②中国人民解放军163医院急诊科，湖南 长沙 410013
摘要：目的：研究双黄连粉针剂对乌头碱作用靶点——心肌细胞膜上的钠离子通道电流改变的影响。采用全细胞膜片钳技术，观察乌头碱对培养大鼠心室肌细胞膜钠离子通道的影响，以及双黄连粉针剂对该影响的干预作用。方法 本实验将原代培养的大鼠心室肌细胞，分正常对照组，乌头碱组，双黄连干预组。应用全细胞膜片钳技术纪录正常大鼠心室肌细胞钠离子电流，1umol/L乌头碱对大鼠心室肌细胞钠离子通道的影响，轻柔的洗脱乌头碱后，给与100mg/L双黄连粉针剂干预，5分钟后观察和记录钠离子通道电流的变化情况。结论：1.乌头碱对心肌细胞INa有明显的增强作用； 2.双黄连粉针剂可拮抗乌头碱所致心肌细胞INa的增强。
关键词 双黄连，乌头碱，心肌细胞，原代培养，钠通道电流
Effects of shuanghuanglian on the changes of Na + channel current by aconitine of cultured rat ventricular myocytes
ABSTRACT：【Objective】 To observe the change sodium ion channels by aconitine of cultured myocardial cells and the intervention by SHL injection. Thus to provide more detailed clinical exact theory of Shuanghuanglian rescue aconitine poisoning. 【Methods】 In this study, the Primary culture rat ventricular myocytes, were divided into normal control group：aconitine group, Shuanghuanglian intervention group .Using Whole-cell patch clamp technique to record sodium current of rat ventricular myocytes, to observe the change of 1umol/L aconitine on sodium ion channels of cultured myocardial cells ,and the intervention by 100mg/L SHL injection.【Conclusion】1. Aconitine enhanced the current of sodium channels.2. Shuanghuanglian can markedly inhibit the increase of INa by aconitine on ventricular myocytes.
【KEY WORDS】Shuang huanglian, aconitine, Ventricular myocytes, Primary culture, sodium current
乌头类中药及其复方制剂的药理作用，乌头碱是其中所含的活性很强的生物碱的主要成分。乌头碱中毒是常见的临床急诊事件，中毒后导致死亡的事件时有发生。研究表明，乌头碱有显著的心脏毒性，中毒后极易因各型严重心律失常，导致循环系统衰竭，甚至死亡［1 －2］。此类中毒，目前国内外尚无特效解毒药物及方法，现救治该类中毒的临床水平，多限于催吐、洗胃、导泻、利尿、补液、对症、支持治疗【3】。
有关乌头碱所致心律失常的机制，国内外学者认为是通过影响心肌细胞离子通道来实现的【4】。双黄连粉针剂具有抗菌、抗病毒、解热抗炎、免疫调节功能等【5】。在肖桂林教授已取得临床和动物实验成功的基础上【6-7】，本研究从心肌细胞膜钠离子通道着手，研究双黄连粉针剂对乌头碱作用靶点——心肌细胞膜上的钠离子通道电流改变的影响。
1.材料与方法
1.1实验药物、仪器及软件
乌头碱（纯度 ≥ 98%）；双黄连粉针剂；防震工作台；金属屏蔽罩；膜片钳放大器和A/D和D/A数据交换器[HEKA,德国]；微电极拉制仪[PUL-100,USA]；三维操纵器[MC1000e.controlier ，德国]；pulsefit EPC10；Clampfit8.0软件；Origin6.1：用于数据的拟合，作图和统计分析。所有实验均在室温下（22-25°C左右）完成。
1.2 试剂的配置
细胞外液(mmol/L):30 NaCl, 5 CsCl, 25 D-glucose, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2, 5 HEPES, 20 TEACl, 70 TMACl 用 CsOH 调节 pH 至 7.4。
细胞内液(mmol/L):135.0 CsF, 10.0 NaCl, 5.0 HEPES 用 CsOH 调节 pH 至 7.4。
2 全细胞膜片钳记录
2.1 INa的记录方法及刺激参数设置
记录Na通道电流-电压（I-V）曲线和稳态激活曲线的刺激方案为保持电位 (Vh)为一80 mv，去极化至+60mv，持续时间50ms，刺激频率0．2Hz，可记录到大鼠心室肌细胞INa。
记录INa稳态失活曲线应用双脉冲刺激，Vh为-130mv，条件脉冲从-130mv开始，每隔10mv去极化到-30mv，持续时间50ms，然后紧跟给一去极化至-10mv，持续时间50ms的测试脉冲。
记录INa稳态失活后恢复曲线应用双脉冲刺激，Vh为-120mv，给予-20mv、50mv的两个同样刺激（P1和P2），两刺激间隔保持Vh为-120mv，间隔时程从2ms开始，以2ms逐渐延伸到230ms，刺激频率为0.1Hz。分别记录P1和P2对应的峰电流I1和I2。
记录药物对INa影响的时间效应曲线的刺激方案为保持电位 (Vh)为一80 mv，去极化至+10mv，持续时间50ms，刺激频率0．2Hz，可记录到大鼠心室肌细胞INa及其变化。
2.2 实验加药
根据实验目的，将乌头碱和双黄连粉针剂用细胞外液溶解，用微量移液器将配置好的1umol/L的乌头碱溶液和100mg/L的双黄连溶液各10uL分别加入。
2.2.1乌头碱对大鼠心室肌细胞INa的影响
在 INa 通道记录稳定后，用微量移液器在细胞外液中加入1umol/L的乌头碱，5分钟后电流基本稳定再次记录INa通道电流，并观察电流变化。
2.2.2 再加入双黄连后大鼠心室肌细胞INa通道电流的影响
在记录乌头碱对INa通道电流的影响后，用细胞外液轻柔洗脱，然后将100mg/L双黄连加入，轻轻灌洗，5分钟后电流基本稳定记录加入双黄连后大鼠心室肌细胞INa通道电流的变化。
2.3 数据采集，分析及统计学处理：
分别记录稳态激活曲线、稳态失活曲线、稳态失活后恢复曲线，观察乌头碱作用后钠离子通道动力学和电流幅度的影响及双黄连对其的干预作用。各类统计数据均以±s表示，采用Excel 2013统计软件进行分析。组间比较采用t检验。双黄连对于乌头碱导致心肌细胞钠离子电流改变的影响，采用加药前后自身对照t检验。P<0．05被认为具有统计学意义。
3 结果
3.1 大鼠心室肌细胞的INa的特征
在膜电位达-60—-80 mv出现最小的内向电流，即开始激活，峰值电位约在-20mv时，达到内向电流的最大值(约在去极化后2-3ms)，反转电位为+30—+50mv。INa的激活和失活过程均呈现电压和时间依赖性。
3.2 乌头碱及双黄连干预后培养大鼠心室肌细胞INa的变化
3.2.1 乌头碱及双黄连干预INa 峰值的影响
用时程为50ms的去极化脉冲从钳制电压-80mv去极化至+60mv以激发最大钠电流，观察INa峰值电流在给药前后的变化。（见表1）
乌头碱1umol/L使INa峰值从（-872.3212 ± 206.9157 ）pA增加至（-3053.8718±416.0000）pA（p＜0.05）。
加入双黄连100mg/L后，INa峰值由（-3053.8718±416.0000）pA回复到（-933.3333 ±790.7820）pA（p＜0.05）。
乌头碱作用经洗脱后，INa仍不能恢复（图中只选取最为代表的三条电流线），而加入双黄连后INa大部分恢复，接近正常水平。（见图1）
图1：A：INa刺激方案。 B：INa为快速激活、
快速失活的内向电流。电流在2-3ms内达到
高峰。其激活和失活呈电压依赖性。
（为保证图片清晰，图中只选取最为代表的三条电
流线）a示正常心肌细胞（给药前）的INa；
b示给予1umol/L的乌头碱后INa内流增加；
c示在加入100mg/L双黄连后，其干预对乌
头碱所致INa内流有抑制作用。
3.2.2 乌头碱及双黄连干预对大鼠INa I-V曲线的影响
INa的I-V曲线呈典型的倒置钟型。INa在膜电位达-60—-80 mv出现最小的内向电流，即开始激活，峰值电位约在-20mv时，达到内向电流的最大值(约在去极化后2-3ms)，反转电位为+30±。（见图2）
图2：control:示不同的钳制电压下，给药前
原始电流INa。乌头碱：示不同的钳制电压下，
给予乌头碱后INa持续增加。双黄连：示不同
的钳制电压下，加入双黄连后,被乌头碱影响
的INa基本恢复到给药前水平。
乌头碱和双黄连的激活电位，峰电位，反转电
位和I-V曲线的形状不变，表明乌头碱及双黄
连对INa通道的动力学无显著影响。
3.2.3 乌头碱及双黄连干预对INa稳态激活曲线、稳态失活曲线和稳态失活后恢复曲线的影响
乌头碱1umol/l使INa稳态激活曲线稍向左移。100mg/L双黄连干预组，使左移的稳态激活曲线稍向右移，（P＞0.05）无明显统计学意义（见图3）；乌头碱1umol/l使INa稳态激活曲线稍向右移。100mg/L双黄连干预组，使右移的稳态激活曲线稍向左移，（P＞0.05）无明显统计学意义（见图4）；乌头碱使INa稳态失活后恢复曲线稍微提前，曲线稍向左移。双黄连干预后，使左移的稳态失活后恢复曲线向右偏移。（P＞0.05）无明显统计学意义。（见图5）
4 分析与讨论
4.1 钠离子通道电流的电生理学意义
心肌细胞的动作电位和静息电位也和其他兴奋细胞一样，来源于肌细胞的跨膜离子流，也就是膜电流，多种跨膜离子流的复杂变化产生心肌细胞的动作电位和静息电位，也就是说动作电位和静息电位是多种离子通道综合作用的结果【8】。以心室肌细胞为例，整个动作电位分成5期，即除极期（0相），快速复极期（1相），平台期（2相），缓慢复极期（3相）和舒张期自动除极期（4相）。0相主要由快钠通道开放引起大量钠内流（INa）形成。
4.2 原代心肌细胞培养的大鼠心室肌细胞的电生理表现
本实验采用的原代心肌细胞培养的大鼠心室肌细胞，能够记录到理想的INa电流。表现在得到的各种数据、拟合曲线等和相关文献基本相符。
4.3 乌头碱对心肌细胞INa电生理的影响
本研究观察了1umol/L的乌头碱溶液对大鼠心室肌细胞INa的作用。乌头碱对INa有明显的增强作用，促使细胞膜去极化，增加超射值，加速传导，缩短不应期，促使折返形成，这是乌头碱导致心律失常的作用机制之一。
4.4 双黄连对心肌细胞INa电生理的影响
本研究观察了1umol/L的乌头碱溶液对大鼠心室肌细胞INa的作用，以及100mg/L双黄连干预对此作用的影响。双黄连加入乌头碱作用后的心肌细胞，亦不影响INa的稳态激活、稳态失活和稳态失活后恢复曲线。但是双黄连的加入使乌头碱作用后的心肌细胞INa电流-电压曲线上移，几乎恢复中毒前水平，但仍然不改变激活电位、峰值电反转电位和曲线形状，提示双黄连在不同的膜电位水平对INa均有抑制，并且也没有改变钠通道的整流特性和离子选择性。
因此，双黄连解救乌头碱所致心律失常的的作用机制之一，就是通过抑制乌头碱对INa的内流促进来实现的，这也是通过影响钠通道的时间依赖性激活的门控机制实现的。
100mg/L双黄连粉针剂的加入能够明显抑制乌头碱对心室肌细胞INa的增加，并能使电流-电压曲线上抬。表明双黄连可使心肌细胞兴奋性、传导性和自律性的改变得到纠正，提示其对乌头碱所致INa增加有拮抗作用，能对抗乌头碱导致的心律失常。
我们认为,双黄连对抗乌头碱中毒所致心律失常的可能机理之一是通过阻断INa ,并进一步使: ①可激活的钠通道数量减少,膜兴奋的阈值提高,兴奋性降低; ②降低动作电位振幅,减慢传导速度,控制快速性心律失常;③使4相自动去极化的速率减慢,自律性下降,对自律性升高所引起的心律失常有对抗作用; ④延长钠通道失活后恢复开放所需的时间,从而延长动作电位时程及有效不应期;而对抗心律失常。
4.5 双黄连对乌头碱作用心肌细胞INa电生理影响的干预的临床意义
我们在前期临床和动物实验证实双黄连纠正乌头碱中毒所致心律失常有确切疗效的基础上对心室肌细胞的INa进行研究。实验结果显示双黄连可以通过抑制乌头碱对INa内流的促进作用，来救治乌头碱所致心律失常。
5 结论
1.乌头碱对心肌细胞INa有明显的增强作用。
2.双黄连粉针剂可拮抗乌头碱导致心肌细胞INa的增强。
参考文献
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论文作者:谭珊①，易丹②，陈琳①
论文发表刊物:《医师在线（学术版）》2019年第08期
论文发表时间:2019/7/2
标签：乌头论文; 细胞论文; 电流论文; 双黄连论文; 心室论文; 稳态论文; 电位论文; 《医师在线（学术版）》2019年第08期论文;