系统，显着升高细胞丙二醛含量。而且谷胱甘肽的合成抑制剂能增强喹烯酮细胞毒性，但谷胱甘肽合成促进剂能降低喹烯酮细胞毒性。从而证实，氧化损伤是喹烯酮细胞毒性的重要方式。此外，喹烯酮还能够诱导HepG2细胞微核率增加，DNA随机扩增多态性增加以及细胞凋亡和细胞S期阻滞。采用双向消减杂交技术构建起喹烯酮暴露后细胞差异表达cDNA基因文库，结果发现：喹烯酮能致HepG2细胞160余基因差异表达，这些基因的功能主要涉及细胞代谢、药物代谢、氧化应激、蛋白合成、细胞周期调控以及细胞凋亡。应用Real-time PCR技术对部分重要功能基因进行验证和毒信号通路研究，结果发现基因表达趋势与消减杂交结果一致，而ENO1、AKR1C1、DDX5、AIFM、TNFRSF等基因表达量的变化提示喹烯酮可能通过线粒体或myc等途径导致细胞凋亡。综上结论，喹烯酮的细胞毒性机制是通过（1）在化学结构上，支链双键和羰基与母核N→O基团共同构成毒性基团，增大了喹烯酮的细胞毒性；（2）在作用方式上，喹烯酮母核脱氧产生的活性氧自由基，损伤抗氧化系统，损伤蛋白质、DNA等生物大分子，造成微核率增加，DNA扩增多态性增加等毒性；（3）在基因调控水平上，喹烯酮改变ENO1、AIFM、AKR1C1等基因表达量，可能激发线粒体和/或myc等细胞凋亡途径而完成其细胞毒性过程。
王士杰[2]（2011）在《茉莉酸甲酯诱导的人参发根培养及SSH文库构建研究》文中研究指明人参在中国有着几千年的药用历史,作为名贵药材和补品,在中医学及其他国家民族医学中一直占有重要地位。由于人参生长对环境的要求高,目前普遍采用伐林栽参方式进行人工栽培,对林地破坏严重,环境代价高昂,寻求替代资源成为解决这个难题的一个有效途径。人参发根由发根农杆菌（本实验采用A4菌株）侵染人参根外植体转化而成,属非天然植物。与传统的植物组织培养、细胞悬浮培养相比,植物发根具有生长速度快、活性物质含量高和遗传性状稳定等特点。人参发根培养目的之一就是要获得相对含量较高的人参皂苷,实现人参皂苷工厂化生产。发根中次级代谢产物含量受培养条件、营养因子、前体物和诱导子等因素影响,茉莉酸甲酯作为一种植物信号分子,能够促进次级代谢产物积累,提高发根中人参总皂苷的含量。随着生物工程的日益发展,应用代谢工程手段改变植物细胞生物合成途径,提高次级代谢产物产量已经逐渐成为研究热点。本文对人参发根三角瓶摇床培养进行考察,通过添加不同浓度的茉莉酸甲酯进行诱导,最终确定浓度在200μmol·L-1时效果最好,在一个培养周期内人参发根生物量增长13.82倍,人参发根总皂苷含量达到2.28%,比对照高35.71%。同时,我们使用实验室自行设计研制的发酵罐进行了人参发根培养实验,结果表明,人参发根在发酵罐中培养30天,生物量平均增长达到23.14倍,人参发根总皂苷含量达到2.04%,人参皂苷单体Rb1、Rd的含量比对照有较大提高,分别提高55.0%和30.1%。人参发根生长迅速,无需添加外源激素,次级代谢产物含量高,茉莉酸甲酯作为诱导子对于提高人参皂苷含量有明显的促进作用,同时表明经改进的发酵罐能够满足人参发根生长需要,有利于进行扩大培养。人参发根次级代谢产物人参皂苷的种类和含量的差异与生物合成途径中相关基因差异表达调控有关。为研究这些差异表达基因,本实验利用抑制消减杂交技术构建了以茉莉酸甲酯诱导的人参发根为检测子、以对照人参发根为驱动子的抑制消减文库（SSH文库）。采用Trizol法提取两种人参发根材料的总RNA,分离纯化,获得的高质量驱动子和检测子mRNA。采用Clontech公司SSH试剂盒进行差减杂交,构建的人参发根消减文库,经蓝白斑筛选出117个cDNA阳性克隆,文库的重组率在85%以上,满足文库构建要求,其中97个cDNA克隆测序成功。消减文库的差减效率检测表明将18S rRNA基因减弱了212倍,使差异表达cDNA也被富集了同样的倍数。菌落PCR结果表明文库的外源片段的长度分布在200～1,000 bp之间,平均片段长度在500 bp左右。结果表明：所构建的SSH文库在RNA提取质量、插入片断大小、重组率、消减效率等方面均符合文库的质量标准,能够满足下一步实验的要求。采用质粒提取试剂盒对文库中所有的阳性克隆进行质粒DNA提取。对人参发根构建的抑制消减杂交cDNA文库中的97个EST克隆测序,其数据经过手动去除载体序列,Seqman序列拼接组装,Blastx、Blastn和Interproscan的注释,结合GO功能分类,完成对EST序列统计分析。结果显示：对成功测序的有效克隆进行聚类分析,发现有5个重叠群和79个单拷贝EST,代表了共计84个独立基因。基因注释及功能分类结果表明：已知功能的唯一序列共53个,占63.1%,未知功能唯一序列31个,占36.9%。对84个唯一序列进行功能分类,得到11类。其中有16个克隆与代谢途径相关；31个未知基因；5个克隆与压力反应有关；6个克隆与生物合成有关；7个克隆与tRNA修饰,GTPase,离子结合相关；5个克隆与蛋白质折叠水解有关；1个克隆与转录调控有关；4个克隆与信号传导有关；4个克隆与分泌途径有关；2个克隆与电子传递有关；3个克隆与细胞组织结构有关。对人参皂苷合成相关的EST序列PRB3、PRB6进行分析,在Genebank上进行同源蛋白比对得到两个同源性达到97%的基因编码产物,分别是鲨烯合酶和鲨烯环氧酶,查找开放阅读框,并进行保守区预测。人参发根SSH文库构建成功,获得了在MeJA诱导下的差异表达基因,对人参皂苷合成途径中关键酶和关键基因的克隆、表达以及新基因的发现和功能研究奠定了物质基础。
董辉[3]（2009）在《巨型艾美耳球虫早熟株生物学特性及其相关基因研究》文中研究指明鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害极为严重的全球性寄生虫病,目前仍以药物防治为主。由于球虫耐药性的普遍存在及畜禽产品药物残留等问题,免疫预防在球虫病防控中的作用与地位日显突出。球虫早熟株具有潜在期明显缩短、致病性减弱、繁殖能力降低、免疫原性较好等独特的生物学特性。由早熟株卵囊研制成的球虫弱毒活苗是当前球虫病免疫预防的主要手段,在鸡球虫病的控制中发挥了重要作用。过去对早熟株的研究主要集中在对其致病性、免疫原性、繁殖能力等基本生物学特性及免疫应用方面,而在基因、蛋白质水平上的研究极其有限。本文以鸡场中普遍存在的、危害严重的、免疫原性最强的巨型艾美耳球虫为对象,经早熟株选育获得了一遗传特性稳定的E. maxima早熟株,并对其生物学特性进行了系统研究;首次构建了E. maxima早熟株与母株孢子化卵囊消减cDNA文库,并采用cDNA微阵列技术筛选早熟株与母株孢子化卵囊的差异表达基因,发现一批球虫早熟株差异表达新基因的信息,分析显示一些差异表达基因可能与球虫的入侵、表型等相关。1 E. maxima早熟株的选育及其生物学特性研究经过连续17代的早熟株选育,E. maxima的潜在期由母株的142h缩短至107h,缩短了35h。早熟株卵囊的长、宽及大小均比母株的小,且差异显着（P<0.05）;卵囊指数比母株的稍大,但差异不显着（ P>0.05）。早熟株的卵囊繁殖能力较母株的低,排卵囊高峰出现在接种后第6 d,较母株提前1d。在同等剂量之下,早熟株的致病性低于母株,但免疫保护力和免疫原性与母株的相当。早熟株经5代放松选择传代后,其致病性、卵囊繁殖能力、排卵囊规律等没有出现“返强”现象,表明该早熟株具有较好的遗传稳定性。早熟株的选育成功,为球虫早熟株弱毒疫苗的研制以及早熟株相关基因的筛选提供重要材料。2早熟株与母株孢子化卵囊消减cDNA文库的构建利用SSH技术,分别以早熟株与母株孢子化卵囊cDNA为tester或driver,进行正向和反向消减,首次构建了2个E. maxima早熟株与母株的消减cDNA文库。从2个文库中随机挑取100个克隆,经PCR鉴定,2个文库的重组率分别为98%和97%,大部分克隆的插入片段都在500 bp以上,大小不一,表明成功构建了消减cDNA文库,为进一步的球虫早熟株相关差异表达基因的筛选提供了条件。3 cDNA微阵列技术筛选早熟株与母株孢子化卵囊差异表达基因首次应用cDNA微阵列技术从消减cDNA文库中筛选早熟株与母株差异表达基因。从构建的正向和反向消减cDNA文库中,随机挑取3164个克隆制成cDNA微阵列,每个克隆重复点样三次。早熟株和母株各取2份样本进行生物学重复杂交分析,每份样本进行正反标记,共制作了4张芯片。芯片杂交结果显示,第一批样本正反标都同时呈现表达差异的基因克隆共726个,第二批样本差异表达共519个,两批样本中正反标同时呈现表达差异的克隆共426个,以母株为对照,早熟株表达下调克隆314个,上调有112个。对所有426个差异表达克隆进行测序,结果获得了360个有效的ESTs。对这360个ESTs进行UniGene基因归并,得到54条clusters,包括15条contigs和39条singletons。对获得的54个clusters进行BLASTX同源比对,有16个与已知蛋白有较高的同源性,其中包括5个球虫蛋白、4个其它顶复器门原虫蛋白、3个病毒蛋白以及4个其他物种蛋白。同源蛋白主要包括丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）、阳离子转运ATP酶（ cation-transporting ATPase ）、菱形蛋白（ rhomboid-like protein）、衣壳蛋白、核心蛋白、反转录转座子蛋白、晶状体相关蛋白、斑联蛋白、红血球凝聚素酯酶等。生物信息学功能分析提示这些clusters所编码的蛋白可能与球虫的入侵、致病性、耐药性、细胞内外离子浓度调节等相关。另38个clusters未发现有同源蛋白,可能是球虫的新基因,它们在球虫中的作用有待深入研究。为验证芯片杂交结果,选择8个基因进行实时定量PCR分析,结果与芯片一致。本研究分析了E. maxima早熟株和母株孢子化卵囊的差异表达基因,获得一批重要差异表达基因的信息,为进一步开展差异表达基因的克隆、鉴定及生物学功能分析等奠定了基础。4早熟株与母株孢子化卵囊差异表达新基因全长cDNA的克隆与分析根据差异表达基因的ESTs序列设计引物,利用RACE技术扩增,获得了5个E. maxima早熟株差异表达新基因的全长cDNA,其中早熟株表达上调基因1个,下调基因4个。利用生物信息学分析软件对新基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、疏水性、保守功能域及同源性等进行了分析预测。A29基因编码的蛋白分子量约为18 kDa,有1个信号肽、2个疏水区以及2个跨膜结构,与E. acervulina阳离子转运ATP酶（cation- transporting ATPase）在1～83位氨基酸具有81%的相似性,推测该基因与细胞内外阳离子浓度的调节、球虫耐药性等相关。A41基因编码的蛋白分子量约为28 kDa,具有6个疏水区、1个信号肽、6个跨膜结构及1个rhomboid superfamily保守结构域,与E. tenella菱形样蛋白（rhomboid-like protein）有91%的相似性,推测该基因与球虫的入侵、毒力等相关。A74基因编码的蛋白分子量约为22 kDa,有1个疏水区和1个SERPIN superfamily功能结构域,与E. acervulina serpin和E. tenella SERPIN1protein precursor分别有91%和82%的相似性,推测该基因与球虫的入侵相关。A78基因编码的蛋白有1个信号肽和2个疏水区,无跨膜结构;B71基因编码的蛋白蛋白有1个疏水区,无信号肽和跨膜结构;BLASTp比对均未发现有同源蛋白,提示它们可能是球虫的新基因,其在球虫生长发育中的作用有待深入探讨。5早熟株差异表达基因serpin在大肠杆菌中的表达将获得的E. maxima早熟株差异表达新基因A74全长cDNA连接到原核表达载体pGEX-4T-2中,成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-A74,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达,重组蛋白以包涵体形式存在,用GST resin对该重组融合蛋白进行了纯化,Western-blot分析表明该重组蛋白都具较好的抗原性。Serpin基因的克隆、表达为开展该基因的生物学功能等研究提供了基础。综上,本文选育的E. maxima早熟株为球虫弱毒疫苗的研制提供了重要材料,早熟株与母株孢子化卵囊差异表达基因的研究为分离、鉴定与球虫早熟株独特特性相关的关键分子、从分子水平上阐明球虫早熟株独特特性的遗传学基础提供了重要基础,为探讨顶复器门原虫生活史的调控机制提供了重要思路。
冯同富[4]（2008）在《卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究》文中指出卵巢上皮癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。临床上,以铂类为基础的联合化疗是其最重要和最主要的治疗方法。尽管在化疗的最初阶段,卵巢上皮癌对抗癌药物表现出较好的敏感性,但是随着化疗的进行其逐渐获得多药耐药性,因而其五年生存率一直徘徊在30—50%。为了更好的认识卵巢癌的多药耐药机制,我们用卡铂对卵巢浆液性囊腺癌细胞SKOV3进行间断、大剂量冲击,建立了卵巢癌耐药细胞株SKOV3/CB,并且从蛋白和基因两个水平筛选、鉴定了两种细胞间的差异分子。第一部分:卵巢上皮癌铂类耐药细胞株相关生物学指标的检测验证研究目的:对铂类耐药细胞株SKOV3/CB进行相关生物学指标的检测验证。方法:MTT法检测SKOV3/CB对卡铂的耐药指数及对CTX、5-FU、ADM、VP-16、泰素和DDP的交叉耐药性;采用21天细胞计数法绘制细胞的生长曲线并计算其倍增时间;流式细胞术检测细胞的凋亡率和周期分布。结果:SKOV3/CB对卡铂的RI为3.09,对CTX、VP-16、泰素和DDP有不同程度的耐药性,但对5-FU和ADM仍然敏感;同SKOV3相比其凋亡率和S期细胞明显增加,但生长速度却显着降低。结论:SKOV3/CB表现出典型的多药耐药特征,该耐药模型十分稳定达到了后续的蛋白和基因实验的实验要求。第二部分:卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白筛选鉴定研究研究目的:比较卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的蛋白表达差异,并进行相关蛋白的筛选和鉴定。方法:提取卵巢癌耐卡铂细胞SKOV3/CB和亲本细胞SKOV3的总蛋白,用蛋白二维液相分离色谱技术(ProtemeLabTMPF-2D)总蛋白进行分级分离,然后用其自带的Proteovue和Deltavue分析软件进行两种细胞间差异蛋白的筛选;用电喷雾离子化串联质谱（ESI-MS/MS）结合数据库比对进行差异蛋白的鉴定。结果:共分离筛选出差异蛋白54个,其中SKOV3/CB表达上调的34个,SKOV3表达上调的20个。鉴定出SKOV3/CB比SKOV3表达上调的差异蛋白15个,即人假想镁离子转运体（humanputative magnesium transporter protein,HPT）、人亮氨酸拉链样蛋白（Leucinezipper-like protein）、超氧化物歧化酶-1（Superoxide dismutase,SOD-1）、硫氧还原蛋白（Thioredoxin,Trx）、Immunoglobulin heavy chain variable region、SMYD2、周期蛋白依赖激酶6抑制因子（cyclin-dependent kinase 6 inhibitor）、MYL9（Myosinregulatory light polypeptide 9）、垂体腺苷酸环化酶促多肽（pituitary adenylatecyclase-activating polypeptide,PACAP）、stanniocalcin homolog、G蛋白信号通路的调节因子（human regulator of G-protein signalling,RGS）、T cell receptor betachain、TADAl protein和AX887247 NID。这些蛋白涉及离子转运、信号转导、氧化还原、增殖分化、免疫、甲基化、周期和凋亡调控等多方面。结论:PF-2D结合ESI-MS/MS是一种进行能够差异蛋白筛选、鉴定的有效方法。鉴定出的蛋白通过多种复杂机制介导了卵巢癌对铂类的耐药性的产生,这些蛋白有可能成为疗效预测分子或新的治疗靶标。第三部分:卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达基因筛选鉴定研究研究目的:比较卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的基因表达差异,并进行相关基因的筛选和鉴定。方法:采用人类全基因组表达谱芯片对卵巢癌耐卡铂细胞SKOV3/CB和亲本细胞SKOV3进行差异基因的筛选和分析;用半定量逆转录聚合酶联反应（RT-PCR）对芯片结果进行核对验证。结果:共分离筛选出差异基因3506个,SKOV3/CB比SKOV3上调的差异基因共有1712个,其中上调10倍以上的共有163个,SKOV3比SKOV3/CB上调的差异基因共有1794个,其中上调10倍以上的共有70个。SKOV3/CB比SKOV3上调10倍以上的6个差异基因,即ANXA6、UGDH、ZNF198、ERCC5、TWIST2和BIRC3经半定量RT-PCR验证,表明上述6个基因在耐药细胞株中的表达的确高于敏感细胞株,证明基因芯片的结果是可信的。结论:基因芯片是分析肿瘤差异基因的一种高通量的强有力工具。卵巢癌的多药耐药是一个多种基因参与的复杂过程。
邓柏林[5]（2007）在《旋毛虫感染诱导的SP2/0骨髓瘤细胞基因表达变化的研究》文中提出为探索旋毛虫感染诱导的SP2/0骨髓瘤细胞基因表达变化,本研究首先以2×106个/小鼠皮下接种SP2/0细胞,再以450条/小鼠口腔感染旋毛虫的Balb/c实验鼠,检测了小鼠的抑瘤指标,建立了适用于旋毛虫感染诱导抗SP2/0骨髓瘤细胞实体瘤动物模型,然后以该模型实验组和对照组瘤体为研究对象,分别提取瘤组织mRNA,采用SSH技术构建旋毛虫感染诱导的差异基因文库。反向Northern Blot技术进行筛选鉴定。阳性差异表达基因测序,结果提交GeneBank同源性对比分析。最后对所获得的部分已知功能基因和未知功能基因进行实时荧光定量RT-PCR和RT-PCR验证。结果该模型旋毛虫感染组能够显着提高机体对肿瘤的免疫力,肿瘤组间大小差异极显着（P<0.01）,完全符合SSH技术对实验材料的要求。成功构建了旋毛虫感染后诱导SP2/0骨髓瘤细胞上调基因表达消减文库,克隆的目的基因片段大小分布在180-850bp之间,Differential Screening确认的20个阳性差异基因经测序BLAST比对,获得差异表达的已知功能基因15个和未知功能基因12个。其中以MRPL41、NKTR、RbAp48、QRS、ANXA2等基因为可能与骨髓瘤细胞的生长抑制有密切得关系。荧光定量RCR验证结果表明MRPL41基因mRNA表达水平在旋毛虫感染组上调,提示在旋毛虫感染诱导的MRPL41基因表达发生变化与肿瘤的抑制作用相关。RT-PCR所验证的未知功能基因的表达趋势与差减文库表达谱趋势一致。本研究为深入探讨旋毛虫感染诱导SP2/0骨髓瘤细胞基因表达变化与旋毛虫抗肿瘤机理的研究奠定了基础。
刘媛媛[6]（2007）在《卵巢癌多药耐药差异表达基因的验证》文中研究表明卵巢癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,它的5年存活率低。其重要原因之一是肿瘤细胞的多药耐药现象。为了探讨卵巢上皮癌铂类耐药机理,本课题组前期采用FDD-PCR方法筛选卵巢上皮癌铂类耐药细胞和敏感细胞系中差异表达基因。结果显示①S4:Homosapiens mitochondrion②a17:5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase③actin-related protein 3 homolog mRNA④s16:rihosomal protein L35a mRNA⑤s20:replication protein A2 mRNA⑥s23:basictranscription factor 3（BTF3）mRNA⑦a5:thymosin,beta10（TMSB10）mRNA⑧a13:esterase D/formylglutathione hydrolase（ESD）⑨a26:mitochondrion基因片段为各种耐药细胞系共存且与亲本敏感细胞间有表达差异的基因。本实验进一步验证上述差异表达基因及P73、WWOX基因在卵巢癌耐药和敏感细胞（组织）的表达,并探讨其与卵巢癌多药耐药和卵巢癌临床病理之间的关系。最后采用RNA干扰阻断WWOX基因表达的体外实验研究。1、卵巢上皮癌铂类耐药细胞和敏感细胞系中差异基因的表达:同时运用RT-PCR和Northern blot方法检测上述9条差异表达基因在卵巢癌耐药和敏感细胞中的表达,结果Northern杂交仅仅得到的四条基因片段（a17、a32、s23、s16）的mRNA表达信息,没有检测到其余5条基因的表达情况。其中a17和a32仅仅在卵巢癌耐药细胞中表达,而S16、S23基因在卵巢癌某些敏感和耐药细胞中表达,两种方法验证的结果一致,暗示这些基因与肿瘤多药耐药有联系。根据他们的生物学特性,我们推测a17基因使药物代谢灭活增加导致了肿瘤的耐药;S16是通过导致细胞毒性损坏从而参与了多药耐药的发生。而因为没有关于a32和s23的生物学信息作为参考,我们尚不能推测其通过哪方面参与了多药耐药的发生。2、卵巢癌多药耐药差异表达基因在卵巢肿瘤组织中的表达及其临床意义:采用RT-PCR方法对卵巢肿瘤及对照组织中的上述基因表达进行了检测,旨在探讨这些差异表达基因的表达上调或下凋是否与临床多药耐药现象相吻合以及其临床意义。结果显示,S4、S16、S20、S23、a5、a26、a13、a32基因片段的高表达与卵巢癌化疗铂类耐药之间可能存在着某些联系。通过他们的生物学特征我们推测a13、a17通过参与药物代谢过程、a26通过抑制肿瘤细胞凋亡和改变线粒体膜渗透性、s16通过参与细胞毒性损坏、s20通过参与DNA损伤修复从而导致了多药耐药。而a5、a17、s4、a32、s23的功能尚未明确。且S4、S23、a5、a13、a32的高表达与卵巢癌的高转移和进展有关,其中我们推测a5高表达导致了肌动蛋白骨架的断裂导致了肿瘤细胞的转移。a17、a26、s16、s20与卵巢癌的临床病理特征无关,考虑这几种基因可以成为卵巢癌耐药的指标,却与进展无关。3、P73基因在卵巢肿瘤组织和卵巢上皮癌耐药细胞系中的表达及其临床意义:采用RT-PCR和northern blot方法检测P73基因在卵巢肿瘤组织中和铂类药物敏感和耐药的卵巢上皮癌细胞系中的表达变化,旨在探讨其与多药耐药的相关性和临床意义。结果显示P73的表达与卵巢癌的临床分期、组织学类型、病情进展程度及患者预后无关。P73基因在卵巢癌耐药细胞株中的表达为高,考虑是否同时存在着P53的突变,P53的突变异构体使P73的功能失活才导致的耐药。WWOX基因在卵巢肿瘤组织和卵巢上皮癌耐药细胞系中的表达及其临床意义:采用RT-PCR和northern blot方法检测WWOX基因在卵巢肿瘤组织中和铂类药物敏感和耐药的卵巢上皮癌细胞系中的表达变化,旨在探讨其与多药耐药的相关性和临床意义。RT-PCR结果显示WWOX基因在卵巢癌敏感细胞系A2780中表达丰度均高于耐药细胞系,认为WWOX不介导多药耐药。而WWOX在敏感细胞系SKOV3中不表达,但是相对应的耐药细胞表达却明显增高,这个结论却与之前的推论背道而驰。我们考虑与这两种细胞耐药性不同有关。Northern杂交的结果反应出WWOX基因在两种卵巢癌敏感细胞中表达丰度均大于耐药细胞株,暗示WWOX基因不诱导产生卵巢癌的多药耐药。WWOX在卵巢肿瘤及对照组织中的检测的结果显示WWOX在卵巢癌铂类耐药组织中的表达阳性率和表达量明显高于敏感组织,但是无统计学意义。本实验结果尚不支持WWOX作为一个抑癌基因的看法,但是提示WWOX基因的表达与卵巢癌的发生和进展有一定的关系,与国外部分观点符合。5、RNA干扰阻断WWOX基因表达的体外实验研究:本章采用针对WWOX基因的特异性小分子干扰RNA,转染进卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/SB,从基因角度探索逆转卵巢癌细胞多药耐药的途径,以期恢复卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。进一步探讨WWOX是否作为抑癌基因,并且也将为WWOX基因参与肿瘤的基因诊断及治疗提供新的思路。转染了WWOX的干扰片段后,SKOV3-SB的耐药下降,说明了WWOX很可能参与了耐药。功能实验结果提示WWOX通过增强肿瘤细胞自身修复,抵御化疗药物的损伤的作用及发挥类似药物输出泵的作用参与了耐药的发生。RNAi结果与前一章结果相反,考虑与实验误差有关,因为瞬时转染虽然可以抑制基因的表达,但对于干扰的长期有效性尚无实验结论,需要在后续实验中通过长效表达载体实验中做进一步验证。从结果来看,虽然本实验结果验证了与卵巢癌多药耐药有关的一些基因,并且也推测了他们参与多药耐药的途径,但是这仅仅作为一种假设。我们还要进一步系统研究这些耐药相关因子在耐药发生过程中所起的作用,以期在未来建立对耐药性状具有准确预测能力的计算机耐药模型,对于临床上耐药卵巢癌患者的个体化治疗方案的制订和实施,从根本上解决耐药问题,是非常必要的。
于艳杰[7]（2007）在《陆地棉花粉氮离子注入诱变效应及机理研究》文中研究表明离子束生物工程技术是一种新的生物技术,它通过离子束注入生物细胞,来研究其生物学效应和作用机理,用于诱变育种和基因工程等方面。1986年首次将离子束注入技术应用于诱变育种,通过离子束注入诱变,在多种植物、微生物中已获得各种不同类型的突变体。但是,离子注入对细胞的作用机理尚不清楚,离子的穿透能力很弱,离子能否进入生物细胞及诱发基因发生突变仍然是有争议的问题。本文主要研究氮离子束注入棉花花粉引起的生物学效应。本研究采用能量为20keV的低能氮离子,分别以不同剂量(100单位(0.26×1016N+/cm2)、150单位(0.39×1016N+/cm2)、200单位(0.52×1016N+/cm2)、300单位(0.78×1016N+/cm2))的氮离子注入陆地棉（Gossypium hirsutum）品种苏棉12号的成熟花粉,用处理花粉授粉,收获种子。对处理花粉的活力、花粉表面结构、内部结构的变化、花粉萌发率、花粉管在花柱中的生长速度、受精情况等进行系统分析。用SSR分子标记的方法检测了离子注入花粉对于授粉后胚珠DNA变异的程度,用抑制性消减杂交法分析离子注入花粉授粉后代的基因表达差异。并分析离子注入花粉授粉后的农艺形状变异。主要结果如下。用花粉原位萌发法、联苯胺-甲萘酚染色法、花粉管快速萌发法、FDA法（荧光素二醋酸脂法）、TTC（2,3,5-氯代三苯基四氮唑）染色法、离体萌发法等6种方法分别测定对照花粉、抽真空处理花粉及N+注入后的棉花花粉活力。TTC染色法不能有效检测自然花粉及N+注入后的花粉的活力,测定结果均为0%。除了TTC染色法外,其它5种方法均能测定自然花粉的活力,测定结果均为98%左右。花粉管快速萌发法不能准确测定经抽真空处理后的花粉的活力。抽真空处理对花粉的活力无明显影响。联苯胺-甲萘酚染色法、花粉管快速萌发法、TTC染色法、离体萌发法等4种方法均不能用来准确测定N+注入后的棉花花粉活力。FDA荧光染色法测定的花粉活力结果稳定,重复性好,与原位萌发法测定的结果一致,是快速测定经N+注入处理后的棉花花粉活力的简便方法。N+注入花粉后,随着离子注入剂量的增加,花粉活力呈明显下降趋势。通过荧光显微镜观察棉花花粉活体原位萌发（柱头上萌发）和离体条件下的原位萌发状况,建立准确的观察花粉粒在柱头上的萌发和花柱中花粉管的生长状况的简便的方法,并找出棉花花粉萌发的最适培养温度。结果表明:花粉在原位和离体情况下的原位萌发时间是基本一致的。活体原位萌发在授粉1 h后极个别的花粉粒开始萌发,4 h后柱头上的花粉粒全部萌发。12 h后大量的花粉管生长至花柱基部;离体原位萌发在授粉2 h后开始有花粉粒萌发,13 h后大量的花粉管长至花柱基部。授粉后,活体原位萌发较原位萌发晚1b。此外,在花粉管生长的同时,花柱也在生长。花粉萌发的合适培养温度为25-35℃。而在培养温度为30℃时,花柱中花粉管数量最多。通过扫描电镜、透射电镜、原位萌发和石蜡切片等方法观察了N+注入棉花花粉后产生的各种变化,初步研究了不同剂量的N+注入棉花花粉的诱变机理及诱变后产生的一系列生物学效应。结果表明:随着离子注入剂量的增大,离子注入使表面结构破损的花粉粒的数量逐渐增加,离子注入对于花粉表面有明显的刻蚀作用,可产生不同大小和深度的孔洞和裂缝;花粉粒内涵物的量逐渐减少,排列致密性降低;离子注入剂量越高,花粉粒内部出现的空隙越多,造粉质体的体积变大,数量也越多;离子注入会明显降低花粉的萌发率;N+注入花粉授粉后,花柱中花粉管的数量明显下降,注入剂量愈大,花柱中花粉管的数量愈少,对照花粉授粉后花粉管的数量为:320±42条,剂量为100单位、150单位、200单位和300单位的N离子注入花粉后,花粉管的数量分别为:145±19.8、114±12.7、94±11.4和51.3±11条。离子注入不影响授粉后雌雄配子受精。不同处理的花粉管生长速度是一致的,授粉后13小时,花粉管都能生长至花柱基部。不同剂量处理的花粉粒萌发后的受精时间是一致的。N+注入花粉授粉后,对子房的生长有明显的影响,子房重量和直径都随注入剂的增加而降低。剂量为100单位、200单位和300单位的N+注入花粉授粉后,SSR分子标记结果表明,胚珠的DNA多态性发生一定程度的改变。剂量为300单位的N+注入花粉授粉后,SSH分析获得1个与已知功能基因同源序列,与EST库中的序列同源的4条EST序列。离子注入花粉授粉后成铃率降低,对M1代农艺形状也产生变异,但变异程度是随机的,与离子注入剂量之间无一定的规律。本研究结果充分说明N+注入花粉,会通过刻蚀作用进入细胞使细胞结构发生改变,改变细胞内的遗传物质,降低花粉的活力,降低子房的生长速度,使后代农艺形状发生变异,产生明显的生物学效应。
刘琴[8]（2007）在《东方巴贝斯虫cDNA文库构建及其应用》文中指出东方巴贝斯虫（Babesia orientalis）是一种经镰形扇头蜱传播的重要血液原虫，是由本实验室发现和命名的一个巴贝斯虫新种，主要引起水牛巴贝斯虫病。该病在我国长江以南许多省份发生和流行，临床上患病牛以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为特征，甚至引起死亡，造成重大的经济损失。本研究首先进行了B．orientalis的分子分类学研究，在此基础上建立了B．orientalis的半巢式PCR诊断方法，然后构建了B．orientalis cDNA文库，以该文库为基础，进行了B．orientalis EST序列的测定和分析，并进一步克隆和原核表达了东方巴贝斯虫热休克蛋白70（HSP70）基因。（1） B．orientalis分子分类学研究利用真核生物18S rRNA通用引物扩增了B．orientalis 18S rRNA基因。测序后BLAST分析表明该虫种属巴贝斯虫。将该基因1，700bp长片段序列与GenBank中15种已知巴贝斯虫的相应序列进行比较分析，建立系统发育树。结果表明，B．orientalis与南非未定种的巴贝斯虫亲缘关系最近，与羊巴贝斯虫亲缘关系较近，与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的亲缘关系较远。这一结果从分子生物学上进一步证实了东方巴贝斯虫是一独立种。（2） B．orientalis半巢式PCR诊断方法的建立与应用根据B．orientalis 18S rRNA基因V4多变区设计引物，建立了检测B．orientalis的半巢式PCR（semi-nested PCR），特异性扩增B．orientalis 18S rRNA基因257bp的片段，敏感性试验表明其敏感性达到0.00000012％。运用建立好的半巢式PCR与传统的姬姆萨染色显微镜检的方法对湖北长江以南4个巴贝斯虫病疫区121份水牛血样，385份镰形扇头蜱样品及湖北长江以北3个巴贝斯虫病非疫区71份水牛血样进行了检测，检测结果为：湖北长江以南4个疫区，血液样品镜检5份阳性，半巢式PCR 24份阳性，蜱的样品半巢式PCR 35份阳性；湖北长江以北3个非疫区镜检梨形虫17份阳性，半巢式PCR未检测到阳性样品。针对上述检测结果，利用18S rRNA通用引物扩增非疫区的17份阳性模板，测序后分析均为泰勒虫。实验结果表明：本试验建立的B．orientalis半巢式PCR检测方法具有很高的特异性和敏感度，是一个快速有效的检测方法。从流行病学调查的结果显示：B．orientalis在湖北长江以南广泛分布，流行严重。（3） B．orientalis cDNA文库的构建利用E．Z．N．ATM Blood RNA Kit提取纯化的红细胞期B．orientalis的总RNA，利用SMARTTM cDNA Library Construction Kit反转录合成cDNA第一链，LD-PCR扩增长片段cDNA，连接λTriplEx2噬菌体载体，利用Gigapack?ⅢGold Packaging Kit体外包装，构建了B．orientalis cDNA文库。对原初文库及扩增文库的质量和滴度的监测表明：文库的插入片段在0.5～3.0kb之间，蓝白斑实验表明其重组率约98.8％，原初文库的滴度为2.0×106pfu／mL，扩增文库的滴度为5.8×108pfu／mL。结果表明：成功的构建了B．orientalis cDNA文库。利用制备的抗B．orientalis兔血清对构建好的B．orientalis cDNA文库进行免疫学筛选，筛选到3个强阳性克隆子。测序后BLAST分析分别为：B．orientalis热休克蛋白70（HSP70）基因，核动蛋白（nuclear movement protein）基因及功能未知的假定蛋白（hypothetical protein）基因。（4） B．orientalis EST序列的测定及分析从B．orientalis cDNA文库中随机挑取噬菌斑，转染BW25.8，经PCR鉴定后送插入片段大于300bp的阳性克隆子测序，共测定了324条B．orientalis EST序列，对有效EST序列运用phrap等软件进行拼接，聚类后BLAST分析，得到46个同源性较高的unigene，这些基因分别为：类红细胞表面抗原、类裂殖体表面抗原、代谢相关的磷酸酶及蛋白酶、核糖体蛋白、热休克蛋白70、类热休克蛋白90、肌动蛋白、锌指蛋白等基因的部分或全基因及功能未知的假定蛋白（hypothetical protein）基因部分或全基因。（5） B．orientalis HSP70基因的克隆与原核表达根据EST测序的结果，设计一对特异性扩增B．orientalis HSP70基因开放性读码框（ORF）的引物，克隆了B．orientalis HSP70的ORF全长基因，构建原核表达质粒pGEX-KG-HSP70，在E．coli BL21-CodonPlus中实现了高效表达，表达产物经Western-blot检测分析，结果表明原核表达的HSP70具有较强的免疫反应原性。本研究对B．orientalis的分子分类学研究，从分子水平证实了B．orientalis是一独立的新种。建立的半巢式PCR诊断方法，解决了目前水牛巴贝斯虫病不易准确诊断的难题，对水牛巴贝斯虫病的临床诊断、流行病学调查等具有重要意义。本研究构建的B．orientalis的cDNA文库、EST序列的测定以及HSP70基因的克隆和原核表达为进一步进行B．orientalis分子生物学的研究，获得免疫原性基因和其他基因信息以及水牛巴贝斯虫病的免疫预防、致病机制等研究奠定良好的基础。
翟军军[9]（2007）在《柔嫩艾美耳球虫杨凌株cDNA文库的免疫学筛选及其3-1E基因的克隆与表达》文中指出鸡球虫病是由一种或几种鸡艾美耳球虫引起的以肠道病变为主要特征的细胞内寄生虫病,严重危害养鸡业的发展。在各种艾美耳球虫中,寄生在盲肠中的柔嫩艾美耳球虫致病性最强。目前,控制球虫病主要依靠化学药物。然而,由于球虫对许多抗球虫药出现了严重的抗药性,加之药物或抗生素在家禽产品中的残留问题越来越受到消费者的关注,迫使人们寻求防治的新途径。本研究采用免疫学方法对本实验室已经构建的柔嫩艾美耳球虫杨凌株（Eimeria tenella YL）子孢子cDNA表达文库进行筛选,并对克隆的抗原基因进行表达、功能分析和动物免疫保护试验,获得了以下结果。1.利用E. tenella YL阳性血清和兔抗鸡E. tenella YL阳性血清对E. tenella YL子孢子cDNA表达文库进行免疫学筛选,共获得3个阳性克隆,经鉴定,其中一个阳性克隆基因的开放阅读框（ORF）长为513 bp,共编码170个氨基酸。登陆GenBank比较发现,与已报道的E. tenella甘肃株（GS）和E. tenella美国株（US）的3-1E基因ORF序列同源性分别为99.8%和99.4%,与二者氨基酸的同源性分别为98.8%和98.2%,由此确定所获得的目的基因为E. tenella YL的一个新基因。该新基因在GenBank的登录号为:EF069437,被命名为:Eimeria tenella strain YL 3-1E。2.按照pGEX-4T-1载体的特点和克隆位点,设计了含EcoR I和Xho I酶切位点的3-1E基因的特异性表达引物,将3-1E基因克隆到pGEX-4T-1表达载体中,构建了pGEX-3-1E的融合表达的重组载体,转化BL21寄主菌并诱导表达, SDS-PAGE蛋白电泳分析显示,成功地表达了约44.7 ku的融合蛋白,与预测的分子质量大小一致,表达量达到30.0%以上。3.用获得的重组表达抗原免疫雏鸡,观察其对球虫感染的免疫保护效果,结果表明,以可溶性形式表达的重组抗原pGEX-3-1E免疫保护效果相对较好,而pGEX-3-1E包涵体免疫保护效果相对较差。这为研制鸡球虫的基因工程疫苗奠定了基础。
林青[10]（2006）在《柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建及其主要抗原基因的克隆与表达》文中研究表明顶复门都是由原生动物组成的寄生虫,它包含了一些重要的兽医寄生虫和医学寄生虫（如艾美耳球虫、疟原虫、巴贝斯虫、弓形虫、隐孢子虫、住肉孢子虫）。在各种寄生虫感染中,寄生在细胞内的艾美耳属球虫是主要制约现代家禽生产的一种原虫病。艾美耳球虫病不仅威胁家禽的健康和生命安全,而且在全球范围内可导致严重的经济损失。在各种艾美耳球虫中,寄生在盲肠中的柔嫩艾美耳球虫致病性最强。尽管采用了一些免疫学、生物技术学和遗传学的方法,但目前控制球虫病仍然主要依靠抗球虫的化学药物来预防。然而,由于许多抗球虫药出现了严重的抗药性而使用受限。加之药物或抗生素在家禽产品中的残留问题越来越受到消费者的关注,迫使人们寻求防治的新途径。在众多控制球虫的方法中,免疫学防治前景诱人。本研究选取柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）子孢子构建其cDNA表达文库,从中筛选、克隆免疫原基因,并进行表达、功能分析和动物免疫保护试验,获得了以下结果。1.用纯化的E. tenella杨凌株（YL）孢子化卵囊口服接种感染雏鸡,制备鸡抗E. tenella YL株阳性血清;用纯化的E. tenella YL株孢子化卵囊作为抗原,裂解后加佐剂乳化后免疫家兔,制备兔抗鸡E. tenella YL株阳性血清。结果表明,二者均可用于E. tenella cDNA表达文库的免疫学筛选。2.以E. tenella YL株孢子化卵囊为材料,首次用λSCREEN载体成功构建了E. tenella子孢子cDNA表达文库。经测定,库容量约为4×106 pfu/mL。能用特异性引物扩增出E. tenella子孢子表面抗原3-1E基因,说明文库质量高、代表性强。3.从cDNA表达文库中扩增得到鸡E. tenella YL 3-1E基因。利用生物信息学和分子生物学软件对3-1E基因编码的蛋白进行结构预测,表明该蛋白为一结构松散的球状蛋白。将3-1E基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-3-1E重组质粒并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表明成功的表达出了分子质量为44.7 ku的融合蛋白。该研究为球虫基因工程疫苗的研制奠定了基础,也表明了所构建的E. tenella YL子孢子cDNA表达文库质量较高。4.利用E. tenella YL株阳性血清和兔抗鸡E. tenella YL株阳性血清对E. tenella子孢子cDNA表达文库进行免疫学筛选,共获得3个阳性克隆,经鉴定,其中一个阳性克隆基因的阅读框（ORF）长为1 029 bp,共编码342个氨基酸。登陆GenBank比较,和已发表的MIC-2基因有很高的同源性,与已报道的E. tenella豪顿株（HT）和E. tenella北京株（BJ）的MIC-2基因ORF序列同源性分别为99.7%和99.8%,与二者氨基酸的
二、大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建（论文提纲范文）
（1）喹烯酮体外细胞毒性机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 喹恶啉-1,4-二氧化合物 |
| 1.1.1 喹恶啉-1,4-二氧化合物在养殖业的应用 |
| 1.1.2 喹恶啉-1,4-二氧化合物的毒性 |
| 1.1.3 喹恶啉-1,4-二氧化合物的抗菌、低氧选择活性 |
| 1.1.4 喹恶啉-1,4-二氧化合物化学合成 |
| 1.2 用 HepG2 细胞系检测遗传毒性 |
| 1.2.1 HepG2 细胞外源化合物代谢酶活性 |
| 1.2.2 新的作用终点 |
| 1.2.3 HepG2 细胞转染以及新的肝细胞系对遗传毒性潜在的价值 |
| 1.3 DNA 的损伤与核苷切除修复 |
| 1.4 RAPD 分析在遗传毒理学研究中的应用 |
| 1.4.1 RAPD 技术的优、缺点 |
| 1.4.2 RAPD 技术的优化 |
| 1.4.3 RAPD 技术在遗传毒理学中的应用 |
| 1.4.4 RAPD 结果的意义 |
| 1.5 表达谱在毒理学的应用 |
| 1.5.1 全 mRNA 谱 |
| 1.5.2 全蛋白质谱 |
| 1.5.3 全 mRNA 和蛋白表达谱的比较 |
| 1.5.4 表达谱和药物开发 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 第二章 喹烯酮类化合物的合成研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.2.3 目标化合物的合成 |
| 2.2.4 合成化合物的分析鉴定 |
| 2.2.5 供试化合物含量测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目标化合物结构表征 |
| 2.3.2 化合物的纯度测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 喹烯酮结构类似物的合成 |
| 2.4.2 喹恶啉-1,4-二氧化合物母核脱氧方式 |
| 2.4.3 新型喹恶啉-1,4-二氧化合物研究 |
| 第三章 喹烯酮类化合物对细菌和细胞生长抑制作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 供试菌种 |
| 3.2.2 供试细胞 |
| 3.2.3 供试化合物 |
| 3.2.4 主要试验仪器 |
| 3.2.5 主要试剂和培养基及其配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 供试化合物的配制 |
| 3.3.2 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定 |
| 3.3.3 细胞增殖抑制率的测定 |
| 3.3.4 细胞对喹烯酮毒效应的适应性 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 供试化合物的 MIC |
| 3.4.2 供试化合物的 MBC |
| 3.4.3 化合物对对细胞生长的抑制作用 |
| 3.4.4 细胞对喹烯酮毒效应的适应性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 化合物的抗菌效果 |
| 3.5.2 喹烯酮类似化合物抑制细胞生长作用 |
| 3.5.3 细胞对喹烯酮毒效应的适应性 |
| 3.5.4 喹烯酮类化合物的构效关系 |
| 第四章 喹烯酮类化合物在 HepG2 细胞内的代谢研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 供试细胞 |
| 4.2.2 供试化合物和试剂 |
| 4.2.3 主要试验仪器 |
| 4.2.4 体外细胞代谢系统 |
| 4.2.5 代谢物的分离鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 喹烯酮在细胞培养液中的代谢产物 |
| 4.3.2 脱二氧喹烯酮在细胞培养液中的代谢产物 |
| 4.3.3 MQCD 在细胞培养液中的代谢产物 |
| 4.3.4 喹胺醇在细胞培养液中的代谢产物 |
| 4.3.5 喹乙醇在细胞培养液中的代谢产物 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 喹烯酮等药物在 HepG2 细胞内的代谢特点 |
| 4.4.2 药物在 HepG2 细胞内代谢与毒性的关系 |
| 第五章 喹烯酮对细胞抗氧化系统的影响研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 供试细胞 |
| 5.2.2 供试化合物及试剂 |
| 5.2.3 主要试验仪器 |
| 5.2.4 细胞抗氧化物的检测 |
| 5.2.5 细胞内 ROS 的测定 |
| 5.2.6 BSO 等对喹烯酮细胞毒性的影响 |
| 5.2.7 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 各抗氧化系统的测定结果 |
| 5.3.2 细胞内 ROS 的测定 |
| 5.3.3 BSO 等预处理对喹烯酮细胞毒性的影响 |
| 5.3.4 BSO、NAC 与喹烯酮共刺激对细胞毒性的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 喹烯酮等对细胞氧化和抗氧化系统的影响 |
| 5.4.2 喹烯酮等对细胞内 ROS 的影响 |
| 5.4.3 BSO 等对喹烯酮细胞毒性的影响 |
| 第六章 喹烯酮及主要代谢物对 HepG2 细胞的遗传毒性研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 供试细胞 |
| 6.2.2 供试化合物及试剂 |
| 6.2.3 主要试验仪器 |
| 6.2.4 胞质分裂阻滞微核检测 |
| 6.2.5 DNA 随机扩增多态性检测（RAPD） |
| 6.2.6 Hoechst 染色检测细胞凋亡 |
| 6.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 微核检测结果 |
| 6.3.2 DNA 随机扩增多态性 |
| 6.3.3 细胞凋亡和细胞周期的变化 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 胞质分裂阻滞微核检测 |
| 6.4.2 喹烯酮对细胞 DNA 随机扩增的多态性影响 |
| 6.4.3 喹烯酮对细胞凋亡和细胞周期的影响 |
| 第七章 喹烯酮诱导 HepG2 细胞差异表达 cDNA 文库的构建 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 供试细胞 |
| 7.2.2 供试化合物及试剂 |
| 7.2.3 主要试验仪器 |
| 7.2.4 染毒与总 RNA 的提取 |
| 7.2.5 cDNA 消减文库的构建 |
| 7.2.6 重组质粒的菌液 PCR 鉴定 |
| 7.2.7 阳性克隆的测序及在线 BLAST 分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 总 RNA 的提取 |
| 7.3.2 双链 cDNA 的合成和 RasⅠ酶切效率的分析 |
| 7.3.3 接头连接效率的分析 |
| 7.3.4 巢式 PCR 显示双向消减结果 |
| 7.3.5 消减效率分析 |
| 7.3.6 消减 cDNA 文库重组率及插入片段长度分析 |
| 7.3.7 测序及序列分析 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 差异表达基因验证和毒信号通路的初步研究 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 材料和方法 |
| 8.2.1 供试细胞 |
| 8.2.2 供试化合物 |
| 8.2.3 主要试验仪器 |
| 8.2.4 引物 |
| 8.2.5 细胞染毒与分组引物 |
| 8.2.6 RNA 的提取及纯化 |
| 8.2.7 cDNA 的制备 |
| 8.2.8 荧光定量 PCR 反应 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 RNA 提取质量的检测 |
| 8.3.2 喹烯酮等药物对检测基因的调控作用 |
| 8.4 讨论 |
| 第九章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）茉莉酸甲酯诱导的人参发根培养及SSH文库构建研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本文主要英汉缩略语对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 人参和人参发根的研究 |
| 1.1.1 人参研究进展 |
| 1.1.2 人参发根研究现状 |
| 1.2 诱导子的研究进展 |
| 1.2.1 诱导子的定义和分类 |
| 1.2.2 诱导子调节植物次生代谢 |
| 1.2.3 诱导子作用机理 |
| 1.2.4 诱导子的作用效果 |
| 1.2.5 茉莉酸甲酯的诱导作用 |
| 1.3 生物信息学与表达序列标签 |
| 1.3.1 表达序列标签形成的原理 |
| 1.3.2 表达序列标签的应用 |
| 1.4 差异基因表达技术 |
| 1.4.1 SSH文库构建的原理与方法 |
| 1.4.2 cDNA末端快速扩增技术 |
| 1.4.3 差异显示反转录PCR |
| 1.4.4 基因表达指纹 |
| 1.4.5 基因表达系统分析 |
| 1.5 人参皂苷生物合成途径 |
| 1.6 本论文研究的内容和意义 |
| 1.7 本研究的主要技术路线 |
| 第二章 人参发根的发酵罐培养 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 人参发根检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 人参发根诱导和继代培养 |
| 2.3.2 诱导子MeJA对发根生长的影响 |
| 2.3.3 发酵罐培养 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 人参发根SSH文库构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 人参发根总RNA和mRNA |
| 3.3.2 反转录及酶切效率检测 |
| 3.3.3 接头连接效率检测 |
| 3.3.4 SSH文库消减效率检测 |
| 3.3.5 SSH文库的质量分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 EST序列的生物信息学分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 EST分析方法 |
| 4.2.2 EST序列处理 |
| 4.2.3 相关程序和分析软件 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 聚类分析 |
| 4.3.2 EST同源性分析 |
| 4.3.3 EST功能分析和预测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）巨型艾美耳球虫早熟株生物学特性及其相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 巨型艾美耳球虫概述 |
| 1.2 球虫早熟株研究进展 |
| 1.3 SSH 与cDNA 微阵列联合应用技术及其应用 |
| 第二章 巨型艾美耳球虫早熟株选育及相关生物学特性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 E. maxima 早熟株与母株孢子化卵囊抑制消减cDNA 文库构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 cDNA 微阵列技术筛选 E. maxima 早熟株差异表达基因 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 E. maxima 早熟株与母株孢子化卵囊 差异表达基因的克隆与分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 E.maxima 早熟株差异表达基因serpin 在大肠杆菌中的表达 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 卵巢上皮癌多药耐药研究进展 |
| 1.卵巢上皮癌化疗概述 |
| 1.1 一线化疗药物及方案的选择 |
| 1.1.1 一线化疗的指征 |
| 1.1.2 一线化疗药物的选择 |
| 1.1.2.1 常规药物 |
| 1.1.2.2 新应用的药物 |
| 1.1.3 一线化疗方案的选择 |
| 1.1.3.1 常用的一线化疗方案 |
| 1.1.3.2 实验中的一线化疗 |
| 1.1.3.3 腹腔化疗 |
| 1.1.3.4 维持或巩固化疗的临床价值 |
| 1.1.3.5 新辅助化疗 |
| 1.2 影响化疗疗效的临床病理因素 |
| 1.2.1 手术分期 |
| 1.2.2 细胞分化程度 |
| 1.2.3 病理类型 |
| 1.2.4 残余灶的大小 |
| 1.2.5 化疗的用药剂量 |
| 1.2.5.1 化疗剂量强度的影响 |
| 1.2.5.2 化疗总剂量的影响 |
| 1.2.5.3 化疗剂量密度的影响 |
| 1.2.6 肿瘤细胞产生耐药性 |
| 1.2.7 其它因素 |
| 1.2.8 影响腹腔化疗临床应用的因素 |
| 1.3 影响化疗疗效的分子病理因素 |
| 2.卵巢上皮癌多药耐药概述 |
| 2.1 卵巢癌多药耐药的分子机理 |
| 2.1.1 细胞内化疗药物浓度降低 |
| 2.1.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加 |
| 2.1.3 DNA损伤修复能力增加 |
| 2.1.4 抗凋亡能力增加 |
| 2.1.5 p53基因突变 |
| 2.1.6 信号传导通路 |
| 2.1.7 其它机制 |
| 2.2 卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 2.3 卵巢癌多药耐药的治疗 |
| 2.3.1 卵巢癌多药耐药的分型及治疗原则和目的 |
| 2.3.1.1 卵巢癌多药耐药的分型 |
| 2.3.1.2 卵巢癌多药耐药的治疗原则 |
| 2.3.1.3 治疗的目标及价值 |
| 2.3.2 多药耐药的化疗 |
| 2.3.2.1 二线化疗药物及方案的选择及疗效评价 |
| 2.3.2.2 常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗 |
| 2.3.2.3 自体骨髓移植加大剂量化疗在卵巢癌多药耐药治疗中的应用 |
| 2.3.3 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 2.3.4 多药耐药的增敏治疗 |
| 2.3.5 多药耐药的手术治疗 |
| 2.3.6 多药耐药的的基因治疗 |
| 2.3.7 多药耐药的综合治疗方案筛选及临床验证 |
| 2.4.多药耐药的预防 |
| 3.卵巢癌多药耐药差异表达基因与蛋白的筛选鉴定 |
| 3.1 卵巢癌多药耐药差异表达基因与蛋白筛选鉴定的主要方法 |
| 3.1.1 卵巢癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定的主要方法 |
| 3.1.1.1 基因芯片技术 |
| 3.1.1.2 DDRT—PCT |
| 3.1.1.3 比较基因组杂交法 |
| 3.1.1.4 表达序列标签 |
| 3.1.1.5 基因表达的系列分析 |
| 3.1.1.6 消减杂交基因克隆技术 |
| 3.1.1.7 差异显示技术衍生的方法 |
| 3.1.1.8 差异基因的鉴定技术 |
| 3.1.2 卵巢癌多药耐药差异表达蛋白筛选鉴定的主要方法 |
| 3.1.2.1 噬菌体全套抗体库技术 |
| 3.1.2.2 双向凝胶电泳 |
| 3.1.2.3 差异凝胶电泳泳 |
| 3.1.2.4 蛋白芯片表面增强激光解析/电离飞行时间质谱法 |
| 3.1.2.5 二维液相色谱法 |
| 3.1.2.6 同位素编码亲和标签 |
| 3.1.2.7 毛细管电泳技术 |
| 3.1.2.8 蛋白质鉴定分析技术 |
| 3.2 卵巢癌多药耐药差异表达基因与蛋白筛选鉴定现况 |
| 3.2.1 卵巢癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定现况 |
| 3.2.1.1 cDNA微阵列的应用 |
| 3.2.1.2 DD-PCR的应用 |
| 3.2.1.3 CGH的应用 |
| 3.2.1.4 SSH的应用 |
| 3.2.2 卵巢癌多药耐药差异表达蛋白筛选鉴定现况 |
| 3.2.2.1 2-DE的应用 |
| 3.2.2.2 DIGE的应用 |
| 3.2.2.3 Protein Chip/SELDT-TOF-MS的应用 |
| 3.2.2.4 ICAT的应用 |
| 3.3 结语 |
| 第二章 卵巢上皮癌铂类耐药细胞株相关生物学指标的检测验证 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞来源 |
| 2.1.2 主要药物及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞株的培养 |
| 2.2.2 耐药细胞株耐药指数的检测验证 |
| 2.3 交叉耐药性的检测验证 |
| 2.4 细胞生长曲线及倍增时间的检测 |
| 2.5 细胞生长周期的检测 |
| 2.6 细胞凋亡的检测 |
| 2.6.1 流式细胞仪检测细胞凋亡的原理 |
| 2.6.2 细胞凋亡率的检测 |
| 2.6.3 细胞凋亡的形态学观察 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 耐药株的形态学改变 |
| 3.2 耐药细胞的IC50及RI |
| 3.3 耐药细胞交叉耐药的IC50及RI |
| 3.4 细胞的生长曲线及倍增时间 |
| 3.5 细胞生长周期 |
| 3.6 细胞的凋亡率 |
| 3.7 细胞凋亡的形态学改变 |
| 4.讨论 |
| 第三章 卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白筛选鉴定研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 设备与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总蛋白的提取 |
| 2.2.2 Bradford法测定蛋白浓度 |
| 2.2.3 差异蛋白的分离 |
| 2.2.4 差异蛋白的筛选 |
| 2.2.5 差异蛋白的鉴定 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞总蛋白的浓度测定结果 |
| 3.1.1 BSA标准曲线的绘制 |
| 3.1.2 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞总蛋白的浓度 |
| 3.2 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞总蛋白一维分离结果 |
| 3.2.1 SKOV3细胞总蛋白一维分离结果 |
| 3.2.2 SKOV3/CB细胞总蛋白一维分离结果 |
| 3.2.3 SKOV3/CB-1和SKOV3-1一维分离结果对比 |
| 3.3 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞总蛋白二维分离结果 |
| 3.3.1 总蛋白的二维分离结果记录图 |
| 3.3.2 蛋白二维分离的良好重复性 |
| 3.4 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间差异表达蛋白筛选 |
| 3.4.1 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间差异蛋白记录图 |
| 3.4.2 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间的差异蛋白 |
| 3.5 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间差异表达蛋白鉴定 |
| 4.讨论 |
| 第四章 卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达基因筛选鉴定研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器及用具处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SKOV3/CB和SKOV3细胞间差异表达基因的筛选及生物信息学分析 |
| 2.2.2 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间差异表达基因的验证 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 SKOV3/CB细胞与SKOV3细胞的基因芯片结果 |
| 3.1.2 基因芯片荧光标记图分析结果 |
| 3.1.3 基因芯片结果的直方图分析结果 |
| 3.1.4 基因芯片杂交信强度散点图分析结果 |
| 3.1.5 基因芯片MA plot图分析结果 |
| 3.1.6 基因芯片分层聚类图分析结果 |
| 3.2 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间差异表达基因的筛选及生物信息学分析结果 |
| 3.2.1 SKOV3/CB细胞比SKOV3细胞上调的差异基因 |
| 3.2.2 SKOV3细胞比SKOV3/CB细胞上调的差异基因 |
| 3.2.3 SKOV3/CB细胞耐药相关基因的功能分类 |
| 3.2.4 进行RT-PCR验证的差异基因的确定 |
| 3.3 半定量RT-PCR验证差异表达基因mRNA在卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的表达结果分析 |
| 3.3.1 提取细胞RNA的浓度及质量检测 |
| 3.3.2 PCR循环次数的确定 |
| 3.3.3 ANXA6、UGDH、ZNFl98、ERCC5、TWIST2和BIRC3在SKOV3和SKOV3/CB中的表达 |
| 4.讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
（5）旋毛虫感染诱导的SP2/0骨髓瘤细胞基因表达变化的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 寄生虫抗肿瘤研究进展 |
| 1 肿瘤治疗研究现状 |
| 2 寄生虫抗肿瘤效应 |
| 3 旋毛虫抗肿瘤研究 |
| 4 结语 |
| 第二章 抑制消减杂交(SSH)技术在基因克隆方面的研究进展 |
| 1 SSH 的原理和技术路线 |
| 2 SSH 技术的评价 |
| 3 SSH 的应用研究进展 |
| 4 结语 |
| 第三章 抑癌基因的研究进展 |
| 1 抑癌基因的提出和发现 |
| 2 抑癌基因的作用模式 |
| 3 抑癌基因的性质和功能 |
| 4 抑癌基因的研究前景 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫感染诱导的抗SP2/0 骨髓瘤细胞动物模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 旋毛虫感染诱导的 SP2/0 骨髓瘤细胞消减 cDNA 文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 旋毛虫感染诱导的肿瘤细胞上调表达基因的筛选和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 荧光定量PCR 和RT-PCR 对已知和未知功能基因的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| CURRICULUM VITAE |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 附录 |
（6）卵巢癌多药耐药差异表达基因的验证（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章:前言(文献综述) |
| 第一部分 卵巢癌多药耐药研究的概述 |
| 1.卵巢癌多药耐药分子机理 |
| 1.1 细胞膜相关的耐药机制 |
| 1.2 细胞浆介导的耐药机制 |
| 1.3 细胞核相关的多药耐药机制 |
| 2 卵巢癌多药耐药临床病理特征 |
| 3.卵巢癌多药耐药的分子靶向治疗 |
| 3.1 卵巢癌多药耐药的基因治疗 |
| 3.2 以P-gp为靶来克服卵巢癌细胞的多药耐药 |
| 3.3 单克隆抗体 |
| 3.4 卵巢癌多药耐药的分子靶向化疗 |
| 第二部分:卵巢癌多药耐药的靶向基因及蛋白的筛选 |
| 1 卵巢癌多药耐药的靶向基因的筛选 |
| 1.1 筛选基因的方法和应用 |
| 1.2 筛选基因的临床价值和展望 |
| 2.卵巢癌多药耐药新的靶向蛋白的筛选 |
| 2.1 蛋白组学的概念和意义 |
| 2.2 蛋白组学的分类 |
| 2.3 差异表达蛋白质组学的常用技术及在筛选卵巢癌多药耐药靶向基因蛋白的应用 |
| 2.4 差异表达蛋白组学在卵巢癌多药耐药筛选中的临床价值 |
| 2.5 展望 |
| 第三部分 P73与卵巢癌多药耐药 |
| 1.P73的结构和生物学功能 |
| 1.1 P73的结构 |
| 1.2 P73的生物学功能 |
| 2.P73在卵巢癌发生中的作用 |
| 3.P73表达与卵巢癌临床病理的关系 |
| 4.P73在多药耐药中的作用及与卵巢癌多药耐药的临床病理关系 |
| 5.以P73为靶点的抗癌及多药耐药逆转治疗 |
| 第四部分 WWOX在卵巢癌多药耐药中的作用 |
| 1.WWOX的发现 |
| 2.WWOX的结构 |
| 3.WWOX与肿瘤发生 |
| 4.WWOX基因与肿瘤生长调节可能的机制 |
| 5.WWOX与卵巢癌多药耐药临床病理的关系 |
| 6.展望 |
| 第二章 卵巢上皮癌铂类耐药细胞和敏感细胞系中差异基因的表达的验证 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第三章 卵巢癌多药耐药差异表达基因在卵巢肿瘤组织中的表达极其临床意义 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第四章 P73基因mRNA在卵巢肿瘤组织和卵巢癌耐药细胞系中的表达及其临床意义 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第五章 WWOX基因mRNA在卵巢肿瘤组织和卵巢癌耐药细胞系中的表达及其临床意义 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第六章 RNA干扰阻断WWOX基因表达的体外实验研究 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
（7）陆地棉花粉氮离子注入诱变效应及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.棉花辐射诱变研究进展 |
| 1.1 栽培棉种及其品种的辐射敏感性 |
| 1.2 棉花不同发育阶段的辐射敏感性及其临界剂量 |
| 1.3 影响棉花辐射临界剂量的外界因素 |
| 1.4 辐射剂量与棉花的诱变效率 |
| 1.5 棉花的辐射诱变效应及其突变性状的遗传 |
| 2.植物辐射诱变研究进展 |
| 3.离子注入诱变研究进展及发展前景 |
| 3.1 离子注入诱变机理研究进展 |
| 3.2 离子注入诱变育种的进展 |
| 3.3 离子束诱变在作物育种中的应用及发展前景 |
| 4.作物花粉的辐射诱变进展 |
| 4.1 为遗传研究创造新的研究材料入(离子束辐照) |
| 4.2 辐照的偏母性遗传 |
| 4.3 辐射促进植物间的远缘杂交 |
| 4.4 提高突变频率,创造新类型 |
| 5.结束语 |
| 第二篇 研究报告 |
| 第一章 氮离子注入处理的棉花花粉活力测定方法研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 抽真空处理对花粉活力的影响 |
| 2.2 各种方法测定的N~+注入处理的花粉活力 |
| 3.结论与讨论 |
| 第二章 离子注入对花粉超微结构的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 离子注入对花粉的刻蚀作用 |
| 2.2 离子注入对花粉内部结构的影响效应 |
| 3.讨论 |
| 第三章 陆地棉花粉粒萌发和花粉管生长特性 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 活体原位萌发 |
| 2.2 离体原位萌发 |
| 2.3 花粉管在花柱中的生长速度与方式 |
| 2.4 不同温度条件下花粉的萌发及生长情况 |
| 3.讨论 |
| 第四章 花粉离子注入对花粉管生长及受精的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 花粉萌发率及花粉管生长 |
| 2.2 花粉管生长轨迹及受精 |
| 2.3 子房重量和直径 |
| 3.讨论 |
| 第五章 陆地棉花粉离子注入分子效应研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 SSR方法: |
| 2.结果 |
| 2.1 离子注入诱变分子特征 |
| 2.2 胚珠DNA多态性分析 |
| 3.讨论 |
| 第六章 离子注入后M_1代抑制性消减杂交CDNA文库构建 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 抑制消减杂交与cDNA文库构建 |
| 1.4 Vector Kit |
| 1.5 测序及序列比对 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 RNA分离和缩减cDNA文库的鉴定 |
| 2.2 序列分析 |
| 3.讨论 |
| 第七章 离子注入诱变后代农艺性状变异 |
| 1.试验方法 |
| 1.1 成铃率统计方法 |
| 1.2 铃重和纤维品质检测 |
| 1.3 M_1代农艺性状调查 |
| 2.结果 |
| 2.1 离子注入花粉授粉对棉铃性状的影响 |
| 2.2 M_1代农艺形状 |
| 3.讨论 |
| 全文结论 |
| 1.离子注入处理花粉活力测定方法 |
| 2.离子注入对花粉超微结构的影响 |
| 3.离子注入对花粉萌发及受精过程的影响 |
| 4.离子注入花粉授粉后对胚珠DNA多态性的影响 |
| 5.离子注入后代基因表达差异 |
| 6.离子注入花粉授粉后对棉铃发育及M_1代主要性状的影响 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（8）东方巴贝斯虫cDNA文库构建及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛的巴贝斯虫病研究进展 |
| 1.1.1 形态学及超微结构 |
| 1.1.2 传播媒介蜱 |
| 1.1.3 核酸组成及特点 |
| 1.1.4 侵入红细胞阶段原虫配体和宿主受体之间的分子作用 |
| 1.1.5 免疫机制 |
| 1.1.6 流行病学 |
| 1.1.7 诊断及治疗 |
| 1.1.8 免疫预防 |
| 1.2 cDNA文库的研究进展 |
| 1.2.1 cDNA文库的载体系统 |
| 1.2.2 cDNA文库的构建方法进展 |
| 1.2.3 寄生虫cDNA文库的研究 |
| 1.2.4 蜱的cDNA文库的研究 |
| 1.3 EST技术及其应用 |
| 1.3.1 EST技术的原理和步骤 |
| 1.3.2 EST技术的应用 |
| 1.3.3 EST在寄生虫基因研究中的应用 |
| 第二章 东方巴贝斯虫18S rRNA基因的克隆和系统发育分析 |
| 2.1 研究的目的意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PCR扩增水牛巴贝斯虫18S rRNA基因 |
| 2.3.2 水牛巴贝斯虫18S rRNA全基因序列的测定及与GenBank数据库中其它巴贝斯虫序列的比较 |
| 2.3.3 系统发生树 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 东方巴贝斯虫半巢氏PCR诊断方法的建立及应用 |
| 3.1 研究的目的意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 显微镜检查东方巴贝斯虫 |
| 3.3.2 semi-nested PCR检测结果 |
| 3.3.3 临床血液样品的检测 |
| 3.3.4 蜱样品的检测 |
| 3.3.5 SacII酶切鉴定 |
| 3.3.6 测序鉴定 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 东方巴贝斯虫cDNA文库的构建及初步鉴定 |
| 4.1 研究的目的意义 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 cDNA文库的构建 |
| 4.3.2 cDNA文库的免疫学筛选 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 东方巴贝斯虫表达序列标签(ESTs)的测定与分析 |
| 5.1 研究的目的意义 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 有效EST的获得 |
| 5.3.2 序列提交 |
| 5.3.3 片段重叠群分析及基因表达丰度分析 |
| 5.3.4 东方巴贝斯虫EST序列同源性分析 |
| 5.3.5 对已知功能基因的分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 东方巴贝斯虫HSP70基因的克隆与原核表达 |
| 6.1 研究的目的意义 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 试验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 基因的PCR扩增、克隆及序列测定 |
| 6.3.2 重组质粒在E.coli中的表达与表达产物分析鉴定 |
| 6.3.4 表达产物的存在形式 |
| 6.3.5 最佳诱导表达条件的确定 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（9）柔嫩艾美耳球虫杨凌株cDNA文库的免疫学筛选及其3-1E基因的克隆与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 寄生虫CDNA 文库的研究进展 |
| 1.1 CDNA 文库的构建 |
| 1.1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 |
| 1.1.2 对cDNA 文库的分析 |
| 1.2 CDNA 文库的类型 |
| 1.2.1 经典cDNA 文库 |
| 1.2.2 标准化cDNA 文库 |
| 1.2.3 消减cDNA 文库 |
| 1.2.4 染色体区域特异性cDNA 文库 |
| 1.2.5 PCR cDNA 文库与RACE cDNA 文库 |
| 1.2.6 固相cDNA 文库 |
| 1.3 CDNA 文库的应用 |
| 1.3.1 原虫 |
| 1.3.2 蠕虫 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 鸡球虫功能基因组学的研究进展 |
| 2.1 虫体的管家基因 |
| 2.1.1 rRNA 基因 |
| 2.1.2 热休克蛋白基因 |
| 2.2 阶段性虫体抗原基因 |
| 2.2.1 未孢子化卵囊 |
| 2.2.2 孢子化卵囊 |
| 2.2.3 子孢子 |
| 2.2.4 裂殖子 |
| 2.2.5 大配子体 |
| 2.3 细胞器抗原基因 |
| 2.3.1 棒状体 |
| 2.3.2 折光体 |
| 2.3.3 微线蛋白 |
| 2.4 虫体表面抗原基因 |
| 2.4.1 TA4 基因 |
| 2.4.2 3-1E 基因 |
| 2.4.3 cSZ1 基因 |
| 2.4.4 gx5401 基因 |
| 2.4.5 Eam 20 和Eam 45 基因 |
| 2.4.6 Omz5-7 基因 |
| 2.4.7 cmz-8 基因 |
| 2.4.8 1pmc-61f 基因 |
| 2.4.9 p 250 基因 |
| 第三章 球虫疫苗的研究进展 |
| 3.1 鸡球虫疫苗的种类 |
| 3.2 鸡球虫苗免疫的作用特点 |
| 3.3 鸡球虫苗的研究概况 |
| 3.3.1 强毒苗 |
| 3.3.2 弱毒苗 |
| 3.3.3 亚单位疫苗 |
| 3.3.4 重组疫苗 |
| 3.3.5 核酸疫苗 |
| 3.4 展望 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫CDNA 表达文库的免疫学筛选与基因克隆 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂、NC 膜和阳性血清 |
| 4.1.2 仪器和设备 |
| 4.1.3 培养液、培养基及溶液的配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 宿主菌的培养 |
| 4.2.2 噬菌体的准备 |
| 4.2.3 免疫学筛选 |
| 4.2.4 目的片段与克隆载体的连接 |
| 4.2.5 重组质粒的鉴定 |
| 4.2.6 目的片段的序列分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 阳性克隆的筛选结果 |
| 4.3.2 阳性噬斑PCR 扩增结果 |
| 4.3.3 阳性克隆的重组质粒鉴定结果 |
| 4.3.4 目的片段的序列测定及分析结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 3-1E 基因的表达与功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株、载体和酶 |
| 5.1.2 试剂、NC 膜和阳性血清 |
| 5.1.3 仪器与设备 |
| 5.1.4 培养基和溶液的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 3-1E 基因重组表达载体的构建 |
| 5.2.2 3-1E 基因的诱导表达 |
| 5.2.3 3-1E 基因表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测 |
| 5.2.4 3-1E 基因表达条件的优化 |
| 5.2.5 3-1E 基因编码蛋白结构的预测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组表达质粒pGEX-3-1E 的构建及鉴定 |
| 5.3.2 3-1E 基因表达产物SDS-PAGE 分析 |
| 5.3.3 不同诱导条件下基因编码蛋白的表达结果 |
| 5.3.4 3-1E 基因及其编码蛋白的结构预测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 外源蛋白质融合表达策略 |
| 5.4.2 外源蛋白质表达部位选择策略 |
| 5.4.3 生物信息学技术分析预测编码蛋白的结构与功能策略 |
| 5.4.4 3-1E 外源蛋白融合表达的特点 |
| 第六章 重组表达抗原对鸡球虫感染的免疫保护效果研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 可溶性蛋白的Western-blotting 分析结果 |
| 6.2.2 蛋白含量 |
| 6.2.3 增重变化 |
| 6.2.4 每克盲肠内容物卵囊数 |
| 6.2.5 盲肠病变记分情况 |
| 6.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语英汉对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建及其主要抗原基因的克隆与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 球虫病研究概况 |
| 1.1 球虫病研究简史 |
| 1.2 球虫的分类学 |
| 1.3 球虫卵囊形态特征 |
| 1.3.1 卵囊外形 |
| 1.3.2 卵囊大小 |
| 1.3.3 卵囊色泽 |
| 1.3.4 卵囊外膜 |
| 1.3.5 卵膜孔（微孔） |
| 1.3.6 卵囊残体 |
| 1.3.7 孢子囊 |
| 1.3.8 极粒 |
| 1.3.9 孢子囊残体 |
| 1.3.10 子孢子 |
| 1.4 球虫生活史 |
| 1.4.1 孢子生殖（Sporogony） |
| 1.4.2 裂殖生殖（shizogony） |
| 1.4.3 配子生殖（gametogony） |
| 第二章 球虫体外培养的研究进展 |
| 2.1 球虫的细胞培养 |
| 2.1.1 培养基 |
| 2.1.2 卵囊的制备 |
| 2.1.3 鸡肾细胞的制备 |
| 2.1.4 子孢子的制备、纯化及接种 |
| 2.1.5 各种艾美耳球虫在细胞培养基上的发育 |
| 2.1.6 细胞培养基上艾美耳球虫的发育过程 |
| 2.2 球虫在鸡胚中的培养 |
| 2.2.1 球虫在鸡胚中的发育及病理反应 |
| 2.2.2 影响球虫在鸡胚中发育的因素 |
| 2.3 结语 |
| 第三章 艾美耳球虫功能基因组的研究进展 |
| 3.1 功能基因组学的概念 |
| 3.2 功能基因组学研究的主要内容、意义及其方法 |
| 3.2.1 功能基因组学研究的主要内容 |
| 3.2.2 功能基因组学研究的意义 |
| 3.2.3 功能基因组学的研究方法 |
| 3.3 艾美耳球虫基因组 |
| 3.3.1 分子核型 |
| 3.3.2 基因组研究 |
| 3.3.3 鸡球虫基因的研究进展 |
| 第四章 鸡球虫免疫及疫苗的研究进展 |
| 4.1 鸡球虫的免疫原性 |
| 4.1.1 免疫原性 |
| 4.1.2 抗原分子及抗原基因的分析与鉴定 |
| 4.2 宿主的免疫应答作用与保护性免疫作用机制 |
| 4.2.1 免疫应答作用 |
| 4.2.2 宿主保护性免疫作用机制 |
| 4.3 交叉免疫问题 |
| 4.4 球虫疫苗的研究概况 |
| 4.4.1 强毒苗 |
| 4.4.2 弱毒苗 |
| 4.4.3 亚单位疫苗 |
| 4.4.4 重组疫苗 |
| 4.4.5 核酸疫苗 |
| 4.4.6 展望 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫卵囊的收集及阳性血清的制备 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 免疫血清的检测 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 单一种E.tenella YL 株卵囊收集的结果 |
| 5.2.2 鸡抗E.tenella YL 株阳性血清ELISA 检测结果 |
| 5.2.3 兔抗鸡E.tenella YL 株阳性血清ELISA 检测结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 柔嫩艾美耳球虫CDNA 表达文库的构建 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 总RNA 提取和mRNA 分离 |
| 6.2.2 双链cDNA 检测结果 |
| 6.2.3 大片段cDNA 的选择 |
| 6.2.4 cDNA 文库基础库容量 |
| 6.2.5 扩增文库库容量 |
| 6.2.6 cDNA 表达文库插入片段长度分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 孢子化卵囊和子孢子的质量问题 |
| 6.3.2 总RNA 和mRNA 的质量问题 |
| 6.3.3 m RNA 分离及引物的选择 |
| 6.3.4 cDNA 表达文库的质量问题 |
| 第七章 柔嫩艾美耳球虫YL 株3-1E 基因的克隆、表达与蛋白结构预测 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 E. tenella YL 3-1E 基因的克隆 |
| 7.2.2 E. tenella YL 3-1E 基因序列测定及序列分析 |
| 7.2.3 3-1E 蛋白结构预测 |
| 7.2.4 重组表达质粒pGEX-3-1E 的构建及鉴定 |
| 7.2.4 重组表达质粒pGEX-3-1E 的构建及鉴定 |
| 7.2.5 3-1E 基因表达产物SDS-PAGE 分析 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 柔嫩艾美耳球虫CDNA 表达文库的免疫学筛选与克隆 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 阳性克隆的筛选结果 |
| 8.2.2 阳性噬斑PCR 扩增结果 |
| 8.2.3 阳性克隆的重组质粒鉴定结果 |
| 8.2.4 目的片段的序列测定及分析结果 |
| 8.3 讨论 |
| 第九章 MIC-2 基因的表达与功能分析 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 材料 |
| 9.1.2 方法 |
| 9.2 结果与分析 |
| 9.2.1 重组表达质粒pGEX-MIC-2 的构建及鉴定 |
| 9.2.2 MIC-2 基因表达产物SDS-PAGE 分析 |
| 9.2.3 MIC-2 基因及其编码蛋白的结构预测 |
| 9.3 讨论 |
| 9.3.1 外源蛋白质融合表达策略 |
| 9.3.2 外源蛋白质表达部位选择策略 |
| 9.3.3 生物信息学技术分析预测编码蛋白的结构与功能策略 |
| 9.3.4 MIC-2 外源蛋白融合表达的特点 |
| 第十章 重组表达抗原对鸡球虫感染的免疫保护效果研究 |
| 10.1 材料与方法 |
| 10.1.1 材料 |
| 10.1.2 方法 |
| 10.2 结果与分析 |
| 10.2.1 可溶性蛋白的Western-blotting 分析结果 |
| 10.2.2 蛋白含量 |
| 10.2.3 增重变化 |
| 10.2.4 克盲肠内容物卵囊数 |
| 10.2.5 盲肠病变记分情况 |
| 10.2.6 抗球虫指数（ACI） |
| 10.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语英汉对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建（论文参考文献）
- [1]喹烯酮体外细胞毒性机制解析[D]. 张可煜. 中国农业科学院, 2013(01)
- [2]茉莉酸甲酯诱导的人参发根培养及SSH文库构建研究[D]. 王士杰. 吉林农业大学, 2011(01)
- [3]巨型艾美耳球虫早熟株生物学特性及其相关基因研究[D]. 董辉. 中国农业科学院, 2009(10)
- [4]卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究[D]. 冯同富. 广西医科大学, 2008(10)
- [5]旋毛虫感染诱导的SP2/0骨髓瘤细胞基因表达变化的研究[D]. 邓柏林. 吉林大学, 2007(05)
- [6]卵巢癌多药耐药差异表达基因的验证[D]. 刘媛媛. 广西医科大学, 2007(10)
- [7]陆地棉花粉氮离子注入诱变效应及机理研究[D]. 于艳杰. 南京农业大学, 2007(02)
- [8]东方巴贝斯虫cDNA文库构建及其应用[D]. 刘琴. 华中农业大学, 2007(02)
- [9]柔嫩艾美耳球虫杨凌株cDNA文库的免疫学筛选及其3-1E基因的克隆与表达[D]. 翟军军. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [10]柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建及其主要抗原基因的克隆与表达[D]. 林青. 西北农林科技大学, 2006(05)