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【摘要】目的：优选从雨声红球藻提取虾青素的工艺。方法：以虾青素的提取量为考察目标，通过单因素法、正交设计法优化从雨声红球藻提取虾青素的提取工艺。结果：筛选最佳提取工艺为是加入50倍雨生红球藻量的二氯甲烷-乙醇（2：1）混合溶剂，在40℃下加热30min，提取2次。结论：筛选出来的提取工艺稳定可行、操作简单。
【关键词】雨生红球藻；虾青素；单因素法；正交设计法；提取
虾青素（Astaxanthin）是自然界中分布较为广泛的一种类胡萝卜素，化学名称为 3，3’ -二羟基-β，β’-胡萝卜素-4，4’-二酮，结构见左，分子式为C40H52O4，分子量为 596.84。现阶段虾青素的来源主要有以下4 种[1]：化学合成、红发夫酵母发酵、雨生红球藻积累和虾蟹的壳。出于安全性的考虑，化学合成的虾青素现在使用受到越来越严格的限制；而红发夫酵母发酵的虾青素和虾、蟹下脚料中虾青素由于含量较低和培养成本过高等原因受到了极大的限制，目前雨生红球藻为现阶段虾青素的主要来源，雨生红球藻含有虾青素的量最高可达到细胞干重的4%[2]，但我们在实际提取中很难提取到4%，甚至1%的提取率都难以达到。目前我们在破壁的基础上[3]，优化提取工艺，使提取率得到提高，研究结果报告如下：
1 实验材料
1.1 实验试剂
雨生红球藻（购置云南爱尔发生物技术有限公司，批号：20150304P），KOH（广东光华化学厂有限公司产，型号：20100427，规格：分析纯），甲醇（广东光华科技股份有限公司产，型号：20150316，规格：分析纯），二氯甲烷（天津富宇精细化工有限公司产，型号：20150505，规格：分析纯），盐酸（佛山南海志力化工有限公司产，批号：20150107，规格：分析纯），无水乙醇（广东光华科技股份有限公司产，规格：分析纯，批号：20140920），虾青素对照品（佛山市仁汇医药科技有限公司产，批号：20141216，纯度：92.01%），甲醇（Oceanpak公司产，批号：Me-11840506，规格：色谱纯）。
1.2 实验仪器
集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司产品，型号：DF-101），电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产，型号：AL204），超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司产，型号：KQ3200B），循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司产，型号：SHZ-D（Ⅲ）），高效液相色谱仪（北京创新通恒科技有限公司产，型号：LC3000）。
2 实验方法与实验结果
2.1 虾青素含量测定方法的建立
2.1.1 色谱条件
参考文献的方法[4]，色谱柱：Kromasil C18（25m×4.6mm，5µm），流动相：甲醇-水（95：5），检测波长：474nm，流速：1ml/min，柱温：30℃；进样量：20μl，见图1。
2.1.2 标准曲线的制备
精密称取虾青素对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声溶解5min，过滤，配制成虾青素溶液（浓度为0.1mg/ml），分别吸取滤液1、2、4、6、8ml置于100ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得虾青素对照品溶液，浓度分别为1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml、6.0μg/ml、8.0μg/ml。过0.45μm滤膜，取20μl按照2.1.1项下色谱条件进样，记录色谱的峰面积（Y），与浓度（X）进行线性回归，制备标准曲线方程为y = 151687x – 32264（R2 = 0.996），结果见图2。
2.2 单因素筛选雨生红球藻的破壁工艺
2.2.1 提取工艺 取雨生红球藻3g，加入雨生红球藻50倍量的4N HCl，在70℃浸泡10min进行破壁，过滤，取药渣，加入雨生红球藻一定倍数量的不同比例混合溶剂（二氯甲烷-乙醇），在一定温度下提取一定时间后，过滤，滤液加入4% KOH醇溶液，在10℃皂化10min后，用盐酸调PH值至中性，浓缩至干，用二氯甲烷萃取虾青素，取1ml加入50ml的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取20μl按照2.1.1项下色谱条件进样，记录色谱的峰面积（Y），计算浓度与得率。
2.2.2 混合溶剂比例对虾青素提取率的影响 取雨生红球藻3g，加入雨生红球藻50倍量的4N HCl，在70℃浸泡10min进行破壁，过滤，取药渣，分别加入雨生红球藻50倍量的不同比例有机混合溶剂（二氯甲烷-乙醇（1：0、1：1、1：2、2：1、0：1）），在40℃下提取30min后，过滤，滤液加入4% KOH醇溶液，在10℃皂化10min后，用盐酸调PH值至中性，浓缩至干，用二氯甲烷萃取虾青素，取1ml加入50ml的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取20μl按照2.1.1项下色谱条件进样，记录色谱的峰面积（Y），计算得率，结果见图3。
2.2.3 溶剂加入量对虾青素提取率的影响 取雨生红球藻3g，加入雨生红球藻50倍量的4N HCl，在70℃浸泡10min进行破壁，过滤，取药渣，分别加入雨生红球藻20、30、40、50、60倍量的混合溶剂（二氯甲烷-乙醇（2：1）），在40℃下提取30min后，过滤，滤液加入4% KOH醇溶液，在10℃皂化10min后，用盐酸调PH值至中性，浓缩至干，用二氯甲烷萃取虾青素，取1ml加入50ml的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取20μl按照2.1.1项下色谱条件进样，记录色谱的峰面积（Y），计算得率，结果见图4。
2.2.4提取温度对虾青素提取率的影响 取雨生红球藻3g，加入雨生红球藻50倍量的4N HCl，在70℃浸泡10min进行破壁，过滤，取药渣，加入雨生红球藻50倍量的有机混合溶剂（二氯甲烷-乙醇（2：1）），分别在20、30、40、50、60℃下提取30min后，过滤，滤液加入4% KOH醇溶液，在10℃皂化10min后，用盐酸调PH值至中性，浓缩至干，用二氯甲烷萃取虾青素，取1ml加入50ml的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取20μl按照2.1.1项下色谱条件进样，记录色谱的峰面积（Y），计算得率，结果见图5。
2.2.5 提取时间对虾青素提取率的影响 取雨生红球藻3g，加入雨生红球藻50倍量的4N HCl，在70℃浸泡10min进行破壁，过滤，取药渣，加入雨生红球藻50倍量的有机混合溶剂（二氯甲烷-乙醇（2：1）），在40℃下分别提取15、30、45、60、75min后，过滤，滤液加入4% KOH醇溶液，在10℃皂化10min后，用盐酸调PH值至中性，浓缩至干，用二氯甲烷萃取虾青素，取1ml加入50ml的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取20μl按照2.1.1项下色谱条件进样，记录色谱的峰面积（Y），计算得率，结果见图6。
2.3 正交设计法筛选雨生红球藻的提取工艺
在实际的提取操作中，混合溶剂比例、溶剂加入量、提取温度及提取时间等各因素是相互交叉影响的，为了全面考查各影响因素，在单因素筛选的基础上，设计了四因素三水平正交实验表L9（3）4，对结果进行直观分析、方差分析及显著性检验，具体见表1、表2与表3。
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由表3与表4分析结果可知，四个因素对虾青素的提取得率均有不同程度的影响，其影响大小顺序为溶剂加入量（B）＞提取时间（D）＞提取温度（C）＞混合溶剂比例（A），方差分析中溶剂加入量（B）、提取时间（D）、提取温度（C）对虾青素提取得率有较为显著性的影响（P＜0.05），混合溶剂比例（A）对虾青素提取得率无显著性影响，根据各因素的K值来评价影响最大的水平，该正交实验优选出最佳工艺为A2B2C2D2，即取雨生红球藻，加入雨生红球藻50倍量的有机混合溶剂（二氯甲烷：乙醇2：1），在40℃提取30min。
2.4 最佳提取工艺验证 称取3份雨生红球藻，每份100g，按照最佳工艺A2B2C2D2流程平行操作，结果见表-4。
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最佳工艺验证结果表明，该工艺下虾青素提取的得率高于其他各正交设计工艺的提取率。故本最佳工艺条件合理。
3 讨论
虾青素在自然界中，广泛存在于虾、蟹、鱼（三文鱼等）、某些藻类（雨生红球藻）及真菌中，许多甲壳动物由于体内积累有虾青素而变成了红色，另外，在一些鸟类（火候鸟）、家禽蛋中也发现了虾青素的存在。虾青素是由一个多聚烯链和位于两侧的芳香环组成，多聚烯链由9个共轭双键的碳链组成，两侧的芳香环为紫罗兰环或白芷酮环，在紫罗兰环的3，4位上各有一个羟基（—OH）与一个不饱和酮基（=O）。因此，虾青素具有13个共轭双键，在共轭双键链的末端还有不饱和的酮基和羟基，酮基和羟基又构成α-羟基酮。这些结构都具有较活泼的电子效应，能吸引自由基或向自由基提供电子，从而可有效清除自由基，即虾青素具有抗氧化活性与清除自由基性能[5]。虾青素因含有多个共轭双键等原因，易受温度影响，因此，我们提取雨生红球藻中虾青素成分时，要控制加热的温度、加热时间等因素，最大限度获取雨生红球藻中的天然虾青素。
参考文献：
[1]邹堂斌.虾青素生物活性及作用机制的研究进展[J].广东医学院学报，2014，32（6）：873-875.
[2]罗卿心，刘晓娟，曹庸，等.雨生红球藻中3S，3’S-虾青素的分离纯化和手性检测[J].食品科技，2015，36（1）：253-257.
[3]周湘池，刘必谦，曾庆国，等.雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）破壁方法对虾青素提取率的影响[J].海洋与湖沼，2006，37（5）：424-429.
[4]饶毅，曾恋情，魏惠珍，等.高效液相法测定虾青素的含量[J].江西中医药大学学报，2014，26（5）：79-81
[5]武万强，刘学波.虾青素生物功能的研究进展[J].农产品加工·学刊，2012，（9）：91-96.
* 佛山市禅城区产学研专项资金项目（编号：2013B1010）
* 佛山市中小企业创新基金项目（编号：2013AA100481）
论文作者:蔡小连, 庄奔利, 岳赟
论文发表刊物:《系统医学》2015年第1卷第7期供稿
论文发表时间:2015/12/4
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