张维谊[1]2004年在《镰形扇头蜱唾液腺及其表达序列标签的研究》文中研究指明镰形扇头蜱可传播牛的巴贝斯虫病等，是我国南方的优势蜱种。其唾液腺是重要器官，在吸血过程中分泌大量的功能分子，这些功能分子成为最有价值的候选疫苗抗原分子。本文通过对镰形扇头蜱唾液腺及其表达序列标签(EST)研究，旨在寻找抗蜱及蜱传病疫苗的抗原候选分子。 本研究选择温度为25℃、相对湿度为92％的条件进行镰形扇头蜱兔体的人工饲养和繁殖，获得单雌蜱克隆蜱群。解剖镰形扇头蜱，取其唾液腺，经液氮反复冻融、超声、离心获得唾液腺提取物(SGE)。将含量为10μg的镰形扇头蜱未吸血和半饱血SGE进行SDS-PAGE，发现二者蛋白表达存在明显差异，主蛋白条带分别为69kDa、100kDa，吸血后蛋白表达发生变化，在分子量为45-100kDa间产生一些新的蛋白分子。将蛋白抗原转印到PVDF膜，用被镰形扇头蜱叁次叮咬的兔抗血清进行Western-blotting分析，发现35kDa的蛋白可能是较重要的抗原，100kDa蛋白是蜱吸血时产生的新抗原。用半饱血SGE抗原经间接ELISA法检测人工感染的镰形扇头蜱幼虫、若虫、成虫的免抗蜱唾液抗体的变化情况，发现被蜱叮咬的兔抗体效价随着叮咬次数的增加而增加。通过Smart方法结合长链PCR(LD-PCR)构建了高质量的镰形扇头蜱半饱血唾液腺cDNA广西大学硕士论文镰形扇头蝉唾液腺及其表达序列标签的研究文库，文库重组率为95.2%，插入片段多在0.5一Zkb之间，库容量为2、75X106pfu/mL，为分离有价值的基因提供了资源及平台。经大肠杆菌BM25.8质粒化，从eDNA文库获得1 00条平均长度为745bp的有效ESTs，经功能分析发现，分别与能量代谢、信号传导、蛋白合成等基因相关，Es丁s中有27%的未知新基因，2条分别为ATP酶、细胞色素氧化酶m蛋白的全长基因，并登录在Ge心ankTM上，登录号分别为AY319968、AY422796;同时在ESTs中还发现一些抑制分子、粘合素蛋白等有价值的ESTs。 通过研究，发现了镰形扇头蜂唾液腺的重要蛋白抗原;构建了国内第一个镰形扇头蟀唾液腺cDNA文库，并运用EST技术获得了新基因，为蟀的相关研究提供了平台，为控制蟀及蟀传病奠定了基础。
郭凤璕[2]2010年在《蜱唾液腺中二个免疫抑制蛋白的基因克隆、表达和RNA干扰研究》文中进行了进一步梳理蜱是一类营专性寄生生活的吸血节肢动物,可以传播多种病原,蜱的控制对畜牧业生产和人类健康都具有重要意义。唾液腺作为蜱的重要器官,在蜱吸血过程中,分泌许多重要功能分子;这些分子对蜱吸血和病原传播都具有重要意义。为了解蜱吸血和病原传播的分子机制,寻找新的抗蜱疫苗候选分子,本研究以蜱唾液腺吸血前后消减文库EST序列信息为基础,通过基因克隆途径,从亚洲璃眼蜱和镰形扇头蜱的唾液腺中各鉴定了一个免疫抑制蛋白P36同源性分子,分别命名为HA36和RH36。RH36是镰形扇头蜱唾液腺中鉴定的免疫抑制分子,编码基因的全长序列为844bp,开放阅读框为81bp ~734bp,编码218个氨基酸,预测分子量约为24 ku;对编码的氨基酸进行信号肽分析,发现有一个由21个氨基酸组成的信号肽。其编码区内存在5个N-糖基化位点、10个磷酸化位点、3个豆蔻酰化位点。BlastX分析发现RH36与已报道的其他种类的蜱唾液腺免疫抑制蛋白P36具有显着的同源性。将RH36基因的编码序列亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,并转化到表达菌BL21(DE3),经IPTG诱导,成功进行了体外融合表达。通过显微注射方法,进行RH36基因的双链RNA干扰实验,经免疫荧光实验和Real-time PCR实验分析,干扰组的蜱唾液腺中蛋白表达和基因表达显着减少,表明RH36基因被有效干扰。与对照相比,干扰组蜱在兔体吸血过程中,48小时吸附率下降22.86%,饱血雌蜱产卵率下降近60%,说明RH36与蜱的吸血和繁殖过程有关。HA36是亚洲璃眼蜱唾液腺中鉴定的免疫抑制分子,编码基因的全长序列为924bp,开放阅读框为44bp~752bp,编码235个氨基酸,预测分子量约为27 ku,等电点为9.78。对编码的氨基酸进行信号肽分析,发现有一个由19个氨基酸组成的信号肽。其编码区内存在6个N-糖基化位点、7个磷酸化位点和1个豆蔻酰化位点。BlastX分析发现HA36与已报道的其他种类的蜱唾液腺免疫抑制蛋白P36具有显着的同源性。RT-PCR分析表明,该基因在未吸血成蜱中没有表达,仅表达于吸血后成蜱,说明该蛋白在蜱吸血过程中被诱导表达。将HA36基因的编码序列亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,并转化到表达菌BL21(DE3),经IPTG诱导,成功进行了体外融合表达。综上所述,本研究首次克隆、表达了镰形扇头蜱和亚洲璃眼蜱的免疫抑制蛋白HA36和RH36基因,并用RNAi的方法对RH36功能进行了初步研究,为蜱唾液腺的免疫抑制蛋白深入研究奠定了基础。
秦顺晴[3]2013年在《硬蜱IgG结合蛋白的生物学功能分析》文中研究说明蜱是吸血性体外寄生虫，其吸血过程中对宿主的损伤和引起的蜱传病，对畜牧业经济和人类的健康造成影响日益严重，因此世界范围内对蜱的防控也越来越受到重视。在蜱与宿主复杂关系中，蜱对宿主免疫反应的应对机制是蜱防控的研究重点之一。随着研究的逐步深入，发现蜱的多种蛋白因子参与对宿主免疫反应的调节作用，这些分子在蜱与蜱传病防治应用上和医药研究上都有很大价值，其中蜱的免疫球蛋白结合蛋白（IGBPs）就是这样的一类因子，已经发现其具有在蜱体内与宿主IgG结合并清除宿主IgG的作用，但其详细功能和作用机制仍不清楚。镰形扇头蜱是硬蜱总科扇头蜱属，在我国南方广泛分布。本实验室已经克隆了一种镰形扇头蜱免疫球蛋白结合蛋白（RH-IGBP），对其不同生长阶段的表达分布特点进行了RT-PCR分析，并对其抗蜱免疫保护性进行了检测，结果说明了其在蜱的各个阶段都有表达，具有一定的免疫保护性。为深入阐述IGBPs功能作用特点，本实验以RH-IGBP为对象，在已有研究的基础上，从五个方面展开工作。其一，对RH-IGBP进行大肠杆菌原核表达，利用表达重组蛋白制备抗体，收集吸血雌雄成蜱的各器官，对RH-IGBP性别和器官分布特点进行分析，结果显示其在吸血雄蜱中大量表达，以唾液腺为最丰富。其二，对RH-IGBP进行真核重组表达，研究重组真核蛋白与不同哺乳动物宿主（兔，猪，牛，羊，小鼠，犬）和人的IgG结合能力，发现IGBP与不同宿主IgG结合能力不同，与兔、猪的IgG有明显结合能力，与犬有一定结合能力，和羊，牛，小鼠结合能力更弱，与人的不表现结合能力。对来自兔源IgG不同酶切片段F(ab')2和Fc与RH-IGBP结合特性分析表明，蜱IgG结合蛋白主要识别部位是IgG的F(ab')2片段，但是随着浓度升高，Fc也表现出结合迹象。其叁，用牛血清白蛋白BSA免疫实验兔，叁免效价达到较高滴度后，饲喂镰形扇头蜱雌雄蜱叮咬吸血，每天解剖蜱取血淋巴，唾液腺和肠道，利用间接ELISA和Westernblot方法检测宿主IgG，证实了在镰形扇头蜱体内存在宿主IgG的运输、转移机制，同时发现于吸血第四天雄蜱唾液腺和血淋巴中检测到高浓度RH-IGBP，雌蜱仅在吸血第叁天的唾液腺里检测到。其四，对RH-IGBP进行RNA干扰实验分析，利用RealtimePCR和Westernblot方法检测基因沉默效果，结果表明此基因实现沉默，而对蜱的饱血时间，饱血体重，产卵率和孵化率等参数进行统计，发现实验组与对照组均没有明显差别，提示我们IGBPs对蜱吸血和繁殖过程的直接影响不显着，或者存在其他代偿机制。最后，我们在璃眼蜱属的亚洲璃眼蜱中也克隆出了一个IGBP基因（HA-IGBP），此基因与RH-IGBP在基因序列上有80%的保守性，在氨基酸序列上有76%的保守性，具有信号肽和与固有免疫有关的结构，利用RealtimePCR对不同生长阶段蜱中HA-IGBP的表达进行分析，结果显示，其与RH-IGBP的表达特点相似，既吸血雄蜱表达丰度最高，不过HA-IGBP在吸血雌蜱里也表现很高丰度，这点与RH-IGBP以雄蜱为主的分布特点不同；另外HA-IGBP在吸血成蜱之前的几个阶段表达丰度均较低，而在未吸血幼蜱阶段相对较高，这点尚未在别的蜱种里得到验证。总之，在关于IGBP的研究进展整体较少的情况下，本实验为后续对IGBPs作用机制的更深入的解析提供了基础。
于新茂[4]2016年在《镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶的鉴定及其在唾液腺细胞凋亡中的作用研究》文中认为半胱氨酸蛋白酶是一类古老而又保守的蛋白酶,其分布广泛,涵盖范围从病毒、细菌到哺乳动物的各个组织器官,参与胚胎发育,抗原呈递,细胞凋亡和稳态维持等多种重要的生理活动。作为专性体表寄生虫,蜱以吸血宿主血液为生,在其吸血过程中可传播细菌、真菌、病毒、支原体、原虫等多种病原体,是重要的人畜共患病传播媒介。唾液腺是宿主血液进入蜱体内最先接触的组织器官,也是蜱体内病原体传播到宿主体内的通道,因此蜱唾液腺重要分子的研究对于蜱及蜱传病控制十分重要;随着吸血过程的完成,蜱的唾液腺逐渐萎缩,这一现象是由细胞凋亡引起的,但分子机制不清。本研究以蜱的唾液腺中半胱氨酸蛋白酶分子群的鉴定为切入点,探索了半胱氨酸蛋白酶在唾液腺发育与凋亡中的作用机制。以镰形扇头蜱为研究对象,对吸血前、后唾液腺转录组进行测序及差异分析,分别测得上调基因1179个,下调基因574个,其中总转录库中预测的半胱氨酸蛋白酶表达序列标签(EST)有25个(13个上调基因EST,1个下调基因EST);经过基因克隆,共获得6个半胱氨酸蛋白酶全长序列,根据基因结构和生物信息学分析,分别命名为组织蛋白酶B(CATB)、组织蛋白酶L(CATL)、半胱天冬氨酸蛋白酶-1(CASP1)、半胱天冬氨酸蛋白酶-8(CASP8)、自噬相关蛋白酶4B(ATG4B)和自噬相关蛋白酶4D(ATG4D)。通过Real-time PCR方法检测了6种半胱氨酸蛋白酶在蜱不同发育阶段和不同吸血状态的转录水平,结果显示幼蜱和若蜱吸血后所有蛋白酶的转录量均显着性下调,而在成蜱则全部显着性上调;6种蛋白酶在成蜱唾液腺中吸血后转录量上调,尤其是CATB和CATL,上调差异非常显着,而在其他组织器官中转录水平各有不同。对5种半胱氨酸蛋白酶进行了体外重组蛋白表达和纯化(CASP8未表达),并分别制备小鼠特异抗血清。重组蛋白的酶活实验显示,各蛋白在适度浓度和PH范围内均表现一定的活性:CASP1的最适PH为5.5,可达阳性对照酶活性的60%;组织蛋白酶B和L随着浓度的增加,其活性受到抑制,其中组织蛋白酶L包含一个60个氨基酸的抑制结构域,将其切除后可明显提高组织蛋白酶L的活性,推测抑制结构域是限制组织蛋白酶L活性的重要因素,而组织蛋白酶B的高浓度抑制效应可能来自酶与底物的竞争;ATG4B和ATG4D对CASP1特异性底物具有一定活性,可达阳性对照的40%,ATG4D对组织蛋白酶特异性底物具有良好活性,高浓度下也出现抑制效应。5种重组蛋白的特异性抗血清,可分别识别成蜱体内天然蛋白酶,其中两种组织蛋白酶CATB和CATL在35~40 kDa之间均有2条带,可能为酶原和激活态,而自噬相关蛋白酶天然蛋白大小分别为~36 kDa(ATG4B)和~40 kDa(ATG4D),CASP1天然蛋白大小约为37 kDa,在70 kDa左右有类似二聚体结构,可能是其真正的活性态。利用免疫组化技术,观察5种半胱氨酸蛋白酶在唾液腺和肠腔中的定位,结果显示在唾液腺中5种蛋白酶分布广泛,而在中肠只可见ATG4D的少量分布。利用RNA干扰技术,通过电转化将合成的特异性双链RNA导入镰形扇头蜱若蜱体内,对6种半胱氨酸蛋白酶分别进行单一干扰实验,检测6种半胱氨酸蛋白酶之间是否存在相互作用关系,结果显示任一蛋白酶受到抑制均可引起其他5种蛋白酶转录水平发生变化,特别是当CATB和CATL转录受抑制可引起ATG4B和CASP1转录水平显着性上调,而CASP8和ATG4D转录受抑制时也引起CASP1转录水平显着上调;当CASP1受到抑制后,CATB的转录水平下调显着,ATG4D、ATG4B和CASP8的转录水平也受到明显抑制,但CATL的转录水平未受到影响,推测CASP1对于CASP8,CATB,ATG4B和ATG4D可能具有上游调节作用,为后续研究提供了切入点。通过解剖观察、Tunnel染色和AnnexinⅤ细胞凋亡流式检测确定了成蜱吸血过程中细胞凋亡参与唾液腺的变化过程;为了探究半胱氨酸蛋白酶在过程中的作用机制,利用显微注射技术将体外合成的干扰用CASP1双链RNA注射入镰形扇头蜱成蜱体内,24小时后接种新西兰大白兔,分别对上体后1到7天的对照组与实验组成蜱唾液腺进行分离观察,在mRNA和蛋白水平上检测7天吸血过程中半胱氨酸蛋白酶的动态变化,利用Tunnel细胞凋亡染色和AnnexinⅤ流式细胞凋亡检测技术对吸血过程中唾液腺的变化进行监测,结果表明进入快速吸血期前(上体3~4天)是唾液腺细胞诱导细胞凋亡发生的主要时相,随后随着吸血过程快速完成,唾液腺细胞逐渐坏死,CASP1作为效应性半胱天冬氨酸蛋白酶,在上体后5到7天表达量逐渐增加;CASP1的干扰可明显延长唾液腺细胞的凋亡,影响吸血过程中唾液腺细胞的坏死,并且诱导ATG4D的表达量逐渐增加,表明ATG4D与CASP1之间关系密切,暗示了自噬蛋白酶与半胱天冬氨酸蛋白酶之间可能存在互补的代偿关系,共同参与唾液腺细胞的凋亡坏死过程。综合上述结果,本研究鉴定了镰形扇头蜱6个半胱氨酸蛋白酶分子,发现它们在蜱吸血后唾液腺中上调表达,相互之间存在一定互作调节关系,其中自噬相关的半胱氨酸蛋白酶与凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶共同参与了蜱唾液腺的凋亡过程。
张文杰[5]2008年在《镰形扇头蜱抗微生物多肽基因的克隆及序列分析》文中认为蜱是一类以吸血为生的节肢动物,是人和动物的许多病原的传播媒介,包括细菌、真菌、病毒、立克次体、螺旋体和寄生原虫等多种病原。在中国,已记录的蜱类近120种,其中10余种具有明显的医学重要性,了解病原在蜱体的传播机制,特别是病原体与蜱的相互作用关系,对于蜱和蜱传病的防治具有重要价值。抗微生物多肽作为蜱的先天性免疫效应分子之一,是研究蜱与病原体的相互作用的重要切入点。本实验以镰形扇头蜱吸血前后雄蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础,从镰形扇头蜱体内克隆出M200和M50二个新基因。M200基因全长542bp,编码100个氨基酸,预测分子量为9.85kDa,含有典型的信号肽序列,经同源性比较,该基因编码蛋白与与微小牛蜱抗微生物多肽分子Ixodidin序列的显着同源。M50基因全长410bp,编码100个氨基酸,预测分子量为9.0kDa,含有典型的信号肽序列,无显着性同源分子,仅与单一异尖线虫蛋白酶抑制因子有低度同源。结构上,M200和M50预测蛋白都含有半胱氨酸的抗微生物多肽的典型特征,即在C-末端含有6个保守的半胱氨酸残基(C…CXXXC…C…CXC),形成一个称为CSαβ(cysteine-stabilizedαβ)稳定的基序(motif)。综合同源性、结构特征、分子量、信号肽等生物信息学分析结果,初步预测M200和M50为二个编码镰形扇头蜱抗微生物多肽的新基因。应用RT-PCR方法分析了M200和M50基因在蜱的不同组织器官和不同发育阶段的表达情况。结果表明,这二个基因的表达没有组织特异性;M200在蜱的各个发育阶段卵、幼蜱、若蜱和成蜱均有表达,但M50在蜱的卵、若蜱阶段没有表达。应用RT-PCR方法分析了M200和M50基因在蜱的吸血前后的表达模式。M200和M50基因在蜱吸血后的转录量显着高于未吸血蜱,说明这两个基因的表达与吸血有关。成功构建了重组表达载体pGEX-4T-1/M200和pGEX-4T-1/M50,并转化到表达菌BL21中,经IPTG诱导,结果表明M200和M50可以在原核表达系统中高效表达,应用GST融合蛋白纯化系统,可获得纯化的目的蛋白。综上所述,本研究首次克隆、表达了镰形扇头蜱二个新基因,生物信息学分析表明它们可能是二个编码镰形扇头蜱抗微生物多肽。研究结果,为进一步研究这二个分子的生物学功能打下基础。
万修红[6]2007年在《镰形扇头蜱IgG结合蛋白基因的克隆及表达》文中研究指明蜱是一类专性吸血的体外寄生虫,分布广泛,是许多人和动物重要疾病的传播媒介,经蜱传播的病原体有细菌、病毒、真菌、立克次体、螺旋体以及原虫,不仅给畜牧业造成很大的经济损失,同时还影响人类健康。目前世界上约有820多种蜱,我国发现的蜱有110多种,镰形扇头蜱是我国南方的优势蜱种,主要传播牛巴贝斯虫病、马巴贝斯虫病和吉氏巴贝斯虫病。蜱及蜱传播疾病引起的经济损失十分巨大,到目前为止,免疫防治被认为是最有潜力的防治策略,而寻找敏感、长效、安全的抗原基因是免疫防治的前提条件。IgG结合蛋白(IgG binding protein, IGBP)是蜱体内的一种重要蛋白质,主要存在于蜱的血淋巴和唾液腺中,可以结合进入蜱血淋巴中的宿主免疫球蛋白,避免了宿主免疫球蛋白对蜱内部嚣官的损害,有些种类的IGBP具有雄性特异性,是雄蜱协助雌蜱顺利完成吸血所必不可少的,IGBP是蜱体内一种具有疫苗潜力的功能分子。本实验以镰形扇头蜱吸血前后雄蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础,应用RACE方法从镰形扇头蜱体内克隆出一个IGBP基因的全长序列,该基因全长683bp,编码178个氨基酸,预测分子量为19.5kDa,经同源性比较该基因与具尾扇头蜱的IGBP-MB基因序列的同源性高达92%。用RT-PCR方法分析了该基因表达的性别特异性、各个器官、各个发育阶段的表达情况,结果表明,该基因表达没有性别特异性;IGBP基因在唾液腺、壳这两个器官有所表达,但在肠中却没有表达;在蜱的各个发育阶段均有表达。成功构建了重组表达载体,并转化到表达菌BL21中,经IPTG诱导,结果表明IGBP可以在原核表达系统中高效表达,应用GST融合蛋白纯化系统,可获得纯化的目的蛋白;探讨了ELISA方法检测重组蛋白结合宿主IgG活性的试验。综上所述,本研究首次克隆、表达了镰形扇头蜱IgG结合蛋白基因,分析它的表达特点,并对其功能进行了初步研究,为该基因的进一步研究打下基础。
王玉俭[7]2012年在《镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子的鉴定》文中认为蜱能传播真菌、原虫、立克次体、细菌及病毒等多种病原体,是仅次于蚊子的第二大病原传播媒介。在世界范围内蜱及蜱传病严重威胁着人和动物的健康安全,并对畜牧业生产造成重大的经济损失。蜱功能分子的研究对于在分子水平上了解蜱的生物学特性具有十分重要的意义。酶与酶的抑制剂分子在蜱的生物学活动中扮演十分重要的角色,其中能与木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶产生可逆的、紧密结合抑制的半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子(cystatin)在近年来被广大的研究者所关注。Cystatin根据一些保守氨基酸序列和所占有的cystatin结构域个数可分为四个亚家族：cystatin家族1,也称之为stefins家族；cystatin家族2；cystatin家族3,也称之为kininogens家族；cystatin家族4,也称之为cystatin样蛋白(胎球蛋白、组氨酸糖蛋白)。在蜱上现在被发现和研究的主要是家族1和家族2cystatin分子。家族1cystatin是一些不具有信号肽的胞质蛋白,而家族2cystatin是具有信号肽的分泌型蛋白。在国外长角血蜱、肩突硬蜱和非洲钝缘蜱等蜱的cystatin分子被进行了较为深入的研究,发现了cystatin分子涉及蜱的饱血、对宿主免疫调节、调节血液消化及蜱的先天免疫等许多重要生理过程。然而国内对于蜱的cystatir研究仍属空白。本研究所用的蜱种是采自湖北武汉经本实验室传代培养的南方优势蜱种镰形扇头蜱。利用cystatin分子在结构上相对保守的特点,用与镰形扇头蜱亲缘性较高的微小牛蜱的家族1cystatin分子和变异革蜱的家族2cystatin分子分别设计家族1cystatin的保守区引物和家族2cystatin的3'RACE引物,用于扩增镰形扇头蜱的家族1cystatin的一个保守片段和家族2cystatin的3'端。利用得到的家族1cystatin保守片段序列通过3'RACE和5RACE方法可扩增出镰形扇头蜱家族1cystatin全长基因序列,利用得到的家族2cystatin3端序列通过5'RACE方法扩增出镰形扇头蜱家族2ystatin全长基因序列。将得到镰形扇头蜱家族1和家族2cystatin分子分别命名为RHcyst-1和RHcyst-2. RHcyst-1全长基因为471bp,具有一个编码98个氨基酸的开放阅读框,没有信号肽序列。和绝大多数的家族1cystatin—样,RHcyst-1具有N端保守甘氨酸知QXVXG保守位点。推测RHcyst-1的蛋白大小约为11kDa,等电点为5.66。RHcyst-2全长基因为773bp,具有一个编码139个氨基酸的开放阅读框,其中有23个氨基酸为信号肽序列。RHcyst-1具有非常典型的家族2cystatin的特征,N端保守甘氨酸、QXVXG保守位点、PW保守位点以及两个二硫键桥。推测RHcyst-2的蛋白大小约为15kDa,等电点为5.20。将RHcyst-1和RHcyst-2去信号肽的ORF序列亚克隆至pGEX-4T-1载体,转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达。用GST树脂纯化重组蛋白,将RHcyst-1和RHcyst-2的重组蛋白分别命名为rRHcyst-1和rRHcyst-2。用rRHcyst-1和rRHcyst-2对六种半胱氨酸蛋白酶进行体外酶活抑制实验。实验结果表明,rRHcyst-1知rRHcyst-2对组织蛋白酶L、B、C、H、S和木瓜蛋白酶的酶活性能产生有效抑制。本研究成功从镰形扇头蜱中克隆了两个新的cystatin分子,并在生化水平对其抑制活性进行了分析,这对我们进一步了解cystatin分子在镰形扇头蜱生物学活动中的作用有着十分重要意义。
狄清[8]2010年在《镰形扇头蜱Serpins基因的克隆、表达和鉴定》文中研究说明本实验中研究的镰形扇头蜱是分布于我国南方的优势硬蜱种,是叁宿主蜱,能够传播巴贝西虫。蜱在侵袭宿主过程中,面临多种障碍,其中血液凝集作用和宿主免疫反应最为重要,因此,蜱体会分泌多种活性分子,来抵抗血液的凝集,逃避宿主免疫作用,分离和鉴定此类分子,对研究抗蜱疫苗、研制新型抗凝血制剂、发现炎症抑制因子具有重要意义。丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine Protease Inhibitors, Serpins)是一类结构相似、分布广泛、成员众多、功能多样的蛋白酶抑制剂家族,近年来相继从篦子硬蜱、肩胛硬蜱、具尾扇头蜱和长角硬蜱等蜱中分离得到Serpins基因,研究表明,Serpins具有抑制血液凝集、抵抗宿主免疫反应的功能,另外Serpins作为疫苗也具有一定程度的保护作用。镰形扇头蜱中Serpins的研究尚属空白,因此利用本实验室克隆得到的两条与Seprins同源性较高的表达序列标签(Express Sequence Taq, EST),采取RACE (Rapid Amplification of cDNA ends)方法从镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA中,克隆得到两条完整的基因序列,通过Blastn分析发现两基因都具有Serpins的典型结构,属于Serpins基因家族,命名为RHS1 (Rhipicephalus Haemaphysaloides Serpin-1)和RHS2(Rhipicephalus Haemaphysaloides Serpin-2),全长分别为1280bp和1682bp,最大开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)分别编码392aa和380aa,其中RHS1含有一段信号肽序列。将RHS1和RHS2编码序列亚克隆到pGEX-4T-1载体上,转入大肠BL21(DE3),加入IPTG诱导蛋白表达,预期蛋白大小均为43kDa,GST重组蛋白大小69kDa。RT-PCR结果表明,RHS1和RHS2在半饱血雌蜱唾液腺和肠道中均有表达,肠道中的基因丰度稍高。采用基因重组的方法,利用GST原核表达系统,成功表达和纯化出预期大小的Serpins蛋白,命名为rRHS1和rRHS2, Western blot结果表明兔抗镰形扇头蜱血清能够识别rRHS1和rRHS2,说明两种重组蛋白具有很好的免疫原性,因此,采用免疫小白鼠的方法,获得了anti-rRHS1和anti-rRHS2特异性抗血清。研究发现,anti-rRHS1和anti-rRHS2特异性抗血清,能够识别镰形扇头蜱半饱血雌蜱,其中RHS2蛋白主要在肠道中表达,其大小与预期大小一致,RHS1蛋白主要在肠道中表达,其大小与预期相差10kDa,表明RHS1蛋白在转录后的过程中存在较大的修饰。经体外酶抑制实验发现,两倍摩尔浓度重组蛋白能够显着抑制等的牛胰凝乳蛋白酶活性,rRHS1还能够部分抑制牛凝血蛋白酶活性。
石磊[9]2009年在《镰形扇头蜱抗凝血分子基因的克隆表达和产物活性分析》文中研究说明蜱是一类专性吸血的节肢动物,不仅是动物重要的外寄生虫,还是仅次于蚊子的人和动物疾病的第二传播媒介。与其它的吸血动物相比,蜱的吸血时间特别长,一般在10-14天才能达到饱血状态。在蜱吸血过程中,宿主会发生微血管收缩﹑血小板凝集和血液凝固等凝血反应。蜱通过唾液腺分泌抗凝血分子以克服宿主的凝血反应,达到成功吸血的目的。蜱源抗凝血分子的研究,不仅有助于了解蜱的吸血及病原传播的复杂机制,开拓蜱及蜱传疾病新型防治技术。而且在开发人类心血管疾病的新型生物制剂上具有潜在价值。镰形扇头蜱是我国南方优势蜱种,我们以吸血前后雌蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础,克隆出一个抗凝血分子编码基因C18。该基因全长580bp,编码164个氨基酸,预测分子量为18.04kDa(包括信号肽)。该蛋白分子在5’端有一个18个氨基酸构成的信号肽序列,并含有一个典型的抗凝血Kunitz功能域。经同源性比较该基因与组织通道抑制因子同源。用RT-PCR方法分析了C18在镰形扇头蜱吸血前后的表达情况,结果表明C18为蜱吸血后诱导表达。成功构建了重组表达载体pGEX-4T-1-C18,并转化到表达菌BL21中,经IPTG诱导,结果表明C18可以在原核表达系统中高效表达,应用GST融合蛋白纯化系统,可获得纯化的目的蛋白。通过血浆复钙时间试验和血浆部分凝血酶激活时间试验对重组蛋白的抗凝血活性经行检测,发现重组蛋白同时对内源性和外源性的凝血具有明显抑制作用。同时以镰形扇头蜱吸血前后雌蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础,应用RACE方法从镰形扇头蜱体内克隆出另一个抗凝血基因C201的全长序列,该基因全长693bp,开放阅读框编码195个氨基酸,预测分子量为22.62kDa,该蛋白分子在5’端有一个20个氨基酸构成的信号肽序列,并含有一个典型的抗凝血Kunitz-BPTI功能域。经同源性比较该基因与组织通道抑制因子Ⅱ基因序列高度同源。综上所述,本研究首次克隆了镰形扇头蜱C201抗凝血蛋白基因,为该基因的进一步研究打下了基础。首次克隆并表达了镰形扇头蜱C18抗凝血分子,分析它的表达特点,并对其抗凝活性进行了初步研究,为蜱抗凝血基因的进一步研究打下了良好基础。
马腾[10]2006年在《镰形扇头蜱肌钙蛋白I基因的克隆及表达》文中进行了进一步梳理蜱是一种重要的体表寄生虫,是许多人和动物疾病的传播媒介,经蜱传播的病原体有病毒、立克次体、螺旋体以及原虫。为了寻找新的抗蜱免疫候选抗原,我们从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库筛选目的EST序列,通过RACE方法获取该EST全长序列。用RT-PCR分析该基因在蜱体内的分布,并研究该基因是否含内含子。将该基因连接到pET-32a(+)表达载体,并转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western blot分析。结果从该文库的EST中筛选得到了一个含polyA尾的肌钙蛋白Ⅰ(TnI)基因疑似序列,经5′-RACE方法得到了该基因的全长序列。基因全长852bp,编码219个氨基酸,预测分子量约为25kDa。经同源性比较,该基因预测的氨基酸序列与长角血蜱肌钙蛋白Ⅰ(GenBank,GI:14041807)有很高的同源性(同源性为84.47%),肌动蛋白结合位点位于147-167氨基酸处,且与长角血蜱肌钙蛋白Ⅰ肌动蛋白结合位点完全相同,表明该基因是镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ基因。RT-PCR分析表明,该基因在镰形扇头蜱卵、幼蜱、若蜱、成蜱以及壳、唾液腺、肠均有表达。以镰形扇头蜱基因组DNA为模板扩增到编码肌钙蛋白Ⅰ的基因组序列,测序分析,该序列不含内含子。TnI基因可以在BL21中高效表达,融合蛋白分子量大小为45kDa。Western blot分析表明,抗TnI重组蛋白兔血清可以识别蜱体内的TnI,并在22kDa和36kDa之间有两条带,说明在蜱体内可能同时存在两个大小不等的TnI。综上所述,本研究首次克隆、表达了镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ基因,并对其功能进行了初步研究,为该基因的进一步研究打下了基础。
参考文献：
[1]. 镰形扇头蜱唾液腺及其表达序列标签的研究[D]. 张维谊. 广西大学. 2004
[2]. 蜱唾液腺中二个免疫抑制蛋白的基因克隆、表达和RNA干扰研究[D]. 郭凤璕. 中国农业科学院. 2010
[3]. 硬蜱IgG结合蛋白的生物学功能分析[D]. 秦顺晴. 中国农业科学院. 2013
[4]. 镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶的鉴定及其在唾液腺细胞凋亡中的作用研究[D]. 于新茂. 中国农业科学院. 2016
[5]. 镰形扇头蜱抗微生物多肽基因的克隆及序列分析[D]. 张文杰. 上海师范大学. 2008
[6]. 镰形扇头蜱IgG结合蛋白基因的克隆及表达[D]. 万修红. 上海师范大学. 2007
[7]. 镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子的鉴定[D]. 王玉俭. 南京农业大学. 2012
[8]. 镰形扇头蜱Serpins基因的克隆、表达和鉴定[D]. 狄清. 湖南农业大学. 2010
[9]. 镰形扇头蜱抗凝血分子基因的克隆表达和产物活性分析[D]. 石磊. 新疆农业大学. 2009
[10]. 镰形扇头蜱肌钙蛋白I基因的克隆及表达[D]. 马腾. 中国农业科学院. 2006