叶震海[1]2000年在《周围神经组织工程研究雪旺细胞和PLA材料复合种植的体内外实验研究》文中认为周围神经（Peripheral Nerve，PN）缺损的修复一直是临床的一大难题，临床常用的方法以自体神经移植效果较为肯定，目前尚未有任何移植材料能取代自体神经移植。但自体神经移植由于来源的限制、遗留供区感觉减退等问题，在临床应用中受到制约。寻找一种理想的神经移植替代物一直是实验研究的重点。近年来随着组织工程的发展，对周围神经研究工作的进一步开展，使我们能从组织工程的角度考虑周围神经损伤的修复。 目的：本实验采用新生鼠的雪旺细胞（Schwann Cell，SC）作为PN组织工程的种子细胞，在体外种植于高分子聚合材料聚乳酸（PolylacticAcid，PLA）膜片上，并将SC种植在PLA导管中，桥接大鼠坐骨神经缺损，了解SC在PLA材料上的生长情况、活性SC能否在PLA导管中存活、生长，探讨组织工程化人工神经修复PN缺损的可能性，为将来临床应用提供实验依据。 方法：1．体外培养：10只成年SD大鼠，40只新生SD大鼠。取新生鼠坐骨神经及臂丛神经，制成浓度为10~6个/mm~3的SC悬液，分别种植于PLA膜片、96孔培养板及20ml培养瓶中。培养1、3、5、7、14天后，相差显微镜下观察SC的生长情况及其形态，扫描电镜下观察SCl 在 PLA膜片上的生长、融合情况。培养瓶中细胞培养 3天后，按 108个l／mln’的细胞浓度种植于 PLA导管中，继续培养 24小时后，桥接成年大l 鼠坐骨神经缺损。术后4、8、12周，于中段切取套接的神经移植体，l 作光镜、电镜切片，观察 SC在 PLA导管中生长情况、再生轴突髓鞘化l 形成情况、SC与再生神经的关系。l 结果：1SC能在 PLA膜片上正常生长。2SC能于体内在 PLA导管J 生长、再生轴突髓鞘化。3．体内实验时意外发现在再生的神经纤维中出D 现横纹肌组织。l 结论：1＊C和PLA膜片的相容性良好。2石C种植在PLA导管后，ISC 能在导管中存活、生长，引导神经再生。3＊C可作为一个种于细胞l 在 pN i织工程中应用，｛日是需要作讲一步的研究。
肖裕华[2]2005年在《组织工程人工神经修复周围神经缺损的实验研究》文中进行了进一步梳理【目的】虽然显微外科技术的发展极大地提高了周围神经损伤修复的质量,但修复效果仍不令人满意,尤其是严重创伤、肿瘤切除以及先天性畸形等原因引起的周围神经缺损,其修复与重建一直都是周围神经领域的热点问题。在临床上,周围神经损伤后自体神经移植是首选的神经重建方法,但存在着供区感觉功能障碍、供体来源受限、手术时间延长的缺点。而且即使进行自体神经移植,功能恢复也不满意。经过众多学者的不断探索,迄今为止已发现多种自体神经替代材料,包括生物材料、天然高分子材料、合成材料等制成导管修复神经缺损。这些材料虽已被证明有一定的促周围神经再生的作用,但修复效果仍然不满意,尚不能取代自体神经移植。近年来,随着组织工程的兴起,迫切需要寻找到自体神经的替代品,减少患者失去自体组织和多次手术的痛苦,促进功能恢复。目前,高分子聚合材料PDLLA、PLGA等已被制成神经导管用于修复周围神经缺损的实验研究,但因为缺乏活性细胞、细胞外基质成分、生长因子等,没能够模仿正常神经结构而影响神经再生效果。本研究的目的:(1)研究体外高纯度SD乳鼠雪旺细胞的培养方法;(2)研究雪旺细胞在PLGA纤维微丝及PDLLA导管上生长、迁移以及bFGF缓释微球对雪旺细胞增殖及活力影响;(3)将近交系SD乳鼠雪旺氏细胞与ECM凝胶、
胡学昱[3]2009年在《高仿真组织工程神经修复材料的制备及应用研究》文中研究指明周围神经再生和功能修复是尚未解决的临床难题。对于短节段的神经损伤,可以将断裂的神经直接对端吻合,使近端再生的神经纤维能长入远端。但对于长节段的神经缺损,临床上无法进行无张力缝合,目前治疗的金标准是将未损伤区域的自体神经移植到损伤区域来桥接损伤的神经断端。然而,应用自体神经移植受到很多因素限制:获取供体神经需要二次手术,供区神经来源不足,继发的供区神经功能丧失,以及供受神经在组织结构和尺寸上不匹配等。因此,研发能够有效代替自体神经的移植替代物是目前亟待解决的难题。近年来,组织工程周围神经成为研究的热点。应用组织工程学方法制备组织工程移植物桥接长节段神经缺损收到较好疗效,受到了越来越多的关注。组织工程移植物一般由生物支架材料、种子细胞和生物活性因子三部分构成。其中支架作为种子细胞和神经营养因子的载体,作为组成神经损伤修复微环境的主体,其构建和性能改进研究成为制约周围神经损伤修复的关键。支架材料的组成及内部微结构是影响组织工程移植物修复长节段神经损伤的关键因素。最近研究表明,内部具有定向微结构的支架,在桥接神经缺损时比无定向结构的支架更有利于引导再生轴突的定向生长,能够促进再生神经纤维通过损伤区到达远端,证实了支架内部结构的物理引导作用对于神经再生的重要性。分析原因,主要是因为其内部定向结构模拟了正常神经基底膜的轴向微管结构。但这些支架材料在原料组成以及内部结构上,与自体神经神经基底膜的组成和结构还有很大差距,需要进一步改进。鉴于正常神经基底膜微管结构引导再生神经轴突定向生长的关键作用,如能够根据神经组织的真实组成和结构来选择和制备组织工程支架,将能够在一定程度上使该支架具备类似正常神经组织的特性,有可能会获得最理想的移植替代修复结果。然而,到目前为止,仅有少数具有类似结构的支架被报道,而应用其在体内修复实验动物长节段周围神经缺损至今未见研究报道。本实验中,选用神经基底膜基质材料——胶原为支架的主要原料,应用改良的梯度冷冻干燥技术,制备具有轴向微管结构的三维多孔支架材料。该支架在组成及内部结构方面高度仿真正常神经基底膜。随后,从原料配比、冰醋酸浓度以及冷淋速度等三方面对改良的梯度冷冻干燥技术工艺进行对比研究,筛选出最佳的制备工艺指标。为了使支架能够满足体内移植的需求,应用新型低细胞毒性交联剂——京尼平对支架进行化学交联,改善其机械强度和降解速度,并确定其最佳交联参数。在此基础上,根据国家医疗器械生物学评价的标准和要求,对本支架进行细胞相容性和组织相容性评价,结果证实本支架材料具有良好的生物安全性,可用于体内移植修复。最后,应用免疫组织学、透射电镜、神经电生理、逆行示踪技术以及评测坐骨神经指数等方法,从形态学和功能学两方面综合评价本支架桥接大鼠坐骨神经15mm缺损的修复效果,结果证实其疗效接近自体神经移植。具体内容如下:第一部分支架材料制备及最佳制备工艺参数确定目的:构建组成及结构高度仿真的组织工程神经支架方法:以细胞外基质主要成分——胶原为原料,应用改良的梯度冷冻干燥技术制备仿真支架,扫描电镜观察其结构,评测支架孔径、孔隙率等基本性能,优化其制备参数。结果:本实验制备的支架材料在组成及内部结构方面高度仿真正常神经基底膜,具备以下优点:长轴定向微管样仿生三维结构与正常神经基底膜结构高度相似,利于引导再生轴突定向生长;微管内径较为均一,管径在25μm ~ 55μm之间(平均值为37.41±11.0μm),适于神经轴突生长;平行微管间相互沟通的孔隙相连,沟通孔孔径为20.68±4.61μm,利于营养物质和代谢产物的运输;相对封闭的外壁结构,其壁厚为2.45±1.43μm,此结构在神经再生过程中,将起到瘢痕屏障的作用,能够在不影响营养物质交通的情况下,有效的阻止瘢痕纤维的长入,保护再生纤维的顺利通过。经过对比研究,确定了梯度冷冻干燥的制备最佳参数:胶原-壳聚糖混合比率为4:1,冰醋酸浓度为3mg/ml,梯度冷淋速度控制在2×10-5m/s的条件下,制备的支架材料具有最佳的三维仿生结构和良好的性能,支架平均孔隙率达90%以上。其平均孔径在30μm左右,能够满足理想支架对孔径的要求:小到能够物理性制约并有效引导再生轴突的定向生长;大到能够支持有效的血管化和再生支持细胞的渗入。第二部分支架材料改性及生物相容性评测目的:改善支架的机械性能和降解性,适应体内移植需要,并进行相容性评价为体内移植提供实验依据,奠定基础。方法:选用京尼平进行化学交联改性,考量不同交联条件下支架弹性模量、降解率等指标,优化交联参数;根据国家标准对支架的细胞相容性和组织相容性进行评价。结果:本支架应用低生物毒性交联剂——京尼平(1wt%)交联48小时处理后,无论在干或湿的状态下,其拉伸应力均高于未交联组,其弹性模量在湿的状态下达3.938±1.326 MPa,能够维持三维空间结构,对抗组织塌陷,机械性能基本满足在体移植需求。交联处理后,无论是在阴性对照液PBS中还是溶菌酶溶液中,支架在各时间点上的重量丢失比率均小于未交联组,交联支架8周PBS(无溶菌酶)溶液降解率为17.9±4.2%,溶菌酶溶液中降解率为20.1±4.6%,支架材料在神经再生过程中能够保持稳定的结构,配合神经轴突的再生。经京尼平交联的支架材料对小鼠L929成纤维细胞无直接毒性作用,其浸提液对细胞各时限的毒性评定级别均为0～1级,对细胞形态、生长和增殖不构成损害,肌肉植入法结果证实局部组织无不良反应,有良好的细胞相容性和组织相容性。第三部分支架材料修复大鼠坐骨神经缺损有效性评价目的:评价高仿真支架修复神经缺损的有效性。方法:应用免疫组织学、透射电镜、神经电生理、逆行示踪技术以及评测坐骨神经指数等方法,从形态学和功能学两方面综合评价本支架桥接大鼠坐骨神经15mm缺损的修复效果。结果:形态学观察结果显示:移植术后4周胶原-壳聚糖支架仍能够保持完整的轴向微管结构,平行的微管之间有大量再生神经纤维线性排列,沿轴向管壁定向生长;术后12周,支架材料几乎完全降解吸收,被大量成束的再生神经纤维所替代,证实了再生的神经纤维长过了桥接段。透射电镜结果:新生髓鞘比较纤细,结构完整,有许多无髓神经纤维和大量由雪旺细胞包绕形成的有髓神经纤维共存,并可观察到完整的再生血管结构和良好排列的髓鞘板层结构,再生神经轴突情况良好,修复效果接近自体神经移植。功能学检测结果显示:支架材料组的运动神经传导速度、潜伏期和波幅与自体神经移植结果接近,两组之间差异无显著性意义(p>0.05);逆行示踪标记后,在脊髓前角和背根神经节可检测到与自体神经移植组数量相当的荧光金标记阳性神经元;坐骨神经指数结果也同样证实,胶原-壳聚糖支架桥接的坐骨神经缺损功能性修复效果接近自体神经移植。
张文捷[4]2003年在《GDNF基因修饰的人工神经对大鼠坐骨神经缺损的修复作用及机理》文中进行了进一步梳理周围神经缺损是临床常见的病症, 其可由机械性、热性、化学性、先天性或病理性等因素所引起, 如果未能得到及时修复或修复不佳，将导致运动、感觉功能的丧失和疼痛性神经炎的发生，给病患者带来疼痛和残疾。针对周围神经缺损的治疗，目前的外科手段主要是采取自体神经移植，这一方法长期以来被认为是一种“黄金标准”方法，但由于供体的来源的限制、供区的永久性失神经支配以及供受区神经的匹配等问题使其应用范围受到严重限制。随着材料科学及生物学技术的进展，组织工程化人工神经成为自体神经组织很有希望的替代品。其核心成分主要包括支架材料和支持细胞。尽管相关的研究显示许多令人鼓舞的进展和希望，但目前的人工神经移植体尚不能达到与自体神经移植相似的效果。为此本课题引入基因转染技术，对种植的雪旺氏细胞进行胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因修饰以增加其合成及分泌神经营养因子的水平,然后应用所获取的GDNF基因修饰的雪旺氏细胞结合生物可降解材料(聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物)及细胞外基质凝胶构建基因修饰的人工神经复合体,用于修复大鼠坐骨神经缺损。以探讨一种自体神经移植的替代方法及策略。本课题的研究主要包括以下三个部分，所取得的主要结果及结论如下：第一部分 组织工程人工神经诱导管的制作及其性能研究1) 本研究首先应用组织工程技术,以构成比不同的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物[poly(DL-lactide-co-glycolide) PLGA] [(85:15)或(50:50)]为原料成功制备了人工神经诱导管。以0.2MPBS（PH7.4）为人工降解液，观测PLGA(85:15)和PLGA(50:50)管12周体外降解期间吸水率、失重率及生物降解率变化，通过扫描电镜观察其微结构变化；并采用肌肉包埋方法，观测PLGA(85:15)和PLGA(50:50)管8周体内降解期间生物降解率变化。结果显示：① 体内外降解条件下,PLGA(50:50)管吸水率、失重率及生物降解率显著高于PLGA(85:15)管；② 两种材料样品体内生物降解率显著高于体外降解率；③ 扫描电镜观察显示，随降解时间延长，材料样品表现为特征性的虫蚀样破坏并<WP=9>进行性加重，以PLGA（50:50）管尤为明显。这些结果提示：共聚物的构成比以及降解环境是影响聚乳酸－聚羟基乙酸共聚物生物降解性能的重要因素。2) 在此基础上，我们进一步采用肌肉包埋、雪旺氏细胞直接接种以及坐骨神经缺损桥接预实验的方法观察两种构成比不同的PLGA管[（85:15）或（50:50）]的生物相容性及其神经再生诱导作用。结果显示：① 肌肉包埋条件下,PLGA早期诱发以淋巴细胞及成纤维细胞为主的轻度的非特异性炎性反应,持续到10－12周时基本消退；② 采用细胞直接接种的方法,观察到雪旺氏细胞在PLGA膜上能良好的生长并发生增殖；③ 体内神经桥接情况下，硅胶管促发有明显的纤维组织增生，并形成包囊包裹于管周,而两种PLGA管组未见类似现象；④ 与经典的硅胶管组相似,PLGA(85:15)管能够顺利完成坐骨神经缺损桥接作用，再生神经电生理及组织学评价显示两组无明显差异。而PLGA(50:50)管体内神经桥接4周时即出现破裂，不能为坐骨神经缺损提供良好的桥接支持作用。以上这些结果提示，与硅胶管及PLGA(50:50)相比，PLGA(85:15)是一种异物反应小、生物相容性佳，生物降解速率合适的周围神经组织工程材料。第二部分 pLXSN-GDNF的鉴定、包装及转染1）对获赠的携带胶质细胞源性神经营养因子的逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GDNF)进行测序鉴定。结果证实pLXSN-GDNF结构正确，GDNF序列完整；2）采用脂质体包裹的方法，用pLXSN-GDNF重组逆转录病毒载体质粒转染包装细胞PA317，获得G418抗性细胞，RT-PCR证实其培养上清含有重组逆转录病毒，用NIH3T3细胞测定病毒滴度为104－105CFU/ml；3) 用含重组逆转录病毒的上清感染雪旺氏细胞，获得G418抗性细胞SCsGDNF，PCR鉴定提示GDNF目的片段整合到细胞基因组；RT-PCR的结果证实因病毒感染而整合于细胞基因组的外源性基因具转录功能，且GDNFmRNA的表达水平比未感染的雪旺氏细胞（SCs）显著提高（P<0.01）。Western Blot证实SCsGDNFGDNF蛋白含量显著高于SCs (P<0.01)。这些结果提示重组逆转录病毒（pLXSN-GDNF）的基因转染显著上调了雪旺氏细胞GDNF蛋白及GDNFmRNA表达水平。<WP=10>第三部分 GDNF基因修饰的人工神经复合体的体外构建及体内桥接坐骨神经缺损的动物实验1） 应用体外获取的GDNF基因修饰的雪旺氏细胞结合细胞外基质凝胶及PLGA管成功构建了GDNF基因修饰的人工神经复合体；2）采取Hoechst33342对种植细胞（SCs或SCsGDNF）进行预标记的方法，在人工神经复合体大鼠神经桥接实验中示踪细胞的分布及存活情况。结果显示异体移植的雪旺氏细胞（SCs或SCsGDNF）在受体组织内存活时间可达4周左右。3）通过GDNF基因修饰的人工神经复合体桥接大鼠坐骨神经缺损的实验，结果发现：① 坐骨神经损伤后，GDNF蛋白及GDNFmRNA的表达水平，不仅在损伤神经干显著提高，而且在脊髓前角运动神经元及其周围胶质细胞也显著上调。这一结果提示运动神经元不仅通过靶源性神经营养因子的逆行性运输，而且可能
孙彬彬[5]2017年在《新型神经导管的制备及其在周围神经再生中的应用》文中研究指明周围神经组织由于其结构、功能复杂,一旦发生损伤则致残率高、预后差、治疗复杂,成为当前临床的一大重要难题。传统的自体神经与异体神经移植仍然是临床治疗周围神经缺损的常用方案,然而其本身的局限性极大的限制了它们的广泛应用。神经组织工程的兴起为周围神经修复提供了新的方向。当前神经组织工程领域的研究主要集中在支架材料、支架结构、神经细胞、神经因子、电刺激信号等几个方面。本研究从组织工程的支架、细胞和因子三大要素着手,提出制备三种新型神经导管支架。首先,聚吡咯(Ppy)因为具备良好的生物相容性和导电性能,利用其制备聚吡咯涂层神经导管支架,在支架材料上实现创新,同时结合电刺激信号进行体外研究;然后,仿生神经内膜结构,以纳米纤维海绵作为填充物制备纳米纤维海绵填充式神经导管支架,在支架结构上实现创新;最后,因为聚多巴胺纳米球(PDA NPs)具有良好的生物相容性,且具备负载神经生长因子(NGF)的能力,利用其介导NGF制备可缓释NGF的复合水凝胶填充式神经导管支架,同时在神经因子和支架结构上实现创新。具体来看,本文的研究内容与结果可以概括为以下几个部分:(1)以吡咯为单体,利用原位氧化聚合和静电纺丝技术相结合将聚吡咯涂层在聚乳酸己内酯共聚物/丝素蛋白(PLCL/SF,75/25,w/w)纳米纤维表面,制备得到聚吡咯涂层的PLCL/SF纳米纤维膜。使用三种不同浓度的吡咯单体进行原位聚合反应,制备得到三种不同的Ppy涂层PLCL/SF纳米纤维膜(PLCL/SF-Ppy-1,PLCL/SF-Ppy-2和PLCL/SF-Ppy-3)。扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)和傅里叶红外光谱(FTIR)结果证实了Ppy被成功涂覆在PLCL/SF纳米纤维表面。对三种纳米纤维支架的热稳定性能、降解稳定性、导电性能、力学性能、亲水性能进行表征,结果一方面表明了Ppy涂层后的纳米纤维膜具有较好的热稳定性、降解稳定性和导电性能,另一方面也证明Ppy涂层改善了PLCL/SF纳米纤维膜的亲水性,而且这种改善作用随着吡咯含量的增加而增加。结合电刺激,分别用三种纳米纤维膜培养雪旺(SC)细胞和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞,发现导电Ppy涂层可以明显促进SC细胞的增殖和PC12细胞的分化,而且这种促进作用随着导电性提高而更加显著。因此,上述结果表明PLCL/SF-Ppy-3纳米纤维膜具有更好的神经组织工程应用潜力。进一步利用PLCL/SF-Ppy-3神经导管支架进行体内修复大鼠10mm坐骨神经缺损,结合组织学染色、免疫组化、免疫荧光以及透射电子显微镜(TEM)结果表明聚吡咯涂层可以显著促进大鼠神经营养细胞的增殖、神经轴突和髓鞘的再生,术后坐骨神经功能指数(SFI)分析结果表明其具有促进神经功能的恢复,且修复结果与自体移植组类似。因此,聚吡咯涂层神经导管支架具有在神经组织工程应用的潜在价值。(2)首先,利用静电纺丝技术制备PLCL/SF(20/80,w/w)纳米纤维,然后利用高速匀浆技术将纳米纤维在叔丁醇溶液中分散成纳米短纤维,最后利用冷冻干燥制备得到纳米纤维海绵。SEM结果表明该纳米纤维海绵是由纳米纤维组成。孔径与孔隙率分布测试结果显示其孔隙率为88.81±1.13%,孔径分布为0-100μm。循环压缩力学测试结果表明该纳米纤维海绵具有良好的抗压缩弹性。利用该纳米纤维海绵作为填充物填充进入PLCL/SF(75/25,w/w)中空纳米纤维神经导管中得到纳米纤维海绵填充式神经导管支架,体外培养结果显示SC细胞培养7天后在纳米纤维海绵填充式神经导管有1.5-2.0 mm的纵向长入,表明该支架具有大孔隙结构能够促进SC细胞生长和粘附。进一步进行体内的移植实验,SFI值、Masson染色以及肱三头肌湿重比统计结果均显著表明三组神经功能的恢复情况从好到差依次为:自体移植组>纳米纤维海绵填充式神经导管组>中空神经导管组。同样,组织学染色、免疫荧光、免疫组化和TEM结果也得出相同的结果,并发现纳米纤维海绵填充式神经导管可以促进和引导SC细胞迁移增殖,并迅速引导髓鞘的再生和轴突的延伸,进而更好的促进神经组织的修复和再生。因此,该支架能够很好的促进神经再生和神经功能恢复,在神经组织工程中表现出潜在的应用价值。(3)以多巴胺为单体,氧化聚合制备得到聚多巴胺纳米球(PDA NPs)。采用响应面法实验对制备聚多巴胺纳米球的反应条件进行优化,最终得到最佳反应条件为:多巴胺浓度为10 mg/mL,pH值为9,反应时间为9 h。经过SEM和激光粒度仪表征PDA NPs的粒径大小为324.2±13.9 nm,且粒径分布较为均匀(PDI值为0.231)。综合FTIR和拉曼光谱(RS)的结果表明PDA NPs被成功合成。以PDA NPs作为载体,利用碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)共价接枝的方法将神经生长因子NGF接枝在PDA NPs表面,得到可以缓释NGF的聚多巴胺纳米球(NGF@PDA NPs)体系。SEM和激光粒度仪检测结果表明NGF的接枝并不会影响到聚多巴胺纳米球的粒径大小与粒径分布。FTIR和RS结果证实了NGF被成功接枝在PDA NPs表面。此外,体外缓释与MTT结果表明NGF@PDA NPs表面的NGF可以缓慢释放出来,并保持其生物活性达到促进SC细胞增殖的目的。结合三维(3D)打印技术,将NGF@PDA NPs与明胶/透明质酸水凝胶混合后3D打印得到复合水凝胶纤维。并进一步将其取向排列填充到PLCL/SF(75:25,w/w)中空神经导管中。体外降解实验表明,可以缓释NGF的复合水凝胶纤维具有良好的生物降解性能。体外MTT实验表明,该复合水凝胶纤维神经导管不仅具有良好的生物相容性,而且随着NGF的缓释表现出促进SC细胞增殖的能力。因此,制备的聚多巴胺纳米球介导的可缓释NGF复合水凝胶填充式神经导管具有很大潜力作为周围神经缺损的修复材料。综上,本论文结合当前的研究热点,提出制备三种新型神经导管支架,并分别在体内、外水平探究这些支架在周围神经缺损中的应用。本文的研究工作为神经组织工程在周围神经缺损上的应用提供了理论研究基础。
钟荣国[6]2010年在《PLGA三维神经导管内微丝直径影响周围神经缺损修复的实验研究》文中研究说明目的：研究采用PLGA构建的新型三维神经导管修复大鼠周围神经缺损。观察神经导管内不同直径的微丝支架对神经再生的影响,为研制理想的人工神经提供理论和实验依据。方法：新型三维神经导管材料采用聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(PLGA,85:15)。先将这种可吸收材料制备成管壁有微孔,内含有不同直径微丝支架的三维管状结构；再随机将60只成年SD大鼠分为六组,每组10只,在左侧制造12mm坐骨神经缺损,用PLGA导管桥接大鼠坐骨神经缺损。A组：PLGA神经导管内纵形放入直径为60um的20根PLGA微丝；B组：PLGA神经导管内纵形放入直径为80um的20根PLGA微丝;C组：PLGA神经导管内纵形放入直径为100um的20根PLGA微丝;D组：PLGA神经导管内纵形放入直径为120um的20根PLGA微丝；E组：PLGA神经导管内纵形放入直径为140um的20根PLGA微丝；以上各组神经导管内均注入层粘蛋白与神经生长因子混合液0.3ml；F组：自体神经移植组。所有大鼠左后肢为实验侧,右后肢为对照侧。术后动态观察大鼠肌肉萎缩及跛行等情况,术后12周测量含有不同直径微丝支架的神经导管内再生神经的运动神经传导速度、小腿三头肌湿重恢复率。对再生神经中1/3段行组织学观察及图像分析以评价神经修复的效果。结果：术后12周,各组大鼠术侧足底溃疡愈合并已有刺痛反应,但A组和E组大鼠反应较为迟钝；B组、C组、D组和F组大鼠肌肉萎缩有所恢复,跛行减轻,而A组和E组则未见明显恢复；各组再生神经均已通过神经导管长入远端,B、C、D、F组再生神经较A、E组粗大,PLGA神经导管与微丝均基本降解；再生神经的运动神经传导速度B组、C组、D组和F组明显快于A组和E组(P<0.01);A组、E组肌肉萎缩最明显,而B组、C组、D组和F组肌肉萎缩较轻且肌肉萎缩程度基本相当,其差异无统计学意义(P>0.05)；再生神经中1/3段光镜和电镜观察,A组、E组与B组、C组、D组、F组比较神经纤维较稀疏、轴突较细小、髓鞘较薄、发育不成熟,且E组水肿明显,结构松散,髓鞘内微丝和微管较模糊；而B组、C组、D组和F组轴突较粗大,髓鞘厚,髓鞘内微丝和微管清晰且排列整齐。病理图像分析神经纤维计数以F组最多,C组次之,神经纤维直径、轴突直径和髓鞘厚度B组、C组、D组和F组比较差异无统计学意义(P>0.05),而与A组、E组比较差异均有统计学意义(P<0.01),B组、C组、D组和F组的再生神经纤维数量及成熟程度均要明显优于A组和E组。结论：1.研制的PLGA三维导管能有效引导SD大鼠坐骨神经再生并长过12mm的神经缺损,是一种较理想的修复材料。2、三维神经导管内微丝直径影响周围神经再生,直径为80-120um微丝为最利于神经生长。
宋玉林[7]2007年在《新型三维多肽神经组织工程支架材料制备及体外诱导神经干细胞的实验研究》文中研究指明第一部分神经干细胞的分离培养及鉴定目的:探讨新生S-D鼠大脑皮层组织神经干细胞分离、培养以及鉴定的方法。方法:分离新生S-D鼠(出生1-3d内)的大脑皮层组织,机械吹打后,无血清培养基悬浮培养细胞,获得具有自我增殖能力的细胞克隆,并将细胞克隆贴壁培养测其分化能力。应用抗Nestin、NSE、GFAP免疫组织化学方法鉴定细胞克隆。结果:从新生S-D鼠大脑皮层组织分离的细胞悬液,经悬浮培养,生成大量具有增殖能力的细胞,可形成神经球,抗Nestin。细胞克隆贴壁培养后神经球分化为神经细胞及胶质细胞,抗NSE阳性,抗GFAP阳性。结论:上述方法分离的细胞具有自我更新、自我复制及分化为神经细胞及胶质细胞的能力,属于中枢神经系统干细胞。第二部分新型两亲性肽的设计合成及自组装成凝胶目的:设计合成含IKVAV的两亲性肽,在不同的条件下,探讨其自组装为三维多孔凝胶结构及其力学特性。方法:用固相法合成肽,MS测其分子量, HPLC测其纯度;肽溶于0.1M NaOH溶液中,配10,2,1,0.5wt%肽溶液,各取200ul相应肽溶液,分别加入等体积的DMEM/F12培养液,或置于10M浓盐酸蒸汽中,或涂布于盖玻片上,置于37℃干燥箱。TEM及SEM检测自组装形成的凝胶,用血流计测定凝胶的流变学特性。结果:MS示肽的分子量为1438.31,HPLC示其纯度为96%。肽溶液在DMEM/F12触发下,数秒钟内形成凝胶;于10M HCL蒸气中, 2小时后完全形成薄层凝胶; 37℃的干燥箱中,未见凝胶形成;SEM示10wt%肽形成的凝胶由纳米纤维构成,呈板层状排列,为多孔厚壁的结构。透射电镜显示:2,1,0.5wt%肽自组装凝胶由编织状纳米纤维构成。1wt%肽的凝胶纤维直径有3～5纳米,长度100纳米～1500纳米;2wt%肽的凝胶纳米纤维排列紧密; 0.5wt%肽的凝胶的纳米纤维较细,纤维间空隙较大;时间频率流变学表明:损耗模量呈线性并且比存储模量要小,表明自组装凝胶有一定强度,有足够的强度可支撑细胞接种。结论:本实验合成两亲性肽,在DMEM/F12溶液中可自组装成多孔凝胶,成功构建了“聪明的”含活性配体神经组织工程支架材料。第三部分肽自组装二维凝胶对神经干细胞生长分化的实验研究目的:体外培养出神经干细胞,接种于多肽自组装二维多孔凝胶表面,观察二维凝胶表面其对细胞生长及分化影响。方法:取乳小鼠大脑皮质,机械分离,无血清培养基悬浮法培养出神经细胞,免疫组织化学SABC鉴定。肽溶于NaOH溶液中,PH=9.0,浓度为1wt%,加DMEM/F12在盖玻片上触发多肽自组装为凝胶,透射电镜检测。实验组:神经细胞接种于二维凝胶表面;对照组:神经细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片表面;倒置相差显微镜观察细胞生长及分化情况,免疫细胞化学染色,激光共聚焦显微镜观察。结果:免疫组化鉴定:培养的细胞为NSCs,Nestin(+)。透射电镜示:自组装凝胶为交织成网状的纳米纤维。实验组:7天后,倒置相差显微镜观察到神经细胞长出突起,对照组仅有未分化神经干细胞球。激光共聚焦显微镜观察:在实验组,NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,NF(+),示强红色荧光,GFAP(+),示弱绿色荧光;对照组:仅有神经干细胞球,Nestin(+),示绿色荧光。结论:本实验首次采用不需胰蛋白酶或EDTA,培养出神经干细胞。透射电镜证实凝胶为多孔的纳米纤维。免疫细胞化学鉴定:二维多孔凝胶对NSCs有良好的细胞相容性,其表面可诱导NSCs分化为神经元及胶质细胞。证明二维自组装凝胶可作为优良的神经组织工程支架材料。第四部分肽自组装凝胶体外三维诱导NSCs的研究目的:合成两亲性肽,在含神经干细胞(NSCs)的DMEM/F12触发下自组装成三维多孔的凝胶,研究其对细胞生长及分化的影响。方法:固相法合成肽。取乳鼠大脑皮质,机械分离,无血清培养,免疫组织化学鉴定。实验组(EG):分A1及A2亚组,1wt%肽加入含细胞的等体积的DMEM/F12液中;对照组(CG):分B1及B2亚组,细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片表面,免疫细胞化学染色,LCM及IPCM观察,TEM检测细胞在凝胶中的超微结构。结果:MS示肽的分子量为1438.31,HPLC示其纯度为96%。TEM显示,凝胶为交织排列的纳米纤维。免疫组化鉴定:培养的细胞为NSCs,Nestin(+)。IPCM观察:EG中,NSCs在凝胶内部,2天形成细胞球,7天形成神经元样形态;CG中,B1亚组仅形成细胞球,B2亚组细胞可形成神经元形态。LCM观察,EG中,NSCs分化为神经元与星形胶质细胞,NF(+),GFAP(+);CG:B1亚组可见NSCs球,Nestin(+),B2亚组为神经元与星形胶质细胞,NF(+),GFAP(+);TEM示在凝胶包裹的细胞的胞浆内有丰富的突起。结论:构建两亲性肽,自组装为凝胶,其内部可诱导NSCs发生分化,证明肽基凝胶可作为新型神经组织工程支架材料。
袁健东[8]2009年在《新型三维支架搭载LV-NT3修饰的雪旺氏细胞修复脊髓损伤的实验研究》文中研究说明一、背景脊髓损伤(spinal cord injury, SCI )是骨科临床工作中最常见的创伤之一。随着现代建筑业、交通运输业的发展,SCI的发生率也逐年呈上升趋势。据报道,SCI在我国的年发生率约为60/100万。脊髓损伤常导致损伤节段平面以下感觉、运动功能不同程度的丧失,给病人带来终生痛苦,给社会带来巨大的损失和沉重的负担,已成为世纪医学挑战之一。目前临床上对脊髓损伤的治疗主要有防治脊髓损伤后继发性损害、保护残存神经元功能,但是疗效都不理想。这是由于损伤局部星形胶质细胞增生形成胶质疤痕,再生的神经纤维无法穿越损伤区域,神经再生困难,并且受损神经元轴突由于缺少神经营养因子的趋化作用,失去正常的迁移能力从而阻碍轴突再生。目前国内外脊髓损伤修复的研究主要策略为促进轴突再生、克服再生屏障。1981年Aguayo等通过大量实验证实脊髓的神经轴突在合适的微环境中可以再生,是脊髓损伤修复研究的重要里程碑。随着组织工程学的兴起,脊髓损伤修复又取得了新的进展。组织工程技术治疗SCI的基本模式为“种子细胞+生物分子+生物支架”。实验中发现经过基因修饰的雪旺氏细胞(Schwann cells,SCs),能分泌大量神经生长因子,诱导脊髓神经元的再生,将生物可降解支架制成圆柱状种植雪旺氏细胞一起移植修复脊髓损伤也取得了一定疗效。二、目的1、建立体外原代培养雪旺氏细胞的方法,实现短时间内获得大量高纯度雪旺氏细胞这一要求。2、制作具有三维结构的新型生物可吸收支架。3、构建携带人神经营养素3(homo sapiens neurotrophin 3,hNT3)基因的慢病毒载体,将hNT3基因导入体外培养的SCs中,使其高效稳定地表达hNT3。4、通过将转染hNT3基因的SCs种植到三维支架上,一起移植至脊髓半横断损伤处,观察脊髓轴突再生及脊髓传导功能恢复情况,探讨新型三维支架搭载SCs移植对半横断脊髓损伤的修复作用。三、研究方法1、应用植块法与消化法相结合的方法进行原代雪旺氏细胞的培养。以新生SD大鼠的双侧坐骨神经为材料,剥去神经外膜,剪成1mm3大小的碎块,用0.25%的胰蛋白酶和0.03%胶原酶消化,然后种植培养,培养基为含10%胎牛血清的DMEM,24小时后用阿糖胞苷去除成纤维细胞,共24小时,以后每2-3天更换培养液。2、以PLGA为原料,通过熔融纺丝、拉升、编织等步骤制作新型三维可吸收支架,并进行支架的体外、体内生物相容性初步测试。3、由Genebank中查得hNT3片段的基因序列,合成引物后体外扩增,构建重组质粒,接着进行慢病毒载体的包装。慢病毒包装系统由pGC-E1-EGFP载体、pHelper 1.0载体,pHelper 2.0载体三质粒组成,以293T细胞为包装细胞,在病毒携带的增强型绿色荧光蛋白的帮助下,检测重组慢病毒的产生。4、LV-hNT3转染雪旺氏细胞,检测慢病毒的转染效率。然后进行体内实验。以雌性SD成鼠为动物模型,将支架和转染有hNT3的SCs植入大鼠半横断脊髓损伤处,实验动物随机分为A组:hNT3-SCs+三维支架,B组:SCs+三维支架,C组:三维支架。于术后2、4、8、12周,应用BBB评分评价大鼠脊髓功能的恢复情况,使用HE、免疫组织化学染色、透射电镜观察等方法观察雪旺氏细胞的存活、hNT3的表达、损伤处轴突的再生情况。四、结果1、经S-100荧光染色鉴定雪旺氏细胞,结合Hoechst核染色后可计算出原代培养的细胞纯度达95.2%,与文献结果一致。2、通过编织工艺成功研制了新型三维支架,支架外径3mm,微管道内径100μm,PLGA细丝直径25μm,横切面显示中空微管内径均匀一致,呈螺旋上升排列。支架孔隙率为68%,支架具有具有良好的生物相容性,降解时间为3个月。3、应用本方法成功地获得了高滴度的携带hNT3基因的重组慢病毒,病毒滴度达5×107 TU/ml。4、LV-hNT3对雪旺是细胞进行转染,结果显示当MOI值为10时转染效率最高,可达85%。经RT-PCR证实转染的SCs中hNT3 mRNA的表达明显高于对照组。5、移植治疗脊髓损伤后,术后4、8、12周,A组的BBB评分较其他组明显提高(P<0.05) ,其中,A组好于B组,B组好于C组,HE染色观察8周时脊髓材料交界处可见巨噬细胞和炎性细胞聚集,支架的表面有小炎性细胞浸润,但较四周时少。12周时脊髓支架交界处巨噬细胞很少见,可见小的炎性细胞聚集,支架已经完全吸收。移植术后3月的脊髓冰冻切面,可见脊髓移植物处有较多的雪旺氏细胞存活,术后4周的脊髓切片在荧光显微镜下观察到在脊髓损伤处有EGFP荧光表达, 8周时,EGFP荧光表达数量较前减少,支架已开始吸收。12周时,仍有EGFP荧光表达,证明LV-hNT3转染后在雪旺氏细胞内持续稳定的表达。12周时顺标和逆标证实有新生的轴突穿越脊髓损伤区域。12周时经Western Blotting检测到hNT3得到了良好的表达。透射电镜观察:术后8周,有新的突触形成,至术后12周,脊髓损伤处可见较多成簇的髓鞘,新生的无髓及有髓神经纤维明显增多。五、结论1.采用消化法与植块法联合应用的方法,进行SD新生鼠雪旺氏细胞的培养。能够在短期内快速获得大量高纯度的雪旺氏细胞,可作为种子细胞进行SCI修复。2.利用编织工艺制作的新型三维支架,具有良好的生物相容性和恰当的生物降解时间,适合修复SCI。3.根据Genebank中hNT3序列体外扩增了hNT3 cDNA,利用慢病毒三质粒系统包装生产了慢病毒LV-hNT3,病毒滴度达5×107TU/ml。4.LV-hNT3在体外对SCs的转染效率可达85%以上,植入体内的SCs保持良好的生物活性并可存活3个月以上,hNT3基因得到持续表达,三维支架3个月后吸收,脊髓损伤处发现新生的轴突和突触,脊髓的神经功能得到部分恢复。
宋纯[9]2009年在《聚羟基乙酸支架的表面改性及在胰岛培养和移植中的应用》文中提出聚羟基乙酸（Polyglycolic acid, PGA）作为医用的生物可吸收高分子材料是目前生物降解高分子材料中最活跃的研究领域，已经获得美国食品与药品管理局（FDA）的许可。本研究为了提高PGA细胞支架的粘附性，对PGA支架材料进行了表面改性的研究，为胰岛细胞在PGA支架表面能粘附生长提供了良好的粘附条件，从而使PGA支架能更好的应用于胰岛细胞的体外培养与移植的研究中。通过XPS分析、拉伸性能测试和浸润性测试研究了不同功率、不同时间的等离子体处理对于PGA支架性能的影响。结果表明：处理功率240W，处理时间4min时，PGA支架的拉伸性能以及与生理盐水和血清培养液之间的浸润性较好。采用拉伸性能测试和浸润性测试分别研究了不同浓度的蔗糖、L-谷氨酸和多聚赖氨酸涂层处理对于PGA支架性能的影响，结果表明：涂覆有2mg/ml的多聚赖氨酸涂层的PGA支架的拉伸性能以及与生理盐水和血清之间的浸润性相对于其它涂层要好。最后采用处理功率240W的等离子体处理结合浓度为2mg/ml的多聚赖氨酸涂层处理PGA支架，通过对其拉伸性能以及浸润性能分析，结果表明：等离子体结合多聚赖氨酸涂层处理的PGA支架的拉伸性能和浸润性能比采用单一方法处理的PGA支架的各方面性能都要好。因此，最终采用等离子体结合多聚赖氨酸涂层对PGA支架进行处理，改进其与细胞培养液之间的浸润性，从而提高PGA细胞支架与细胞之间的粘附性。将大鼠胰岛细胞种植在经表面改性的PGA支架上进行体外培养（静止培养和微重力培养），实验结果显示，与无支架静止培养组胰岛相比，倒置显微镜下可见PGA支架上的胰岛细胞形态完整，生长状态良好，胰岛能与支架紧密粘附，胰岛细胞死亡少。双硫腙（DTZ）染色后PGA支架上的胰岛细胞纯度较好。吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）荧光双染色法和放射免疫法检测结果显示，PGA支架上的胰岛细胞的生存率及胰岛素含量较高。噻唑蓝比色法（MTT）结果显示，PGA支架材料与胰岛细胞的生物相容性较好。扫描电镜下可见胰岛细胞在PGA支架上能粘附生长，胰岛之间的间隙较大，胰岛可充分地获取营养，PGA支架上胰岛细胞形态良好。激光共聚焦显微镜下可清楚的看到PGA支架上绿色的胰岛β细胞和红色的胰岛α细胞。PGA-胰岛复合物经过体外共培养5天后，移植到糖尿病大鼠的腿部肌肉内，对PGA-胰岛移植物移植治疗的效果进行比较观察。从血糖和血清胰岛素含量检测结果显示，支架微重力培养移植组的PGA-胰岛细胞移植物，移植后可使糖尿病大鼠体内的血糖值和血清胰岛素含量恢复到正常。扫描电镜、共聚焦显微镜及病理检测结果显示，PGA支架上胰岛细胞的形态良好，支架材料与胰岛细胞的生物相容性较好，胰岛细胞间可见到细胞外基质的形成，呈网状细纤维，PGA-胰岛细胞周围空间较大，胰岛细胞未受到肌肉组织的挤压，在PGA支架之间有新生的毛细血管，胰岛细胞周围可见到红细胞，说明肌肉内的血液供应较丰富，支架上的胰岛细胞能得到充分的营养供应。移植后30天左右，PGA支架开始逐渐断裂，PGA的降解及降解产物对机体没有造成损害。将PGA支架与猪胰岛细胞共培养，观察猪胰岛细胞体外生存的质量、生物学特征及猪胰岛细胞与PGA支架材料的生物相容性。与静止培养组胰岛相比，AO-PI荧光双染法结果显示，PGA支架可改善猪胰岛细胞的活性，可使猪胰岛生存率增高。放射免疫方法胰岛功能检测结果显示，PGA支架上猪胰岛细胞的胰岛素释放指数较高。MTT检测结果显示，PGA支架与猪胰岛细胞具有较好的生物相容性。倒置显微镜及免疫荧光显微镜观察结果显示，PGA支架上猪胰岛细胞形态良好，猪胰岛细胞在PGA支架上能粘附生长。实验结果表明，PGA细胞支架可作为胰岛细胞外基质，为胰岛细胞体外生存提供良好的生长环境。尤其是PGA支架微重力培养条件更适合于胰岛细胞的体外生存与体内移植。
郭庆山[10]2006年在《组织工程化脊髓修复成年鼠脊髓损伤的初步研究》文中研究表明背景:成年哺乳动物脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)后的修复十分困难,我们曾应用多种神经组织移植修复成鼠脊髓损伤,效果均不理想。神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)因其分布的广泛性及多分化潜能,被视为中枢神经系统替代治疗的理想材料。但单纯NSCs移植后很快弥散流失或形成细胞团,出现营养缺乏和代谢障碍,不能形成功能性的修复。利用组织工程技术构建神经干细胞/支架复合物可以克服这些缺点,为细胞附着提供锚靠点,以利于其生长、分化和代谢。但急性SCI的微环境会抑制NSCs向神经元分化,甚至对其存活都会有负面影响,NSCs主要分化成星形胶质细胞而非神经元,神经干细胞/支架复合物作为修复材料的潜能受到巨大挑战。如何改善局部环境,如何诱导神经干细胞更多地向神经元表型分化,是脊髓组织工程研究中亟待解决的问题。处在发育期的胚胎脊髓(Fetal spinal cord, FSC)允许自身神经干细胞大量增殖及向神经元表型分化。同时,FSC中存在高浓度的NT-3和BDNF等神经营养因子,具有诱导神经干细胞向神经元方向分化的能力,并可提供其他有益的蛋白质成分、神经化学因子或细胞外基质,起到调控和协同作用,使脊髓固有的各种细胞成份最终达到合适的比例。鉴于上述,本实验将NSCs接种在PGA支架上,再提供胚胎脊髓提取液(Fetal spinal cord extracts, FE)模拟NSCs发育的胚胎性微环境,提供生长分化所需的神经化学因子或细胞外基质,促进向神经元表型分化,体外构建了一种包含神经元和胶质细胞等成份、具有一定组织形态和功能的复合神经组织,我们暂将其命名为组织工程化脊髓(Tissue-engineered spinal cord, TSC)。如此,修复急性SCI时通过移植这种在体外己完成分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的组织,就有可能避免体内的复杂环境对干细胞分化的不确定性影响,提高修复成年鼠脊髓损伤的效果。目的:利用组织工程技术,研究和开发能修复成年鼠损伤脊髓的组织工程材料,为脊髓损伤的治疗提供新思路、新方法。方法:1.胚胎脊髓神经干细胞的分离培养与鉴定。分离和克隆扩增孕14天SD大
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