情绪应激体液免疫调节作用的影响因素，本文主要内容关键词为：免疫调节论文,体液论文,情绪论文,因素论文,作用论文，此文献不代表本站观点，内容供学术参考，文章仅供参考阅读下载。
分类号 B845
1 前言
近年来，国内外的大量动物和人类实验已经证实了应激的免疫调节作用[1-3]。进一步的研究表明，不同条件的应激对免疫系统发挥不同的调节作用。早在1969年，Solomon的实验已证实，不同类型的应激源对大鼠鞭毛蛋白抗体反应产生不同的作用[4]。目前研究认为，除了应激源的性质以外，应激源的强度、持续时间和频率、应激源与抗原免疫的间隔时间（免疫前还是免疫后给予应激刺激及免疫前或后什么时间给予）、测定的免疫参数、个体差异等因素均与应激是否能引起免疫调节作用密切相关，尤其是应激源的强度、频率和应激源与抗原免疫的间隔时间[4]。然而，上述研究结果多是来自物理应激模型（足底电击和束缚应激）的研究，有关情绪应激体液免疫调节作用的影响因素的研究则少有报道。为此，我们设计了以给予定时喂水训练大鼠空瓶刺激为情绪性心理应激源，以抗特异性抗原OVA的抗体水平和脾脏指数为体液免疫指标，探讨了应激源持续时间、频率、抗原免疫前或后给予应激刺激等因素对情绪应激体液免疫调节作用的影响。
2 材料和方法
2.1 动物
三组实验共90只雄性Wistar大鼠，体重250-300克，鼠龄3个月左右，购于中国科学院遗传所动物中心。每只大鼠单笼喂养，控制室温(20±3℃)和照明（12小时照明／12小时黑暗，每天早7时开始照明）。适应期内所有动物自由饮食、水，适应期后动物定时饮水、自由饮食，饲料由北京市实验动物中心提供。
2.2 实验程序
2.2.1 实验一 抗原免疫前3次，每次30分钟的情绪应激刺激对大鼠体液免疫功能的影响：动物分成3组（10只／组），即情绪应激组(ES)、生理应激组(PS)和对照组(C)，其中ES组动物和C组动物在一个房间内单笼喂养，而PS组动物则在另一房间内单笼喂养。所有动物经一周的适应期后进行定时喂水训练10天，每天早9:00-9:30给予动物饮水，其余时间不给水。然后分别在进入实验室的第18,20,23天给予情绪应激组大鼠空瓶刺激即在这3天的9:00-9:30饮水期间仅给予情绪应激组动物空瓶而无水喝，生理应激组动物在这3天同样没有水喝但亦无空瓶刺激，对照组动物则一直定时饮水。第24天对所有动物进行抗原免疫，抗原是用卵清蛋白（grade V ovalbumin,OVA;Sigma公司产品）溶于磷酸缓冲液(PBS)(pH=7.3)，再用等量的弗氏完全佐剂（Gibco公司产品）乳化而成，浓度为200μg/ml，每只大鼠腹腔注射100μg/0.5ml OVA。二周后对所有动物进行断头、取血和脾脏。详见表1。
表1 实验程序一
注：ES—空瓶刺激，PS—单纯缺水刺激，N—正常定时饮水。
2.2.2 实验二 抗原免疫后3次，每次30分钟的情绪应激刺激对大鼠体液免疫功能的影响：30只动物的分组情况、适应期和定时喂水训练与实验一完全相同，不同的是在第18天(day0)对所有动物进行OVA抗原免疫，方法和剂量同前。然后分别在抗原免疫后第3、5、8天给予情绪应激组动物30分钟(9:00-9:30)空瓶刺激，生理应激组动物在此期间没有水喝亦无空瓶刺激，对照组动物一直定时饮水。抗原免疫后第14天对所有动物断头取血和脾脏。（详见表2）
表2 实验程序二
天数
组别 ────────────────────────────
1-7 8-17 18 21 23 26
31
ES组 适应期 定时喂水 OVA注射
ES
ES
ES
断头取血
PS组 适应期 定时喂水 OVA注射
PS
PS
PS
断头取血
C组 适应期 定时喂水 OVA注射
N
N
N 断头取血
2.2.3 实验三 抗原免疫后14次，每次10分钟的情绪应激刺激对大鼠体液免疫功能的影响：30只动物分组同前。经一周适应期后，进行定时喂水训练10天。定时喂水训练改为每日两次，每天早9:00-9:10和晚21:00-21:10给予饮水，其余时间不给水。第18天对所有动物进行免疫，抗原注射方法和剂量同前。从免疫当天(day0)晚21:00-21:10开始给予情绪应激刺激，刺激方法同前，而刺激的给予则是一天一次（早或晚）或一天两次，两周内共给予14次（见表3）；PS组动物在ES组接受空瓶刺激的同时既无水喝，也无空瓶刺激；C组动物则一直定时饮水。这样连续给予两周，于免疫后第14天对所有动物断头取血和脾脏。
表3 实验程序三
2.3 指标测定
血清抗OVA IgG抗体测定采用标准酶联免疫吸附法(ELISA)，酶标仪为美国BIO-RAD公司产品。基本步骤如下：①用浓度为1ma/ml的OVA包被96孔板，在4℃下过夜，用含0.05%Tween20的PBS洗板2次，双蒸水洗1次；②用含0.005μlTween20/ml的1%BSA即牛血清白蛋白在室温下封闭1小时，洗板同上；③将稀释度为1:100的待测血清及BSA加入96孔板中，100μl／孔，室温下放置1小时，洗板同上；④用BIO-RAD公司生产的过氧化物酶标记的羊抗－鼠IgG在室温下包被1小时，50μl／孔，洗板同上；⑤将底物加入96孔板中，100μl／孔，室温下放置5分钟，直到颜色充分显现；⑥用2N硫酸终止反应，50μl／孔；⑦在酶标仪上读吸光度OD值）；脾脏指数为脾脏重量mg与体重g之比值。
3 结果
实验一：如图1和2所示，三组动物的抗OVA抗体水平和脾脏指数间比较均无显著性差异(p>0.05,t-test)而且无趋势性，结果说明抗原免疫前3次，每次30分钟的情绪应激不影响大鼠的体液免疫功能。
实验二：如图3和4所示，三组动物的抗OVA抗体水平和脾脏指数间比较虽无显著性差异(p>0.05)，但均以情绪应激组动物为最低，生理应激组动物为最高，呈现一定的趋势。结果说明抗原免疫后3次，每次30分钟的情绪应激能在一定程度上降低大鼠的体液免疫功能。
实验三：如图5和6所示，情绪应激组动物的抗OVA抗体水平和脾脏指数均较生理应激组动物显著降低(p<0.05,p<0.01)。结果说明抗原免疫后14次，每次10分钟的情绪应激能显著降低大鼠的原发性体液免疫功能。
4 讨论
情绪应激的免疫调节作用已经被研究证实，但有关影响应激免疫调节作用的因素却一直是各国学者所争论的话题。目前认为主要影响应激免疫调节作用的因素包括应激源的性质、强度、持续时间、频率，应激的给予与抗原免疫的间隔时间，观察对象的个体差异，测定的免疫参数，抗原的剂量、性质等。例如，Moynihan JA等研究表明，KLH(keyhole limpethemocyanin)首次免疫后24小时，给予大鼠单独一次足底电击能导致大鼠的继发性抗KLH的IgG反应降低[5]。Rinner I等报道了大鼠外周淋巴细胞免疫应答的变化取决于应激源强度，他所应用的是抚摸／束缚应激模型，结果表明，温和应激具有免疫增强作用，而强烈的束缚应激则引起大鼠淋巴细胞激活的显著降低[6]。还有研究证实，应激引起的免疫学变化的性质和量取决于应激刺激和抗原免疫间的间隔时间即免疫前还是免疫后给予应激和免疫前或后什么时间给予[7,8]。以上这些研究均采用的是物理应激模型。
我们的实验采用的是本实验室新建的情绪应激模型，以给予经定时喂水训练大鼠空瓶刺激为情绪应激源，分别设计了三个实验，观察了应激源给予的频率及应激源在抗原免疫前或后给予等两种因素对此情绪应激体液免疫调节作用的影响。首先，实验一和二的研究结果表明，在应激源强度相同的情况下，抗原免疫后给予动物情绪应激刺激对免疫功能的影响较抗原免疫前给予情绪应激刺激明显。这一结果与Okimura和Nigo所做的一系列实验结果不一致，他们的结果表明，绵羊红细胞(SRBC)免疫后第2天开始，连续给予动物的束缚应激对脾空斑形成细胞(PFC)反应无作用[9]。这种不一致可能是由于两个实验所采用的应激源和抗原类型不同所导致的。我们的研究结果提示，抗原激活的免疫系统对应激性刺激更敏感。已知由特异性抗原激活的特异性免疫反应经过以下几个阶段：巨噬细胞的抗原递呈、T和B淋巴细胞活化及最后的效应阶段即T淋巴细胞分泌各类细胞因子和B淋巴细胞分泌、合成抗体。这些免疫细胞（巨噬细胞、T细胞和B细胞）表面存在多种激素、递质的受体，细胞的激活状态直接影响受体的表达。研究证实，B淋巴细胞只有在被抗原激活生成抗体时才能表达β－肾上腺素能受体[10]。因此免疫系统只有在激活状态下，应激激活的HPA轴和SNS所释放的激素和神经递质才能与免疫细胞表面的受体相结合而发挥调节作用。
其次，实验二和三的研究结果表明，抗原免疫后3次、每次30分钟、无规律的情绪应激刺激只能一定程度地降低大鼠体液免疫功能，而14次、每次10分钟、无规律的情绪应激刺激则显著抑制其体液免疫功能。结果提示，应激的免疫调节作用与应激呈现的频率而不是每次应激的持续时间的关系更为密切。这与Lysle DT等的研究结果相一致。他们的研究同样发现，足底电击对大鼠淋巴细胞有丝分裂原反应的抑制作用与每日给予足底电击的次数直接相关而与每次电击的持续时间无关[11]。我们的实验提示，反复的情绪应激刺激对免疫系统发挥更为显著的调节作用。
综合上述研究结果，我们的实验证实抗原免疫后，反复多次的以空瓶刺激诱发的情绪应激能显著抑制大鼠的原发性体液免疫功能。