栗向东, 胡蕴玉[1]2002年在《人骨形态发生蛋白2基因转染成纤维细胞后的稳定表达和诱导成骨的实验研究》文中指出目的:探讨人BMP_2基因能否在成纤维细胞内稳定表达,人BMP_2基因转染对成纤维细胞生物学性状的影响及表达BMP_2的成纤维细胞是否具有体内诱导成骨能力。
栗向东[2]2000年在《人骨形态发生蛋白2基因转染成纤维细胞后的稳定表达和诱导成骨的实验研究》文中提出骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)属于转化生长因子-β超家族成员，具有良好的异位诱导成骨作用，大量研究表明其在骨科临床上用来促进骨折愈合，进行关节间融合和防止人工假体松动等方面有良好的应用前景。但是，单靠外源性植入往往不能满足骨损伤修复的需要，而且目前尚缺乏理想的载体。基因治疗作为一种新的治疗方法，与植入基因工程重组的BMP相比，理论上讲具有能够进行BMP持续的释放、避免植入载体等多方面的优点。本研究通过构建人BMP_2基因真核表达载体，并将其转染成纤维细胞，探讨人BMP_2基因能否在成纤维细胞内稳定表达、外源目的基因BMP_2的导入对成纤维细胞生物学性状的影响及表达BMP_2的成纤维细胞是否具有体内诱导成骨能力。为将来将人BMP_2基因导入自体成纤维细胞，进而将稳定表达人BMP_2基因的自体成纤维细胞植入体内进行骨损伤修复的基因治疗奠定基础。 1．重组真核表达载体pcDNA_3-hBMP_2的构建 本研究采用基因重组技术将全长人BMP_2 cDNA定向克隆到真核表达载体pcDNA_3内，形成重组真核表达载体pcDNA_3-hBMP_2，为研究BMP_2导入成纤维细胞后的稳定表达、外源目的基因BMP_2的导入对成纤维细胞
韩冬[3]2004年在《hBMP-2基因腺病毒表达载体体内外成骨的实验研究》文中提出BMP是一组分泌型蛋白质，由于其肽链C-末端的半胱氨酸具有高度同源性，因而属于转化生长因子β超家族成员（TGF-β）。BMP在体内能够趋化、聚集间质干细胞，使其增殖、分化为成软骨细胞和成骨细胞，从而启动成骨的级联过程。随着分子克隆技术的出现，高度纯化的rhBMP被生产出来，从而对BMP的理化性质、成骨机制和临床应用前景有了更加深入的了解。但是，使用外源性rhBMP存在着缺乏合适的承载体，在体内降解较快，生物活性时间短等缺点。近几年来，随着基因载体系统和转移技术的日益完善，学者们开始尝试着将BMP基因导入到骨损伤部位，使具有更高生物活性的BMP在损伤部位持续、稳定表达，从而达到治愈骨科疾病的目的。其中，BMP-2具有较强的成骨诱导活性，显示了广阔的临床应用前景。由于腺病毒载体不整合到宿主细胞的染色体中，从而具有更大的安全性和非长期表达的特点，这正适合骨科疾病短期治疗的需要，加之腺病毒载体具有很高的转染效率而被学者们广泛采用。BMSC位于骨髓的基质细胞系中，分裂增殖能力强，可分化为成骨和成软骨等多种结缔组织细胞，易于被外源基因转染且表达稳定，是基因治疗的理想靶细胞之一。成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，在体内分布广泛，取材方便，易行培养，分裂增殖迅速，是骨折后参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分，因此也是一种比较理想的种子细胞。本实验在成功构建AdBMP-2的基础上，在体外实验部分，探讨了AdBMP-2分别转染兔BMSC和小鼠L929成纤维细胞后对其生物学变化的影响，hBMP-2基因在mRNA水平与蛋白质水平的表达情况以及两种细胞经AdBMP-2转染后是否向成骨细胞方向分化及其分化机制。在体内实验部分，采用了In vivo的方法，将AdBMP-2直接注射到裸鼠后肢肌群，评价AdBMP-2<WP=124>的成骨能力，并探讨AdBMP-2在体内诱导成骨的机制和利用基因转移技术构建组织工程骨的可行性，从而建立一个利用AdBMP-2构建组织工程骨的方法。在本实验中，采用了密度梯度离心法和贴壁法自兔胫骨骨髓中获得了原代BMSC，并经多次传代进一步纯化后，应用AdBMP-2病毒液转染BMSC（MOI=100）,MTT法和流式细胞仪等检测转染后细胞生物学变化，并在同等条件下转染Adβgal以确定其转染效率。AdBMP-2转染兔BMSC后7d，采用原位杂交和免疫组化法测定hBMP-2基因在mRNA水平及蛋白质水平的表达；采用原位杂交法检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和VEGF等mRNA的表达；免疫组化法检测OC和Ⅱ型胶原的蛋白质表达；钙钴法检测细胞内ALP的表达。同时，又选取了小鼠L929成纤维细胞系对AdBMP-2的成骨能力进行了评价，AdBMP-2病毒液转染小鼠L929成纤维细胞系（MOI=100），采用MTT法和流式细胞仪检测转染后细胞生物学变化，同等条件下转染Adβgal以确定其转染效率。AdBMP-2病毒液转染小鼠L929成纤维细胞7d后，采用原位杂交和免疫组化法测定hBMP-2基因在mRNA水平及蛋白质水平的表达；采用原位杂交和免疫组化法法检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和VEGF等mRNA水平和蛋白质水平的表达，免疫组化法检测OC的蛋白质表达，钙钴法检测细胞内ALP的表达。在体内实验部分，用微量注射器抽取AdBMP-2病毒液（滴度为2×1012pfu/ml）30μl,分别注射到裸鼠左后肢一侧股四头肌和胫骨前肌处，注射后20d、30d、60d取材，大体观察、X线片、组织学、免疫组化和原位杂交等方法评价AdBMP-2的体内成骨能力并分析其成骨机制。Adβgal（滴度2×1012pfu/ml）30μl对侧右后肢腓肠肌内注射，注射后20d、30d和60d取材观察作为对照。Adβgal（滴度为2×1012pfu/ml）30μl裸鼠右后肢腓肠肌内注射，3d后取材，X-gal组化染色检测βgal的表达以确定转染细胞类型。经AdBMP-2转染后的BMSC增殖能力未见明显改变，hBMP-2基因在mRNA<WP=125>水平和蛋白质水平都获得了强阳性表达；细胞合成Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、VEGF、OC及ALP的能力都明显增强；空白对照组细胞极少见阳性表达；X-gal免疫染色显示Adβgal的转染效率接近100％。同样，经AdBMP-2转染后的成纤维细胞的增殖能力也未见明显改变，hBMP-2基因在mRNA水平及蛋白质水平表达强阳性；细胞合成Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、VEGF、OC及ALP的能力明显增强；空白对照组细胞极少见阳性表达；X-gal组化染色显示Adβgal的转染效率接近100％。在裸鼠肌肉内直接注射AdBMP-2后20d，大体观察到左后肢注射部位软骨性和骨性隆起，较对照侧粗重，X线片下见注射部位出现高密度钙化影像，组织学观察到肌组织内软骨化骨有少量编织骨形成，原位杂交法显示间质单核细胞，软骨细胞，成骨细胞、骨细胞及周围肌肉hBMP-2、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原表达阳性；软骨细胞，间质单核细胞、成骨细胞和血管内皮细胞VEGF表达阳性，免疫组化法显示hBMP-2、Ⅱ型胶原和OC等强阳性；AdBMP-2注射后30d，注射部位骨性隆起增大，X线片下见注射部位高密度钙化结节增大，组织学观察到肌内继续软骨化骨，编织骨组织增多，并有少量板层骨形成。原位杂交法显示骨组织及周围肌肉hBMP-2、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原表达仍阳性，成骨细胞和血管内皮细胞VEGF表达阳性，免疫组化法显示hBMP-2、Ⅱ型胶原和OC等阳性；AdBMP-2注射后60d，注射部位骨性隆起较以前未明显增大，X线片下见注?
唐昊喆[4]2008年在《重组pIRES2-EGFP-hBMP_2载体的构建及其对人牙龈成纤维细胞表型的影响》文中提出牙周治疗的最终目标是实现牙周组织完全功能性再生,其中包括牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨协调一致地、生理性再生。传统的牙周治疗和引导性组织再生技术虽取得一定的临床效果,但总的看来,尚不能达到牙周组织完全再生的目的。组织工程技术引入牙周病治疗的研究领域,为这一目标的实现带来了新的希望。组织工程学研究的主要内容包括种子细胞的来源、生物载体支架的选择以及细胞/载体支架复合体的构建等三个方面。种子细胞的研究是牙周组织工程的重要内容。牙周膜(PDL)细胞是一组具有多向分化潜能的异质性细胞,其中的未分化间充质细胞可分化为成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞,是牙周组织再生的主要细胞。作为种子细胞,PDL细胞具有一定的局限性,它来源有限,须拔除一定量自体牙后才能获得,难以在临床上广泛开展。牙龈成纤维细胞作为牙周组织的组成成分,来源丰富、容易获得、具有很强的生长和自我繁殖能力,在适当的刺激下,可表达成骨细胞表型。人骨形成蛋白2(hBMP2)是BMP家族中诱骨活性最强的一种,也是唯一能单独诱导成骨的因子,在牙周组织再生和修复中具有重要的作用。本研究利用基因转染技术,将hBMP2基因转染牙龈成纤维细胞,赋予其成骨细胞特性,探讨将其作为理想的种子细胞应用于牙周组织工程的可能性。为此,本研究进行了如下几方面的实验:①用RT-PCR方法从人成骨肉瘤细胞系OS-9901中成功克隆了hBMP2基因,测序鉴定完全正确后,通过基因重组技术成功构建了该基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2,该实验结果为后续研究hBMP2对牙龈成纤维细胞表型的影响奠定了基础。②利用脂质体转染法成功地将hBMP2基因转入人牙龈成纤维细胞中,经G418筛选后,获得了稳定表达hBMP2的细胞克隆;通过荧光显微镜、RT-PCR、蛋白印迹和ELISA等方法进一步检测了稳定转染细胞中hBMP2的表达情况,实验结果表明本实验获得了稳定表达hBMP2的转染细胞,此细胞可稳定表达分泌型hBMP2达至少9代以上。③在上述实验的基础上,对稳定表达hBMP2的人牙龈成纤维细胞从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶活性和骨钙素合成以及体外形成矿化结节的能力等方面,对其生物学特性进行了观察。结果显示,部分转染细胞由梭形转化为多角形;细胞倍增时间和细胞增殖周期无明显改变;与未转染细胞相比,转染细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素合成水平明显升高(P<0.01);并在矿化液作用下形成矿化结节。结果提示:hBMP2基因转染后人牙龈成纤维细胞生物学特性发生明显改变,表达成骨细胞表型,具有了某些成骨细胞的特点。本实验结论:外源性的hBMP2基因能够在牙龈成纤维细胞中稳定表达并促进其向成骨细胞转化,因此,可以初步认为hBMP2基因转染牙龈成纤维细胞具能作为牙周组织工程种子细胞的潜在可能。
董广英[5]2003年在《hBMP_2基因转染牙龈成纤维细胞对牙周组织再生影响的实验研究》文中认为牙周治疗的最终目标是实现牙周组织完全功能性再生，其中包括牙槽骨、牙骨质和牙周膜协调一致地、生理性再生。传统的牙周治疗和引导性组织再生技术虽取得一定的临床效果，但总的看来，尚不能达到牙周组织完全再生的目的。组织工程技术引入牙周病治疗的研究领域，为这一目标的实现带来了新的希望。组织工程学研究的主要内容包括种子细胞的来源、生物载体支架的选择以及细胞／载体支架复合体的构建等三个方面。种子细胞的研究是牙周组织工程的重要内容。牙周膜(PDL)细胞是一组具有多向分化潜能的异质性细胞，其中的未分化间充质细胞可分化为成纤维细胞、成骨细胞或成牙骨质细胞，是牙周组织再生的主要细胞。作为种子细胞，PDL细胞具有一定的局限性，它来源有限，须拔除一定量自体牙才能获得，难以在临床上广泛开展。牙龈成纤维细胞作为牙周组织的组成成分，来源丰富、容易获得、具有很强的生长和自我繁殖能力，在适当的刺激下，可表达成骨细胞表型。人骨形成蛋白2(hBMP_2)是BMP家族中诱骨活性最强的一种，也是唯一能单独诱导成骨的因子，在牙周组织再生和修复中具有重要的作用。本研究利用基因转染技术，将hBMP_2基因转染牙龈成纤维细胞，赋予其成骨细胞特性，探讨其在牙周组织再生中的作用，为将其作为理想的种子细胞应用于牙周组织工程提供实验依据。为此，本研究进行了如下几方面的实验： ①将含有pBK-hBMP_2噬菌粒表达载体的大肠杆菌扩增后，以碱裂解法提取pBK—hBMP_2，并进行提纯和酶切鉴定。为以下实验做好准备。 ②利用脂质体将hBMP_2基因转染至人牙龈成纤维细胞中，经G418筛选后获得了稳定表达hBMP_2基因的细胞克隆；在体外培养扩增后，通过原位杂交、免疫组化、夹心ELISA以及转染细胞培养上清液对MC3T3一E1细胞碱性磷酸 第四军医大学博士学位论文2003－05酶活性和骨钙素合成的影响等检测，从mRNA及蛋白水平证实了稳定转染hBMP。基因的人牙龈成纤维细胞能够表达具有一定生物学活性的hBMP。。转染细胞可持续表达有活性的 hBMP。蛋白达 10代以上。 ③在上述实验的基础上，对稳定表达hBMP。的人牙龈成纤维细胞从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶活性和骨钙素合成以及体外形成矿化结节的能力等方面，对其生物学特性进行了观察。结果显示，部分转染细胞由梭形转化为多角形：细胞倍增时间和细胞增殖周期无明显改变；与未转染细胞相比，转染细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素合成水平明显升高u的．01h 组织化学染色表明转染细胞内碱性磷酸酶含量明显升高，并在矿化液作用下形成矿化结节。结果提示：hBMPz基因转染后人牙龈成纤维细胞生物学特性发生明显改变，表达成骨细胞表型，具有了某些成骨细胞的特点。 ④将 hBMP。基因转染的人牙龈成纤维细胞与藻酸钙凝胶复合后，进行体外培养。利用HE染色技术、免疫组化方法和扫描电镜观察细胞在藻酸钙凝胶中的生物学行为。结果显示，转染细胞在凝胶中呈“悬浮”生长，细胞伸展良好，并分泌细胞外基质，表达hBMP。。表明藻酸钙凝胶与基因转染的牙龈成纤维细胞具有较好的相容性。 ⑤将hBMPz基因转染后的自体牙龈成纤维细胞作为种子细胞，与藻酸钙凝胶复合，植入狗的人工牙周组织缺损区。通过组织学观察和组织学测量，评价基因转染牙龈成纤维细胞对牙周组织再生的影响，并以未转染的自体牙龈成纤维细胞和PDL细胞作对照。结果发现：SW后，基因转染的牙龈成纤维细胞组可见近乎完全的牙周组织再生，未见结合上皮长入、根吸收和骨粘连等不良愈合方式。未转染牙龈成纤维细胞组有少数牙位出现骨粘连和根吸收；基因转染细胞组新生牙槽骨、牙骨质以及牙周结缔组织附着量与PDL细胞组无明显差异（P＞0．05），而比未转染牙龈成纤维细胞组有明显多的牙周组织再生（P＜0．01）。此结果提示，牙龈成纤维细胞经hBMP。基因转染后可替 一4－ 第四军医大学博士学位论文2003．05代PDL细胞作为牙周组织工程的种子细胞。 综上所述，本研究利用PBK—hBMP。表达载体成功地将hBMP。基因转入牙龈成纤维细胞，并使其在细胞内稳定表达；基因转染后，牙龈成纤维细胞可表达成骨细胞表型；此细胞在藻酸钙凝胶中生长良好，其生物学特性不受影响；以藻酸钙凝胶为载体，将基因转染的牙龈成纤维细胞应用于牙周组织工程，可很好地促进实验动物根分叉区人工牙周组织缺损的修复。 本实验结论：外源性的hBMP。基因能够在牙龈成纤维细胞中稳定表达并促进其向成骨细胞转化；基因转染的牙龈成纤维细胞与藻酸钙凝胶具有良好的相容性；二者复合可很好地促进牙周组织再生。因此，可以初步认为hBMP。基因转染牙龈成纤维细胞能作为牙周组织工程的种子细胞。
康春雨[6]2005年在《人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达》文中研究表明目的:探讨BMP-2转染骨髓基质细胞的最佳转染条件和方法,制备含人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因的真核表达质粒,将其转染到兔骨髓基质细胞中使之稳定表达hBMP-2。获得可稳定高效表达骨形态发生蛋白的骨髓基质细胞,为最终临床应用奠定实验基础,同时也为探索组织工程化骨的构建方法提供新思路。方法:实验分2组,A组:空白组(未做基因转染);B组:实验组(转染BMP-2基因组)。1、逆转录聚合酶链反应扩增出hBMP-2目的DNA片段。通过连接酶连入真核质粒pcDNA3.1中,经大肠杆菌JM109.2扩增和筛选,构建出重组真核质粒pcDNA3.1 -hBMP-2。2、通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中,用G418进行梯度筛选,从而获得能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。3、采用逆转录酶链反应(RT-PCR )检测培养MSCs中hBMP-2 mRNA的表达。结果:1、重组质粒通过EcoRI酶切后,电泳图示约1.5kb的hBMP-2的目的片段及5.5kb的载体片段,证明重组质粒连接正确。2、经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况,提示转染组hBMP-2的功能片段mRNA量较空白对照组明显增加。经MTT法检测显示转染后的骨髓基质细胞生长速度较快。结论:成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒。转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。
石健[7]2002年在《人骨形态发生蛋白2基因转染对人成纤维细胞增殖及分化影响的实验研究》文中研究说明节段性骨缺损的治疗一直是骨科领域的一大难题。现在临床所采用的包括自体、异体骨移植和假体植入等治疗方法都存在明显的不足。通过对骨折愈合机制的研究发现骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein, BMP)具有诱导间充质细胞向成骨细胞方向分化，进而诱导新骨形成的能力，在骨愈合过程中发挥着重要作用。一部分骨不连就可能是由于骨缺损区内BMP等诱导因子含量不足，使成骨前体细胞无法分化为成骨细胞所致。现在已有学者将外源性重组BMP蛋白应用于骨缺损治疗的临床实验研究。但是由于外源性BMP蛋白半衰期短、生物活性低、价格昂贵、没有理想的载体等诸多原因，使其难以在临床治疗中得到广泛应用。近年来，随着分子生物学技术的飞速进步，BMP基因疗法的研究逐步开展起来。采用BMP基因疗法治疗骨缺损克服了外源性BMP应用中的种种不足，显示出令人鼓舞的应用前景。在BMP基因疗法研究中，选取合适的靶细胞是研究的关键环节之一。成纤维细胞在体内分布广泛、易于培养，在BMP等诱导因子的作用下具有向成骨细胞分化的特性，是一种较理想的靶细胞。体内和体外的实验证实BMP基因同样有诱导成纤维细胞分化为成骨细胞，从而促进成骨的作用。因此采用成纤维细胞作为靶细胞进行BMP基因治疗的临床应用研究将是非常有希望的。为此，本实验首次通过体外实验研究了BMP-2基因转染对人成纤维细胞株KMB-17细胞增殖及分化的影响，探讨人成纤维细胞株作为靶细胞在BMP-2基因疗法研究中应用的可能性，推测BMP-2基因转染的成纤维细胞在体内成骨机制，为进一步应用BMP-2基因进行体内实验研究提供依据。<WP=8>本实验采用脂质体转染法将整合有人BMP-2cDNA的真核表达质粒导入人成纤维细胞株KMB-17细胞内，然后在转染后的不同时期，采用RT-PCR和细胞免疫化学染色的方法检测BMP-2基因的表达情况；采用MTT比色法和流式细胞仪检测BMP-2基因转染对KMB-17细胞增殖的影响；通过对转染BMP-2基因后KMB-17细胞形态和超微结构变化的观察，细胞碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素（OC）产量和Ⅰ型胶原合成量等指标的测定研究BMP-2基因转染对KMB-17细胞分化的影响。并将实验结果进行统计学分析，确定实验组与对照组之间是否有显著性差异。实验结果显示：RT-PCR检测到BMP-2基因转染的KMB-17细胞（实验组细胞）中有BMP-2mRNA存在，而对照组细胞内没有；细胞免疫组化观察实验组细胞在转染后20天内细胞浆中始终有棕黄色BMP-2蛋白阳性染色信号存在；实验组细胞的增殖能力增强，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，另外S期细胞数目增多，增殖指数（PI）升高；细胞形态变为鱼鳞形或多角形，并且有较多分泌颗粒产生，细胞内粗面内质网扩张，线粒体增生，扩张的粗面内质网内可见中等电子密度的蛋白分泌物；在BMP-2表达过程中，实验组细胞ALP活性、OC产量和Ⅰ型胶原合成量增加，与对照组相比有显著性差异（P<0.05）。本实验结果显示，整合在真核表达质粒上的人BMP-2基因在转染人成纤维细胞株KMB-17后，在细胞内可以有效表达，促进细胞的增殖，并通过增强ALP、OC和Ⅰ型胶原等成骨标志物的表达促进KMB-17细胞向骨细胞系分化。表明人成纤维细胞可以作为靶细胞用于BMP-2基因疗法的研究。通过本实验推测BMP基因转染的成纤维细胞在实验动物体内的诱导成骨作用可能是由于BMP基因表达和成纤维细胞分化共同作用的结果。
俞莉敏[8]2004年在《联合应用基因工程与组织工程技术诱导裸鼠脊柱异位成骨的实验研究》文中认为目的：利用基因重组技术将入骨形态发生蛋白2(hBMP2)基因转染修饰人骨髓间充质干细胞(hMSCs)，测定hBMP2的表达情况，并将转染有hBMP2的hMSCs与组织工程材料羟基磷灰石(HA)复合培养，植入裸鼠体内以观察诱导异位成骨的能力，从基因工程与组织工程联合应用角度作一些创新性的尝试，为临床骨修复及脊柱融合治疗提供新的思路和方法。 方法：1．梯度离心法分离培养hMSCs，体外贴壁培养扩增，在倒置显微镜下观察其形态、生长增殖情况以及诱导成骨能力等各种特性，并通过流式细胞仪测定细胞表型。2．以RT-PCR方法克隆扩增出hBMP2的342bp的成熟肽基因片段，将其与原核表达载体PBV220酶切后相连接并测序，构建PBV220-hBMP2的原核基因表达系统，在DH5α大肠杆菌下扩增并42℃诱导表达hBMP2蛋白质，SDS-PAGE检测表达蛋白。3．设计内外两对引物以巢式RT-PCR方法从成人肌肉组织内扩增出hBMP2全长1188bp基因并且行T-A克隆装入pUCM-T质粒载体内，随后将质粒以HindⅢ和XbaⅠ双酶切后与pcDNA3载体相连接，构建pcDNA3-hBMP2的真核表达载体系统，并利用脂质体介导转染hMSCs，通过对转染细胞的RT-PCR、dot-ELISA、免疫组化以及ALP比活性的检测，了解干细胞hMSCs瞬时及稳定表达hBMP2蛋白的情况。4．将转染后的hMSCs与生物组织工程材料HA复合培养4d，光镜和扫描电镜下观察分析细胞在支架上的形态及生长增殖，并将其复合培养植入到裸鼠的脊柱两侧的背脊肌内，4周后取材，制作脱钙切片，观察其诱导新骨形成情况。 结果：1．梯度离心法能分离培养出较为纯化的hMSCs，细胞大都呈梭联合应用基因工程与组织工程技术诱导裸鼠脊柱异位成骨的实验研究中文摘要形贴壁生长，体外培养具有快速增殖及诱导向成骨分化的能力，流式细胞仪测定其细胞表型结果符合间充质干细胞的特性。2.经测序鉴定，克隆扩增出342bP hBMpZ的成熟肤基因片段与Genebank公布的序列完全一致;且经双酶切后DNA电泳和蛋白电泳鉴定证实，成功构建了PBV220一hBMPZ的原核表达系统，并在DHSQ大肠杆菌42℃诱导下能表达16KD的hBMPZ蛋白质，诱导培养4小时后的蛋白表达量达到最高峰。3.巢式Rl二PCR方法能从成人肌肉组织内扩增出经测序完全相符的1188bp的hBMpZ全长cDNA基因，经酶切DNA电泳证实成功构建了PcDNA3一hBMpZ的真核表达载体，通过各种检测，从分子翩A转录水平及蛋白水平上说明了，PcDNA3一hBMpZ的真核表达系统能在hMSCs上表达、分泌外源性的活性hBMPZ蛋白，且蛋白的表达分泌具有稳定性。4.经扫描电镜显示，转染后的hMSCs能在HA上贴附生长，增殖。经组织切片显示转染细胞复合培养的HA植入裸鼠背脊肌内后，有新骨形成。 结论:1.梯度离心法能分离培养出具有快速增殖及诱导向成骨分化潜能的hMSCs。2.由342bp的成熟肤hBMpZ基因片段构建的PBV22O一hBMPZ的原核表达系统，能在DHSQ大肠杆菌的温度诱导下表达产生hBMpZ蛋白质。3.巢式Rl’- pCR方法可扩增出1 1 88 bp的hBMpZ全长cDNA基因，并且成功构建真核表达载体peDNA3一hBMpZ，可在hMSCs上瞬时和稳定表达、分泌外源性的活性hBMPZ蛋白。4.综合应用基因工程和组织工程技术，将转染后的hMSCs与HA复合培养，具有良好的生物相容性，植入裸鼠体内能诱导新骨形成。
李军[9]2004年在《骨形态发生蛋白-2转染骨髓基质细胞的生物学特性和其骨诱导修复作用》文中指出骨缺损和骨折延迟愈合不愈合一直是困扰骨科临床工作的一项难题，每年有数百万的骨缺损和骨折延迟愈合不愈合病例寻求临床治疗。通常，我们仍然应用传统的自体骨、异体骨和人工替代材料的方法解决这个临床难题。但是，自体骨来源有限并造成额外创伤，异体骨有传染疾病和存在免疫排异的潜在危险，人工替代材料在生物相容性、力学性能等方面尚存在诸多问题。自1990年起，大量的研究报告显示，骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)具有促进骨缺损修复和异位成骨的作用。骨形态发生蛋白属于转化生长因子-β超家族成员。其中，骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是骨形态发生蛋白家族中唯一能单独异位成骨和单独促进骨缺损愈合修复的骨生长刺激因子。大量研究表明其在骨科临床上用来促进骨折愈合，进行关节间融合和防止人工假体松动等方面有良好的应用前景。但是，单靠外源性植入往往不能满足骨损伤修复的需要，而且目前尚缺乏理想的载体。基因治疗作为一种新的治疗方法，与植入基因工程重组的BMP相比，理论上讲具有能够进行BMP持续的释放、避免植入载体等多方面的优点。 骨髓基质干细胞(MSCs)因其来源广泛易于获取可以成为基因治疗研究中很好的细胞载体。作为一种具有多向分化能力的前体细胞，骨髓基质干细胞(MSCs)几乎可以从鸡、鼠、兔、羊和人类的所有骨髓中提取分离出，而且，不同于造血干细胞，体外的培养扩增也相对容易。人类骨髓基质干细胞(MSCs)可以在体外的培养15代而不丧失其分化潜能第四军医大学博士学位论文和生物学特性t201。人们已经熟知骨髓基质干细胞(MsCs)具有良好的向骨、软骨、肌键、肌肉和脂肪细胞转化的潜能，这更使它成为骨组织工程种子细胞研究中的首选。 己有较多用逆转录病毒、腺病毒、质粒技术将骨形态发生蛋白(B MP)转染Mscs，局部基因治疗促进骨缺损愈合的研究报道12”261。一般认为，相对于逆转录病毒18一65%125，261，腺病毒20%的转染率[24]，质粒转染的效率较低为11%[241。但由于非病毒质粒易于制备，安全无毒，易形成规模生产，我们的实验选择非病毒的质粒介导骨形态发生蛋白一2(BMP一2)转染骨髓基质干细胞(MSCS)，研究其转染后外源基因表达情况及对骨髓基质干细胞(MSCs)成骨特性的影响，并以新西兰白兔为动物模型，研究其在活体内的成骨效应。骨髓基质干细胞(MSCs)中包括了诱导性骨祖细胞(roPC)和确定性骨祖细胞(DOPC)，后者无需诱导因子的作用本身就具备了成骨分化的能力，而前者在骨形态发生蛋白一2(bone mo印hogenetie protein一2，BMP一2)等成骨刺激因子作用下也向成骨分化[27 .30]。利用脂酷体介导的基因转染技术，将人BMP一2基因导入骨髓基质干细胞(MSCs)，使骨髓基质干细胞(MSCs)在发挥基因治疗的细胞载体的同时，利用自体分泌的活性BMP一2蛋白促进其向成骨细胞系的分化是我们实验的设计思想之一。在对人和兔骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养扩增的过程中，我们也着重观察了不同年龄供体的骨髓基质干细胞的生长特性，为今后进一步进行以骨髓基质干细胞作为细胞载体的基因治疗研究打下基础。实验一构建真核细胞表达载体PcDNA3一hBMPZ[目的]:为了研究人类骨形态发生蛋白一2(bone mo印hogenetie protein一2，BMP一2)转染骨髓基质千细胞(MSCs)的稳定表达以及对转染后骨髓基质干细胞(MSCs)生物学特性的影响，为了进一步研究非病毒载体介导的BMP一2转染MSCs在动物体内成骨修复的作用，构建真核表达载体PcDNA3一hBMPZ。〔方法l:本实验应用基因重组技术将人类全长BMPZcDNA定向克隆到真核表达载体PcDNA3内，形成重组真核表达载体peDNA3一hBMPZO peDNA3质粒是一种由CMv为起动子的真核表达载体，第四军医大学博士学位论文除CMV作为其启动子外，在其多接头位点前还附加一高效增强子SV40，后者是能促进基因转录活性的顺式调控元件。我们用Hind川和Xbal双酶切含有人类骨形态发生蛋白一2全长cDNA的pGEM一3一hBMPZ，回收hBMPZ基因片段，将其连入经Hind川和Xbal双酶切后的真核表达载体PcDNA3，构建重组真核表达载体PcDNA3一hBMPZ。重组的真核表达载体peDNA3一hBMPZ经Hind 111和Xbal双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。[结果〕:双酶切后可形成两条带，分子量分别为1.3kb和5.38kb，符合物理图谱。[结论]:真核细胞表达载体PcDNA3一hBMPZ构建成功。实验二人骨髓基质细胞的获取、体外培养及生物学特性的观察[目的]:体外培养了不同年龄段的人骨髓基质细胞(hMsCs)，对其不同的生物学特性进行观察，为进一步了解人骨髓基质细胞作为基因转载和表达的细胞载体和可作为外源性组织细胞的可行性奠定基础。防法]:取年龄分别为4岁、38岁和58岁的三名志愿者的骼骨骨髓，以20 ml PBS混合并剪碎，以Percon氏液梯度离心，吸取中间白色的单核细胞层其中包含人骨髓基质细胞，用含100，0胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM全培养基37℃，5%COZ饱和度条件下培养，适时换液处理，清除未贴壁的血细胞，保留贴壁的骨髓基质细胞扩增培养，倒置显微镜下每
黄旋平[10]2011年在《hBMP-2基因修饰自体BMSCs移植促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究》文中认为目的牵张成骨(distraction osteogenesis,DO)是利用骨创伤后骨痂愈合机理产生新骨的一项内源性骨组织工程技术,已成为国内外口腔颌面外科研究的热点之一,并且随着近几年来的大量基础和临床研究,展现了该技术在颅颌面整形、肿瘤术后重建、牙槽种植等方面广阔的应用前景。尽管DO技术具有传统手术难以比拟的优势,但过长的牵张和固定时间,以及由此而产生的诸多并发症是限制其临床应用的主要原因。如何提高DO过程中新骨形成的速度和质量,缩短DO治疗时间,减少并发症的发生是目前该领域的研究热点。本研究的目的是拟通过RT-PCR技术从人骨肉瘤中提取并扩增hBMP-2基因片段,通过酶切技术将其插入pcDNA3.1构建成真核表达载体,利用基因转染方法将其导入兔骨髓间充质干细胞(MSCs),并检测其在MSCs中的表达情况。然后将BMP-2基因修饰的自体MSCs植入兔下颌牵张成骨区,通过细胞可控地在需要的时段持续表达BMP-2,诱导MSCs自身或牵张成骨区的多潜能干细胞以及可能的成纤维细胞向成骨或成软骨细胞分化,模拟胚胎骨形成或骨折愈合的自然发生过程,使成骨级联再次启动,重续定向成骨分化,最终达到促进牵张成骨新骨形成与改建,从而大大缩短牵张成骨治疗周期,为进一步在临床上广泛使用牵张成骨技术治疗各种骨创伤或骨缺损奠定基础。方法1取2-3月龄健康新西兰白兔,穿刺抽取双侧股骨大转子部位骨髓约4-6 ml,采用贴壁分离法分离培养骨髓间充质干细胞,通过细胞形态学观察和细胞表面抗原检测对细胞进行鉴定;并向成骨细胞分化诱导培养,通过钙钻法检测碱性磷酸酶表达,茜素红染色观察钙结节形成能力。2采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形成蛋白-2基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA 3.1真核表达载体上,构建成pcDNA3.1- hBMP-2重组质粒。通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。3采用比较成熟的脂质体介导的真核细胞转染技术,将含人BMP-2编码序列的真核表达质粒转染兔BMSCs,通过逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹法(westernblot)以及免疫组化等手段检测BMP-2-mRNA及其蛋白的表达。4取健康新西兰白兔36只随机分为3组,每组12只。实验组(注射BMP-2基因修饰的自体MSCs)、对照组(注射自体MSCs)、空白组(注射生理盐水)。术前3-4周分别根据编号对实验组及对照组动物自胫骨上端穿刺抽取骨髓,并做好对应编号进行传代培养,将兔自体MSCs培养传代至第P3代细胞后用hBMP-2基因转染修饰。建立牵张成骨动物模型,术后延迟期为5天,从术后第6天开始牵张,每天2次,每次0.5mm牵张,牵张长度7mm,随后固定。在固定期第2天,实验组于牵张间隙注射200μl的自体BMP-2基因修饰的自体MSCs液;对照组注射200μl的自体MSCs液;空白组注射200μl生理盐水。分别于牵张结束固定2w、6w分别摄X线片观察骨质愈合、改建情况;在固定术后2周、6周各实验组分别处死动物6只,通过大体病理、HE染色组织切片及扫面电镜观察各实验组新骨形成情况,并通过逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化等手段检测BMP-2-mRNA及其蛋白的表达情况。结果1兔骨髓间充质干细胞的分离培养及向成骨细胞分化诱导: MSCs刚分离接种时,其内血细胞混杂,成分不易分辨。3天后首次换液,可见贴壁细胞呈三角形、成纤维形、多角形或短梭形外观,培养10-20天后细胞长满瓶底,可见成纤维样细胞克隆样增殖,成片生长。传代后观察:传代后细胞增殖速度明显加快,细胞排列整齐有序。使用条件培养基传代培养2周,细胞呈集落生长后开始形成钙结节,茜素红染色阳性,证明MSC已被诱导成为成骨细胞。2经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验成功构建的重组质粒目的基因片段为人BMP-2-cDNA。3通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因转入兔骨髓间充质干细胞,并经RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹法证实,转染pcDNA3.1-hBMP-2后的兔骨髓间充质干细胞内有大量hBMP-2 mRNA的转录和蛋白的表达。4动物实验:于牵张结束固定2w、6w取标本,通过大体病理观察,从新生骨表面看,从质量或者硬度上由高到低排列为:实验组>对照组=空白组;通过X线观察并经过灰度值统计软件分析,在固定期第2周及6周实验组牵张区骨密度明显高于对照组和空白组(p<0.01),在各期对照组和空白组牵张区骨密度比较未见明显差异(p>0.05 );固定2w、6w通过RT-PCR检测并通过电泳图像灰度值分析,实验组BMP-2mRNA相对光密度值显著高于对照组和空白组(P<0.01),而对照组和空白组BMP-2mRNA表达差别不大(P>0.05);通过免疫组化显示:实验组固定2周、6周牵张间隙新生骨组织中均可见BMP-2强阳性表达,实验组平均灰度值低于对照组和空白组(P<0.01),而对照组和空白组间无差别(P>0.05)。结论1全骨髓贴壁换液方法是一种简单实用的分离培养方法,可获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞;原代和传代保持了较高的增殖活力,经过诱导后可向成骨细胞分化,选取组织工程种子细胞以3代以前较为适宜。2成功构建了人骨形态发生蛋白-2基因真核表达质粒pcDNA3.1-hBMP-2,为后续实验奠定基础。3通过脂质体介导的真核转染方法可以将外源hBMP-2基因转入骨髓间充质干细胞,并使其获得较为稳定的表达。4用BMP-2基因修饰的自体MSCs移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成,为临床上缩短牵张成骨治疗周期提供理论依据。
参考文献：
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