宋宏彬[1]1999年在《人源抗HBsAg抗体Fab段及dsFv基因的克隆和表达》文中指出抗体技术经历了第一代抗体——血清多克隆抗体，第二代抗体——单克隆抗体，又发展到第三代抗体——基因工程抗体。基因工程抗体技术具有多方面的发展潜力，这一技术能够避开免疫而直接获得抗体，特别是人源抗体，这为人源抗体的生产及应用开辟了广阔的前景。 我们首先应用噬菌体抗体库技术筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体，获得了一株亲和力较高的人源抗HBsAg噬菌体，酶切分析发现其具有完整的重链基因，但轻链缺失。利用全自动测序仪测定了其重链基因序列，经分析说明获得的人源抗HBsAg噬菌体重链基因可变区(V_H)属于人V_HⅠ亚群。并用ELISA及竞争抑制试验测定了其活性及特异性，证实此抗体片段仍具有较好的抗原结合活性和特异性。为了提高抗体的亲和力，我们进行了链替换试验：将PCR扩增的人抗体轻链基因，插至已克隆有人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体重链Fd基因的噬菌粒中，构建成轻链替换文库，经亲和淘洗，从该文库中筛选出了与重链Fd基因相匹配的轻链基因。链替换后，噬菌体抗体(phab)的ELISA光吸收值(A)从0.72±0.02提高到最高为1.24±0.10，说明其亲和力得到了提高。抑制实验证实，所筛选出来的phab具有抗HBsAg的特异性。序列分析了ELISA光吸收值(A)最高的5株phab的轻链基因，结果表明，3株K链的碱基序列基本一致，属V_kⅢ亚群；2株λ链的基因序列相同，均属VλⅠ亚群。高效表达是基因工程抗体走向临床的关键问题之一，我们进一步将抗HBsAg抗体的轻链(L)和重链Fd段基因，分别克隆于pET20b质粒中并分别转化到大肠肝菌BL21(DE3)，IPTG诱
陈云雨[2]2009年在《人源抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性研究》文中认为细胞间黏附分子-1(ICAM-1)作为淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)的配体可介导白细胞与血管内皮细胞的黏附及白细胞穿出血管壁,同时促使更多中性粒细胞和嗜酸性粒细胞转移至炎症区,释放更多的氧化自由基、蛋白酶和花生四烯酸等代谢产物,加重组织损伤程度,进而造成病理损伤,在炎症性疾病的发生与发展过程中发挥重要作用,ICAM-1成为炎症相关性疾病治疗新的靶点。本研究旨在利用噬菌体展示技术应用Tomlinson I+J噬菌体抗体库制备人源抗ICAM-1单链抗体,并对工程菌进行表达条件优化、目的蛋白纯化工艺研究及生物学活性研究。人血管内皮细胞-单核细胞黏附抑制实验表明,制备的人源抗ICAM-1单链抗体能够有效抑制血管内皮细胞与单核细胞之间的黏附,对炎症性病理反应有较强的抑制作用,本课题研究为临床炎症相关性疾病的初步治疗奠定基础。
于长明[3]2000年在《人源抗甲型肝炎病毒抗体基因的克隆及表达研究》文中进行了进一步梳理抗体分子的研究及应用一直是免疫学乃至整个生物学研究的热点。在生物制品中，抗体类占了很大的份额，因此抗体工程的发展倍受人们的关注。抗体技术由最初的血清多克隆抗体发展到杂交瘤单克隆抗体技术，直到目前的基因工程抗体技术，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，将抗体工程推到了一个新的发展阶段。甲型肝炎病毒(HAV)是危害人类健康的重要致病原之一，目前已有多种用于接触前预防的甲肝疫苗。但对于接触后预防或短期到HAV高流行区的旅游者的预防，则多采用免疫球蛋白作被动免疫。血源性免疫球蛋白虽然效价高，应用效果好，但可能被血源病原体污染，且浪费血源。因此基因工程人源抗体有望成为接触后预防的首选制剂。为此，我们用HAV的细胞培养抗原对已有的人源噬菌体抗体库进行筛选，获得了与HAV抗原有结合活性的噬菌体抗体，并改建成Fab及全分子抗体，并用不同的表达系统进行了表达。 一、人源抗HAV Fab基因的克隆及可溶性表达 用抗体捕获的HAV抗原对噬菌体抗体库进行三轮淘筛，筛选出与HAV抗原有特异性结合能力的抗体，并对其重、轻链基因进行了序列测定，分析表明重链Fd基因属IgG1亚类，轻链基因属κ亚类。在此基础上构建了可溶性Fab表达载体，并获得可溶性表达。
宫爱艳[4]2005年在《鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库的构建研究》文中进行了进一步梳理禽流感(avian influenza)是由A型流感病毒引起的一种禽类感染或疾病综合症。禽流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae),为单股负链RNA病毒。甲型流感病毒除感染人外,还可感染猪、马、海洋哺乳动物和禽类。此病毒极易在禽鸟间散播,除可引起家禽大量死亡外,也可引起感染人的死亡。因此,禽流感病毒是一种危害禽类和人类健康的重要病原微生物。 对鸡源抗禽流感病毒抗体的研究不仅对疾病的预防和治疗有一定的作用,而且对进一步研究病毒在体内的致病机制提供了有利的工具。 我们首次运用噬菌体抗体库技术构建鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库。首先,我们从免疫鸡中提取外周血和脾脏,分离淋巴细胞,提取细胞总RNA,以其为模板,采用Oligo-dT引物逆转录合成cDNA,用一组鸡IgG Fab特异性引物,通过PCR方法扩增出一组抗体轻链基因和重链Fd片段基因。将抗体轻链基因克隆入pComb3噬菌粒载体,转化大肠杆菌XLI-Blue构建了库容量为2.5×10~5的轻链基因抗体库,轻链基因的克隆效率约为50%。进一步将抗体重链Fd基因克隆入轻链抗体库中,转化大肠杆菌,构建了库容量为1×10~5的鸡源抗禽流感病毒Fab抗体库。经鉴定,抗体轻、重链基因的克隆效率为40%。经辅助噬菌体感染,得到噬菌体滴度1×10~(13)CFU/ml的鸡源噬菌体抗体库。用固相化AIVAg,对所构建的噬菌体抗体库进行了五轮的富集,第五轮洗脱下的噬菌体较第一轮增加了100倍,含有抗体轻链基因和重链Fd基因的克隆,也由富集前的15%增至65%。挑取几个阳性克隆进行测序,获得的序列与GeneBank相应的鸡IgG基因序列具有较高的同源性。 鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库的构建成功为抗禽流感病毒特异性抗体的筛选及构建鸡源抗禽流感病毒全抗体库打下了良好的基础,并为进一步研制用于禽流感治疗和抗禽流感病毒单抗制剂奠定了基础,同时也为研究禽流感病毒的体内致病机制提供了条件。
严兴[5]2002年在《重组人源性抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达、纯化与活性鉴定》文中指出乙型肝炎是一种世界范围的流行性传染病,但目前还没有有效的治疗手段,因此预防是防治乙型肝炎的重点。血源性抗乙肝表面抗原抗体可用于乙型肝炎的被动免疫,防止乙型肝炎的母婴垂直传播。但是,血源性抗体的来源有限且具有潜在的传染性,给它的应用带来限制。开发重组人源性抗HBsAg抗体,可以实现抗体的工程化大规模生产,而且使用安全,可以弥补血源性抗体的缺陷,取代血源性抗体,因此具有良好的社会效益和经济效益。 我们将针对HBsAg preS2区表位的人源性单链抗体基因转入大肠杆菌中表达,表达量可达菌体总蛋白的30%,并且目的蛋白在胞内形成包涵体。经Ni离子金属螯合亲和层析、凝胶层析两步纯化,重组抗体的纯度达到97%。将纯化后的单链抗体进行了复性。在优化复性方法后,在抗体浓度为0.34mg/mL时,蛋白收率可达50%。而且复性后的抗体具有较好HBsAg结合活性,其亲和常数达到0.23×10~8,同时测定了一株鼠源单克隆抗体的亲和常数,结果表明单链抗体的亲和力为一株鼠源单克隆抗体的十六分之一。竞争ELISA的结果表明,我们的单链抗体可以抑制一株鼠源单克隆抗体与HBsAg的结合,抑制率可达40.3%。并建立了测定单链抗体相对比效价的方法。 应用基质辅助激光解析飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization,MALDI-TOF-MS)精确测定了重组单链抗体的分子量,其结果只与理论值相差8道尔顿。同时还用DABITC/PITC双偶合法证实了重组单链抗体的N末端二个氨基酸序列与理论序列一致。另外,用等电点聚焦测定了单链抗体的等电点在7.3-8.1之间。 以上的研究结果表明,我们已构建成功的抗HBsAg单链抗体有望进行大规模生产,从而取代血源性抗体用于乙型肝炎的被动免疫。
参考文献：
[1]. 人源抗HBsAg抗体Fab段及dsFv基因的克隆和表达[D]. 宋宏彬. 第四军医大学. 1999
[2]. 人源抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性研究[D]. 陈云雨. 吉林大学. 2009
[3]. 人源抗甲型肝炎病毒抗体基因的克隆及表达研究[D]. 于长明. 第四军医大学. 2000
[4]. 鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库的构建研究[D]. 宫爱艳. 西南农业大学. 2005
[5]. 重组人源性抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达、纯化与活性鉴定[D]. 严兴. 华南理工大学. 2002
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