·论 著·
HPLC-MS/MS法测定大鼠血浆样品中4-FMA含量
郑茜1，温美强1，2，贾娟1，王涛1，尉志文1，马红娟1，王优美3，徐鹏3，贠克明1
（1.山西医科大学，山西 太原 030001；2.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110000；3.公安部禁毒情报技术中心 国家毒品实验室，北京 100193）
摘 要： 目的 建立一种测定大鼠血浆中新精神活性物质4-氟甲基苯丙胺（4-fluoromethamphetamine，4-FMA）含量的高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）分析方法，为4-FMA在大鼠体内的毒物代谢动力学研究提供方法基础。方法 大鼠血浆样品中加入内标物甲基苯丙胺（methamphetamine，MA），经甲醇沉淀蛋白后采用Poroshell 120 EC-C18色谱柱分离，0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相，流速为0.4mL/min，采用电喷雾离子源在多反应监测模式下进行检测。结果 血浆样品中4-FMA在质量浓度5～1000ng/mL范围内线性关系良好（r＞0.999），检出限为3ng/mL，定量限为5ng/mL。准确度以相对误差（relative error，RE）表示，在±5%范围内，日内精密度与日间精密度［以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示］＜9%，提取回收率＞90%。血浆样品的分析检测在2.5min内完成。结论 本研究建立了大鼠血浆样品中4-FMA的HPLC-MS/MS测定方法，该方法准确、快速、简单、灵敏，适用于4-FMA的代谢动力学研究。
关键词： 法医毒理学；高效液相色谱-串联质谱；4-氟甲基苯丙胺；血浆；大鼠
新精神活性物质（new psychoactive substance，NPS）是不法分子为逃避打击而对管制毒品进行化学结构修饰得到的毒品类似物，具有与管制毒品相似或更强的兴奋、致幻、麻醉等效果，成为继传统毒品、合成毒品后全球流行的第三代毒品[1]。
成都东郊龙泉驿片区原主要为坡地场地，地形起伏较大，原建筑物（构筑物）主要集中于较为平坦地区。随着成都市城市发展，东扩进程的推进，大量山区土地得到使用，但因地形起伏大，建筑场地使用过程中不可避免的涉及到场地大挖大填工作，建（构）筑物建造前需对场地边坡进行稳定性评价及相应的治理设计。边坡问题作为拟建物地基基础设计前的主要问题摆在了工程勘察设计人员面前。
4-氟甲基苯丙胺（4-fluoromethamphetamine，4-FMA）属于苯丙胺类NPS[2]，能够通过诱导多巴胺、去甲肾上腺素及5-羟色胺的释放，产生较强的神经兴奋和致幻作用，活性比苯丙胺及甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）更强[3]。国家市场监督管理总局（原国家食品药品监督管理总局）于2015年将其列入《非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》进行管控。由于4-FMA出现较晚，管制较迟，对于4-FMA的检测研究还未充分开展，目前报道的生物检材涉及头发[4]、唾液[5]及血清[6]样品。本研究拟建立大鼠血浆中4-FMA的高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）分析方法，为4-FMA在大鼠体内的代谢动力学研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
6460三重四级杆高效液相色谱串联质谱仪（美国Agilent公司），TGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂），Vortex-Genie 2涡旋混合器（美国Scientific Industries公司），移液枪（德国Eppendorf公司），Milli-Q®Integral超纯水系统（德国Merck Millipore公司）。
4-FMA、MA由公安部禁毒情报技术中心提供；甲醇、乙腈为色谱纯，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；实验用水为实验室自制超纯水。
1.2 实验动物
Wistar大鼠，质量约250 g，购自山西医科大学动物实验中心。雌雄分笼，自由摄食和饮水，标准饲料喂养。室温控制在25℃左右，相对湿度维持在60%～70%，昼夜周期条件为12h光照、12h黑暗。
1.3 仪器条件
标准曲线：取100 μL空白血浆，加入不同质量浓度的4-FMA标准曲线工作液或质控样品工作液10 μL，配成质量浓度为5、10、25、50、100、250、500、1000ng/mL的血浆样品，按1.5节处理后进样分析。
（2）敏捷团队组建。按照项目背景，选择部署单一或多种模式，并按照任务特性选择团队成员。其中，须注意审慎设置团队规模，宜小不宜大，以此保持敏捷性。对待不可忽视的人员缺口时，应优先考虑团队内部挖潜与培育。同时，亦可减少目标产品初期迭代目标。
色谱柱为Poroshell 120 EC-C18柱（50mm×3.0mm，2.7 μm，美国Agilent公司），流动相由含0.1%甲酸的水溶液与含0.1%甲酸的乙腈溶液（体积比为85∶15）组成，流速为0.4mL/min，柱温25℃，进样量2μL。
检出限和定量限：考察4-FMA质量浓度为1、3、5ng/mL时的信噪比（S/N），以S/N≥3作为检出限（limit of detection，LOD），S/N≥5作为定量限（limit of quantitation，LOQ）并对LOQ进行准确度和精密度考察。
提取回收率与基质效应：结果显示提取回收率＞90%，RSD＜5.62%。4-FMA质控样品低、中、高3个质量浓度的内标归一化基质因子分别为101.0%、97.0%、100.0%，大鼠血浆基质对4-FMA测定的影响可以忽略，详见表2。
1.4 储备液、工作液及校正标样的制备
分别精密称取10 mg 4-FMA和MA标准品于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成1.0 mg/mL的4-FMA和MA储备液。精密吸取MA储备液适量，用甲醇稀释至质量浓度为2.5μg/mL的MA内标工作液。取4-FMA储备液适量，经甲醇逐级稀释，得到质量浓度分别为 10 000、5 000、2 500、1 000、500、250、100、50 ng/mL的标准曲线工作液和质量浓度分别为100、2500、10000ng/mL的低、中、高质量浓度质控样品工作液。
1.5 血浆样品处理
2011年，黄委与流域8个省（自治区）水利、环保部门共同签署《黄河流域突发性水污染事件信息通报与沟通协作框架意见》。该成果不仅是黄河突发性水污染事件应急机制在流域层面的拓展，也是建立和完善流域与区域相结合、水利与环保相联合的黄河水资源保护管理体系的一项重要实践。
精密吸取血浆样品100μL，置于1.5mL塑料离心管中，加入内标MA（2500ng/mL）10μL、甲醇500μL，涡旋混合30 s，以离心半径10 cm，13 000 r/min，离心10 min，取上清液400 μL，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样量为2μL。
1.6 大鼠体内实际应用
取Wistar大鼠3只，体质量250 g，灌胃给予4-FMA 26mg/kg，于给药前及给药后0.5、1.0、3.0h分别通过眼眶取血0.5mL。采用1.5节方法处理并检测分析（超出线性范围者用超纯水稀释后再进行分析）。
1.7 方法学考察
标准曲线：以4-FMA的质量浓度为自变量（x），4-FMA与MA的定量离子对峰面积比值为因变量（y），采用加权最小二乘法（权重系数1/x2）进行线性回归，可得4-FMA血浆质量浓度为5～1000ng/mL时的标准曲线回归方程为：y=0.0004+0.0031x（r=0.9992）。
1.3.1 色谱条件
直流电通过三相逆变器输出三相交流电,经滤波后流向电网,三相电网电压平衡时,根据基尔霍夫电压定律,在两相静止坐标系下,三相并网逆变器的数学模型可以表示为
1.3.2 质谱条件
精密度、准确度：配制低、中、高3个质量浓度（10、250、1000ng/mL）的血浆质控样品，按1.5节处理后进样分析并计算，每个质量浓度平行6份。同日测定，得日内精密度；连续测定3d，得日间精密度。精密度均以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示，准确度均以相对误差（relative error，RE）表示。
提取回收率与基质效应：取低、中、高3个质量浓度的血浆质控样品100μL，按1.5节处理后进样分析，设待测物MRM峰面积为A。取低、中、高3个质量浓度的质控溶液10 μL，加入内标溶液10 μL和经前处理后的6种不同来源的空白血浆提取液600μL，进样分析，记录待测物MRM峰面积为B，将待测物与内标物MRM峰面积比值设为X，按公式A/B×100%计算待测物提取回收率。另取低、中、高3个质量浓度的血浆质控溶液10μL，分别依次加入内标溶液10μL、甲醇600μL，进样分析，记录待测物与内标物MRM峰面积比值为C。按公式X/C×100%计算待测物内标归一化基质因子[7]。每个质量浓度均平行6次。
稳定性：分别考察低、中、高3个质量浓度的血浆质控样品在24 h内3次反复冻融的稳定性[8]（25℃→-20℃）、长期冻存稳定性（-20℃冰箱冷冻放置15d）、样品制备后室温（25℃）放置4h的稳定性以及4℃放置24h的稳定性，计算不同处理后样品检测的准确度和精密度，如结果绝对值均不超过15%则认为稳定性良好。
残留效应：在高质量浓度（1000ng/mL）样品进样后立即进一个空白样品，考察待测物与内标的残留效应。
2 结 果
2.1 仪器条件的优化
质谱条件优化通过调节质谱的碎裂电压和碰撞能量值，使得离子的响应值最佳。4-FMA和MA的MRM离子及所需裂解电压、碰撞能量等见表1。
表1 4-FMA、MA的质谱参数
2.2 方法学考察
专属性：血浆中内源性物质不干扰4-FMA与MA的测定，具有较高的专属性，如图1所示，4-FMA和MA的保留时间分别为1.93和1.51min。
市政府于2010年年底出台《关于加快推进郊区集约化供水的实施意见》，将郊区集约化供水列入市政府实事项目和重大工程重点推进。截至2013年11月底，上海市陆域部分的集约化供水工作已完成，共关闭郊区中小型水厂150座,取消内河取水口94个，注销深井取水许可证161个，达到了集中保护水源、优化水厂布局、压缩地下水开采量、提高供水水质和管理服务水平、改善郊区发展环境等预期效应，受到广大郊区市民的欢迎。
专属性：将空白血浆、空白血浆加标样品和染毒大鼠血浆样品按1.5节处理后进样分析。
检出限和定量限：4-FMA血浆样品的LOD为3 ng/mL，LOQ为5 ng/mL，在质量浓度为5 ng/mL时样品的准确度和精密度分别为0.16%和3.21%。
精密度、准确度：4-FMA 3个质量浓度质控样品的日内精密度和日间精密度RSD值均小于8.16%，准确度为-2.0%～3.2%。精密度和准确度均良好，见表2。
采用电喷雾离子源，离子源温度为300℃，雾化器温度305℃；氮气流速为11.0 L/min，毛细管电压4000V；采用正离子模式、多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式扫描分析。
图1 4-FMA与内标物MA的MRM色谱图
A、B：空白血浆样品；C、D：空白血浆加入内标样品；E：5ng/mL 4-FMA添加血浆样品；F：大鼠染毒30min后样品。4-FMA的离子对为168.1/109.0；MA的离子对为150.1/91.1。
表2 4-FMA血浆样品的精密度、准确度、提取回收率和基质效应
稳定性：处理后样品经24 h内3次反复冻融（25℃→-20℃）、长期冻存（-20℃，15d）、室温（25℃）放置4 h、4℃放置24 h后均能稳定存在，检测样品的相对偏差为-10.7～9.2%，符合要求。
残留效应：结果显示，待测物与内标在高浓度进样后均没有残留。
2.3 实际应用
采用标准曲线法计算得到大鼠血浆中4-FMA的含量，详见表3。
由图2可知，曲线有2个谐振点，分别位于低频处和高频处。当外加电磁波沿Z轴方向射入超材料，此时电场沿X轴极化，磁场沿Y轴方向。由于两侧金属环之间有一定距离且开口方向相反，在电磁波的作用下，2个金属环产生平行于开口方向的电偶极子和垂直于谐振平面的磁偶极子，并且二者的共振存在一定的相位差，因此在这种情况下出现2个不同的振动状态，即图2中的低频谐振和高频谐振状态。
表3 大鼠给予4-FMA前及给药后不同时间的血药质量浓度 （ng/L）
3 讨 论
目前，国内外对苯丙胺类的毒品检测多采用气相色谱（gas chromatography，GC）[6]、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[9]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[10]、LC-MS/MS[11-12]等方法。相对于其他方法，本研究所建立的HPLC-MS/MS法不需要衍生化，分析时间只需2.5 min；检测灵敏度高，能达到3 ng/mL；采用MRM模式，选取两个离子对定性，准确度好。在实际毒品检测实践中，所能获得的血液样品量往往较少，毒物含量很低，且要求很快得出结果。本研究所建立的HPLC-MS/MS法能满足血浆样品中4-FMA的检测需求。
（1）Hofstede（1990）量表。他从人类文化学的角度对企业文化做了深入的探讨，构建了由企业价值观和实践两部分组成的企业文化量表，其中价值观是核心，具有三个维度，分别是安全需要、关注工作和权力需求；实践部分则由六个独立的成对维度组成，分别是过程导向-结果导向、员工导向-工作导向、本地化-专业化、开放-封闭、控制松散-控制严格、规范化-实用化。全套问卷共有135道题目，通过实证研究，Hofstede认为不同组织间的企业文化主要是由其习惯决定的，价值观层面的差异较小。
本研究所建立的大鼠血浆样品中4-FMA含量的HPLC-MS/MS测定方法，以MA为内标，采用甲醇沉淀蛋白后直接进样分析，操作简单、快速，可避免因操作繁琐引起误差，并且降低了检测成本。方法学考察结果表明，本方法准确性、精密度、提取回收率均良好，LOQ达到5ng/mL，能够对微量样品进行准确定量。实际应用证明本方法能够满足大鼠体内毒代动力学研究检测要求，为了解4-FMA在动物体内的动力学特征和分布，以及对其毒理学研究和NPS滥用的司法鉴定提供了方法基础。
数学全息定义的教学一般应强化．这里的强化主要指“三多”和“三化”，“三多”即多花时间、多思考(理解)、多应用，“三化”即正反例强化、逐步内化、螺旋深化．教师可通过设计一些典型的问题情境，让学生经历概念形成、概念理解、概念应用、概念分析的过程，并应组织好生生交流、师生互动等教学活动．非全息定义的教学一般不宜强化，只宜淡化，即不能要求过高，更不能深挖．
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Determination of the Content of 4-FMA in Rat Plasma Samples by HPLC-MS/MS Method
ZHENG Qian1,WEN Mei-qiang1,2,JIA Juan1,WANG Tao1,WEI Zhi-wen1,MA Hong-juan1,WANG Youmei3,XU Peng3,YUN Ke-ming1
（1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China；2.Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110000,China；3.National Narcotics Laboratory,Drug Intelligence and Forensic Center of Ministry of Public Security,Beijing 100193,China）
Abstract： Objective To develop a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）method for the determination of the content of 4-fluoromethamphetamine（4-FMA）in rat plasma,and to provide a methodological basis for the study of the toxicokinetics of 4-FMA in rats.Methods Rat plasma samples were added into internal standard methamphetamine（MA）.Its proteins were precipitated with methanol and then separated with Poroshell 120 EC-C18chromatographic column.A 0.1%formic acid aqueous solution and a 0.1%formic acid acetonitrile solution were used as the mobile phase at the flow rate of 0.4 mL/min.Electrospray ionization source was used for detection in the multiple reaction monitoring（MRM）mode.Results The linear relationship was good when the mass concentration of 4-FMA in plasma samples was in the range of 5-1 000 ng/mL （r＞0.999）.The limit of detection（LOD）was 3 ng/mL and the limit of quantification（LOQ）was 5 ng/mL.The accuracy was expressed as relative error（RE）,and in the range of±5%,the intra-day precision and inter-day precision（relative standard deviation,RSD） less than 9%,and the extraction recovery rate was more than 90%.The analysis and detection of plasma samples were completed within 2.5 min.Conclusion This study developed a HPLC-MS/MS method for the determination of 4-FMA in rat plasma samples.This method is accurate,rapid,simple and sensitive and can be applied to the study of toxicokinetics of 4-FMA.
Keywords： forensic toxicology；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；4-fluoromethamphetamine；plasma；rats
中图分类号： DF795.1
文献标志码： A
doi： 10.12116/j.issn.1004-5619.2019.04.007
文章编号： 1004-5619（2019）04-0419-04
基金项目： 国家科技基础性工作专项资助项目（2015FY111400）；国家重点研发计划资助项目（2017YFC0803504）；中国博士后科学基金资助项目（2018M641678）
作者简介： 郑茜（1988—），女，博士，在站博士后，讲师，主要从事天然药物化学及药物代谢动力学研究；E-mail：qianz88@163.com
通信作者： 徐鹏，女，博士，副研究员，主要从事毒品和新精神活性物质研究；E-mail：pengxu750@163.com
通信作者： 贠克明，男，博士，教授，主要从事法医毒物动力学研究；E-mail：yunkeming5142@163.com
（收稿日期 ：2018-06-19）
（本文编辑：严慧）
标签：法医毒理学论文; 高效液相色谱-串联质谱论文; 4-氟甲基苯丙胺论文; 血浆论文; 大鼠论文; 山西医科大学论文; 沈阳药科大学论文; 公安部禁毒情报技术中心国家毒品实验室论文;