（武汉大学，1医学院人体解剖学与组织学胚胎学系 湖北 武汉 430071）
（武汉江夏区第一人民医院妇产科）
【摘 要】目的：衰老和凋亡是防止肿瘤发生发展的两个关键作用机理，许多细胞周期调控因子如p14ARF, p15INK4b 和 p16INK4a在G1细胞周期阻滞和癌基因诱导衰老中起重要作用。bcl-2 蛋白是抗凋亡成份中关键因子之一，而p53蛋白在凋亡和衰老两者中都起重要作用，这些关键调控因子的基因在各种恶性肿瘤中常常突变或缺如，但还不知道凋亡和衰老如何调控女性生殖管道的肿瘤，例如宫颈鳞状细胞癌。方法：免疫组织化学检测p14ARF,p15INK4b,p16INK4a,bcl-2, p53和Ki-67的表达，每组40个样本（正常宫颈、中度到重度宫颈上皮内瘤变(宫颈上皮内瘤变 II–III)和浸润性宫颈鳞状细胞癌。样本来源于120个宫颈活组织检查和宫颈锥形切除术。结果：结果表明在宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌两者中的增殖标志Ki-67显著性增加，在宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌两者中衰老标志p15INK4b,p16INK4a和p14ARF过表达，在正常宫颈组织中p53免疫组织化学阴性，而在宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌两者中p53显示阳性。尽管bcl-2在宫颈上皮内瘤变表达是增加的，而接近半数的鳞状上皮子宫颈癌病例中bcl-2表达是阴性的。结论：宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌病例组织中一些衰老通路被激活并维持衰老通路激活状态，然而增殖活性也在增加，致癌作用并没有因为衰老通路的持续激活和抗凋亡的丢失而被挫败，从宫颈上皮内瘤变经历慢长的时间发展最终才导致鳞状上皮子宫颈癌。鳞状上皮子宫颈癌组织中p53过表达、bcl-2表达的丢失以及额外的衰老通路在宫颈鳞状上皮子宫颈癌的致癌中可能起关键作用。
【关键词】衰老；凋亡；致癌作用；宫颈鳞状细胞癌
【中图分类号】R331.1+41 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）7-0272-02
鳞状上皮子宫颈癌(squamous cervical carcinoma,SCC)在女性生殖道恶性肿瘤中排第二位，人乳头瘤病毒 (human papilloma virus， HPV) 被认为是宫颈癌致瘤中的最重要的病原作用和病原体，然而不是所有的感染了高风险HPV (HPV subtypes 16 and 18)妇女都发展成宫颈癌，常常要经过几年或十年持续宫颈上皮内瘤变的过程最终发展成浸润性鳞状上皮子宫颈癌。
凋亡和衰老机理可以防止因积累起来的机体细胞突变而导致肿瘤，在首次培养的成纤维细胞中描述衰老的成纤维细胞是具有稳定的细胞周期G1阻滞和具有代谢活性细胞[1–4]。视网膜神经胶质瘤（retinoblastoma ，Rb)和p53通路是看家基因，它们维持高风险HPVs程序性衰老。涉及到pRb和p53通路的细胞周期调节蛋白有细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent dinases,CDKs）及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitprs,CDKIs)，在CDKIs中，p14ARF, p15INK4b和p16INK4a是维持细胞衰老起十分重要作用的成员[1]，p16是细胞周期负调控因子，一旦pRb被磷酸化，细胞就会从G1期进入S期[5,6]，在各种人肿瘤中p16INK4a基因常常无活性[7],p14ARF是由CDKN2（也编码p16INK4a蛋白）编码的一种蛋白，它们是通过抑制MDM2肿瘤蛋白从而负调控G1/S和G2/M细胞周期的，从而阻滞MDM2介导消除p53功能[8]，另一个负调控因子是15INK4b，它是转化生长因子β-诱导细胞周期阻滞的下游[1]。
另一个抗癌细胞机理是凋亡，bcl-2肿瘤蛋白是定位于线粒体内膜，具有抗凋亡作用[9]，由于bcl-2的过表达可能潜在性地延长肿瘤细胞的生存并使其恶性转化[10,11]
p53在凋亡和衰老中均起重要作用，最近 p14ARF, p15INK4b 和p16INK4a 已经被认为是衰老标志，在肺癌癌前病变中显示阳性, 但在肺恶性肿瘤中显示阴性[1]，目前，不同类型的宫颈癌报道：衰老标志以及抗凋亡标志bcl-2的表达存在矛盾的地方[9,12–17]，本研究的目的是采用免疫组化技术检测正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变和浸润性SSC组织检测宫颈癌发展过程中p14ARF, p15INK4b, p16INK4a,ki-67, p53 和 bcl-2 的表达。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
收集武汉大学中南医院和咸宁市中心医院1997年6月～2010年8月的正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌免疫组织化学各40个样本预先石蜡包埋。所有病检标本均经资深病理学专家阅读切片并确诊其组织学类型。所有鉴定专家对患者的个人情况一概不知。
1.2 免疫组织化学
石蜡切片，片厚3 m, 常规脱蜡、水化，每次3 min；胃酶抗原修复；滴加1 滴过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化酶的活性，室温下孵育10 min，滴加1 滴正常山羊血清封闭液,室温10 min(Biocare Medical, Walnut Creek, CA, USA)，倾出血清，勿洗； 滴加1：100的兔抗人或羊抗人p16INK4a (Biocare Medical; 1:100室温30 min), p14ARF (室温1 h ; GeneTex prediluted, San Antonio, TX, USA), p15INK4b (1:300 室温 1 h; Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), Ki-67 (DAKO, 1:500), Bcl-2 (1:250 4°C过夜，Stressgen, San Diego, CA, USA) 和 p53-DO1 (Novocastra, 1:50))；并以生理盐水代替Ⅰ抗体作为阴性对照。链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液(室温下孵育10 min；DAB 液，显微镜下观察3~5 min，阳性显色为棕色；自来水冲洗，苏木精复染，0.1%HCL分化，PBS冲洗返蓝；脱水、透明、封片、镜检。
1.3染色标本分析
2位病理专家在显微镜下为每个标本的染色结果打分，没有上皮细胞的病例或没法评分的病例排除在外。关于细胞染色强度分级以0-3(0：整个视野为染色阴性; 1-3：渐渐增加阳性染色强度)级，具有任何强度（0-3）的阳性染色占宫颈上皮内瘤变或鳞状上皮子宫颈癌(整个鳞癌上皮的百分比被当作正常病例)的百分比 (0%-100%)来半定量蛋白的表达，染色强度评分和阳性染色的百分比的评分取2位病理学家结果的平均值。
1.4 统计学处理
所有数值以±s表示，应用SPSS13.0统计学软件进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 在三种宫颈组织中具有衰老标志p14ARF, p15INK4b, p16INK4a, p53和Ki-67的表达百分比
p14ARF, p15INK4b, p16INK4a, p53和Ki-67的表达定位主要在细胞核，而bcl-2的表达主要定位于宫颈上皮细胞胞质，总体来讲, p16INK4a和p53在正常宫颈上皮细胞显示几乎完全阴性表达，而其他的标志p14ARF, p15INK4b, bcl-2和 Ki-67在基底细胞或基底旁细胞显示一定程度的阳性表达。在正常的宫颈上皮细胞中，p16INK4a的表达是阴性，而在宫颈上皮内瘤变（33／40 ）和 鳞状上皮子宫颈癌（29/40）的组织中，p16INK4a的表达大多数是阳性的，宫颈上皮内瘤变中阳性表达占（33／40 ）和 鳞状上皮子宫颈癌中阳性表达占（29/40），p16INK4a扩散及强度是(2–3+; 图1b)，p15INK4b的表达类似于p16INK4a的表达，但强度稍低(39/40 宫颈上皮内瘤变和37/40 鳞状上皮子宫颈癌)，宫颈上皮内瘤变样本中占39/40 而鳞状上皮子宫颈癌样本中占37/40，强度为1–3级（图1c);在正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌样本中，p14ARF的表达不同，正常宫颈上皮仅弱表达（1+，局限于基底层，15∕40），所有鳞状上皮子宫颈癌显示阳性表达呈扩散型，且强阳性表达（＞95%，2-3+，39∕40），而在宫颈上皮内瘤变中仅17∕40显示阳性表达，其强度和比例变化的范围（1-3+，10-95%;图1d），p14ARF, p15INK4b 和 p16INK4a 免疫组织化学反应结果不同病理概括于表1-表3。
2.3 在三种子宫颈组织中 bcl-2, Ki-67和p53的阳性染色细胞平均百分比
在正常宫颈上皮标本中bcl-2 免疫显色弱并局限于基底层（1+，＜2%，39/40﹚，而在宫颈上皮内瘤变中，其表达的强度和比例与正常宫颈上皮标本相比都在增加（2-3+，15-95%，39/40），在鳞状上皮子宫颈癌中，其表达显示变化的范围，18/40标本显示强阳性并扩散﹙2-3+，30-100%﹚，而21/40的标本显示全部阴性（图2a）。
在正常宫颈黏膜没有观察到p53的染色，而大多数宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌中集中表达 (宫颈上皮内瘤变 占29/40和鳞状上皮子宫颈癌占39/40标本，其强度集中为2-3级，见图2b)。
Ki-67 在正常宫颈上皮中的表达仅在基底细胞旁(39/40);其在宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌中的表达强并扩散更远，Ki-67的阳性表达在宫颈中部和上部上皮中，在宫颈上皮内瘤变病例中占到39/40，在鳞状上皮子宫颈癌病例中占到40/40(图2c)（表2、3）。
3 讨论
衰老和凋亡是抗肿瘤的两个过程，通过肿瘤细胞衰老和凋亡使潜在的肿瘤细胞增殖减少。最近研究证实衰老在上皮肿瘤（包括肝癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌和前列腺癌）中的作用与以前成纤维细胞培养研究得出相反的结果[1,7,18-19]，为此我们对宫颈癌进行了研究，研究结果表明，在宫颈癌中Ki-67指数增加，表明增殖更快，在宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌中，p15INK4b、 p16INK4a和p14ARF在宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌中过表达，表明衰老程序也被激活，表明由p15INK4b, p16INK4a和 p14ARF介导的衰老程序在宫颈癌前病变的宫颈上皮内瘤变阶段被激活，并在大多数宫颈鳞癌中仍维持衰老状态，本实验中p16INK4a和p14ARF在宫颈癌中过表达与以前报道是一致的[20–22]，这个衰老机制是通过E6和E7 HPV肿瘤蛋白直接抑制p53和pRb的表达而激活衰老通路的。
本研究检测了bcl-2凋亡标志的表达，尽管预期在肿瘤的致癌作用和宫颈上皮内瘤变中会有bcl-2的表达，有个结果是没有预期的：在几乎一半的鳞状上皮子宫颈癌s病例丢失bcl-2的表达。进一步比较宫颈上皮内瘤变病例显示具有低水平增殖的病例有一个高水平的bcl-2表达，而具有高水平的增殖（Ki-67)病例具有低水平的bcl-2的表达，这种倾向在鳞状上皮子宫颈癌病例中没出现，以前的一些研究表明bcl-2的丢失是鳞状上皮子宫颈癌预后不利的因素[17]，这类现象也见于T van Slooten等[23]报道的乳腺导管癌，在宫颈上皮内瘤变中，增加bcl-2的表达可能允许癌前细胞的生存，正如bcl-2能阻断p53介导的G1凋亡一样[24）， 在鳞状上皮子宫颈癌中，bcl-2的丢失可能也是E6 HPV 蛋白阻断p53的一个直接反应。
肿瘤抑制基因p53控制细胞周期进入S期，并在细胞增殖中起关键作用，据报道p53在大多数恶性肿瘤中表达丢失或突变;有些研究表明在鳞状上皮子宫颈癌中，p53蛋白表达下调或无活性, 而另一报道中大多数的鳞状上皮子宫颈癌病例呈现表达[25], 因此，在宫颈鳞状上皮子宫颈癌中p53的报道是不一致，在正常组织，p53蛋白很快降解不易检测到，本研究免疫组织化学wt和mup53蛋白显示p53在宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌中过表达，这种结果可能与p53失活与HPV E6蛋白结合有关， HPV E6 蛋白（protein binding）也可能通过MDM2阻滞正常p53降解。
由p15INK4b、 p16INK4a 和 p14ARF介导的完整衰老通路, p53以及不同程度表达的bcl-2结果表明，宫颈癌的发展是许多不同机制发展的结果，如果衰老和凋亡最终没有占据细胞组织主要地位，细胞则增殖发展成为恶性肿瘤，反之则为宫颈上皮内瘤变, 本研究检测到宫颈上皮内瘤变和鳞状上皮子宫颈癌中衰老标志物过表达现象正好解释由宫颈上皮内瘤变发展为鳞状上皮子宫颈癌为什么要经历相当漫长的时间，尽管衰老和凋亡在宫颈癌中致癌的准确作用还要进一步研究来证实，但衰老标志p16INK4a和细胞增殖标志Ki-67以及p53在瘤样发生和癌症发生中的持续表达可作为常规组织学诊断方法，这些病例必定是由磷状上皮反复反应最终发展成为瘤样组织和浸润性肿瘤。
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作者简介：
周春 和王蕾 都是硕士，医学生物
通讯作者：
袁玉林， 博士 肿瘤分子生物学
论文作者:周春1,王蕾1,陈树1,吴丽民1,张裕1,袁玉林1
论文发表刊物:《河南中医》2015年7月供稿
论文发表时间:2015/10/22
标签：宫颈论文; 衰老论文; 细胞论文; 子宫颈癌论文; 阳性论文; 蛋白论文; 病例论文; 《河南中医》2015年7月供稿论文;