张宁宁[1]2016年在《非小细胞肺癌靶向治疗和耐药机制研究》文中进行了进一步梳理表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibition, EGFR-TKI)和间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)抑制剂的临床应用显着改善了非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的生存。但最终不可避免的发生耐药。因此,本研究将在晚期NSCLC患者中检测ALK融合基因并分析其临床预后意义,为NSCLC靶向治疗的临床实践提供数据参考。另外,建立EGFR-TKI耐药细胞系,分析其生物学性状,开展组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)或联合EGFR-TKI对NSCLC的抗肿瘤作用研究,为NSCLC治疗新策略的开展提供思路。本论文研究内容分为两个部分：第一部分：晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因的检测和临床意义分析第一章：晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因的检测。采用FISH、IHC和qRT-PCR技术分别检测139例晚期非鳞NSCLC患者的ALK状态,以FISH检测结果为参考,比较IHC和qRT-PCR检测ALK的敏感度和特异度。结果显示,IHC和FISH检测结果的一致性为96.9%,qRT-PCR和FISH检测结果的一致性为95.7%。IHC检测的敏感性和特异度分别为97.7%和96.6%,qRT-PCR检测的敏感性和特异度分别为89.2%和98.7%。结果提示,在临床实践中IHC技术可作为筛选ALK的有效方法,qRT-PCR技术可作为区分ALK具体变异类型的一种补充诊断手段。第二章：晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因临床意义分析。采用FISH.IHC和qRT-PCR技术分别检测173例选择性晚期非鳞NSCLC患者的ALK状态。分析患者的临床病理学特征,基因变异类型和临床预后。结果显示FISH、IHC和qRT-PCR检测ALK的阳性率分别为35.5%(59/166)、35.7%(61/171)和27.9%(34/122)。ALK融合基因阳性更倾向发生于不吸烟或轻度吸烟、年轻、伴有印戒细胞特征、分化差的腺癌患者。ALK FISH阳性服用克唑替尼患者的中位无进展生存时间(progression free survival, PFS)为7.6个月,总生存时间长于未接受克唑替尼治疗和基因突变野生型患者,但与EGFR基因突变接受靶向治疗患者的生存时间无显着差异。与IHC 1+患者相比, IHC 3+/2+患者具有较长的生存时间(P=0.026)。结果提示根据临床病理特征选择性富集NSCLC患者能够提高ALK融合基因阳性检出率,并能高效筛选合适的患者进行ALK抑制剂治疗。ALK蛋白的表达强度对患者治疗方案的选择具有一定的参考意义。第二部分：非小细胞肺癌靶向治疗耐药相关研究第一章：非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药细胞系的建立及其生物学性状分析和耐药后治疗新策略探索研究。采用埃克替尼低浓度持续加量法诱导,建立EGFR-TKI耐药NSCLC细胞系。对其生物学性状进行分析,探索其耐药机制及治疗新策略。结果发现成功构建的耐药细胞系其个别生物学性状不同于亲代细胞,对另外两种EGFR-TKI类药物吉非替尼和厄洛替尼呈高度交叉耐药性,MET基因扩增是引起耐药的重要原因。耐药前后两株细胞系对西达本胺均敏感,耐药后细胞对克唑替尼敏感。克唑替尼或联合埃克替尼能够明显抑制耐药细胞的增殖,减弱耐药细胞中MET及其信号通路中相关调配分子的活化程度,阻滞细胞在G2/M期并诱导细胞凋亡,同时能明显抑制HCC827IR细胞裸鼠移植瘤的生长。研究结果为临床EGFR-TKI类药物的应用及耐药后治疗方案的选择提供了实验参考,也为EGFR-TKI耐药机制研究及耐药逆转药物筛选等提供了必要的实验模型。第二章：组蛋白去乙酰化酶抑制剂或联合表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用研究。体内外实验研究西达苯胺或联合埃克替尼对携有不同遗传背景NSCLC的抗肿瘤作用及其相关分子机制。结果发现西达本胺单药对A549、HCC827、HCC827IR具有明显的增殖抑制作用,联合埃克替尼对H1975细胞具有明显的协同抑制作用。西达本胺单药或联合埃克替尼能抑制细胞中RAS/MAPK、PI3K/AKT和／或JAK/STAT信号通路的活化,阻滞细胞周期,激活caspase家族凋亡相关蛋白表达,诱导细胞凋亡。西达苯胺单药或联合埃克替尼能通过降低HCC827、HCC827IR和H1975细胞中P-catenin的表达而发挥抗肿瘤作用。西达苯胺能够上调H1975细胞中E-cadherin的表达而增强其对埃克替尼的敏感性。另外,西达本胺能够明显抑制HCC827IR细胞裸鼠移植瘤的生长,联合埃克替尼能够明显抑制H1975细胞裸鼠移植瘤的生长,且未发生体重减轻及其他毒副反应。本研究结果将为HDACi在NSCLC中的临床应用提供实验数据参考。以上两部分研究明确了不同检测技术检测ALK融合基因的临床适用性,揭示了ALK融合基因在中国NSCLC患者中的临床病理学特征及预后意义：同时,建立了NSCLC EGFR-TKI耐药细胞模型,分析了其生物学性状及耐药分子机制,并对耐药后治疗新策略进行了初步探索研究；另外,通过体内外实验揭示了西达苯胺或联合埃克替尼对携有不同遗传背景NSCLC的抗肿瘤作用及其相关分子机制。本研究结果能为NSCLC靶向治疗的临床实践和治疗新策略的开展提供思路。
郭亚男[2]2016年在《PD1阻断增强体外扩增NK细胞抗骨髓瘤效应的实验研究》文中研究说明背景自然杀伤细胞(natural killer, N K细胞),是一群大颗粒淋巴细胞,在抗肿瘤及感染免疫方面发挥着重大的作用。NK细胞通过其表面的活化性及抑制性受体识别靶细胞,活化性及抑制性信号的平衡决定了NK细胞介导的细胞毒作用。NK细胞对表达下调或缺失主要组织相容复合体-I(major histocompatibility complex class I, MHC-I)的靶细胞(肿瘤细胞及受感染细胞)发挥快速的自然杀伤,而不需要预先致敏。随着对NK细胞生物活性的进一步了解,以NK细胞为基础的免疫治疗在临床应用中有所发展和提高并且已经在肿瘤患者包括血液系统肿瘤中得以应用并取得了一定的疗效。根据NK细胞识别靶细胞的"missing-self"理论,异体较自体NK细胞具有更强的抗靶细胞的生物活性。NK细胞占外周淋巴细胞的5-15%。自体或异体NK细胞治疗的主要瓶颈之一是体外扩增的效率。因此,开发一个有效活化和扩增NK细胞的方法以获得足够数量和高效能的NK细胞是非常重要的。CD16属于Fcγ受体的一种类型,它是免疫球蛋白Fc段的低亲和力受体(FcyRIIIa), NK细胞上CD16与CD16激动剂即抗CD16抗体相结合能够引起NK细胞的活化而发挥NK细胞对抗肿瘤细胞的细胞毒活性并且释放细胞因子,比如干扰素γ (IFN-y)。此外,近期有研究提出通过抑制ADAM金属蛋白酶结构域17(ADAM metallopeptidase domain 17, AD AM17)阻断CD16分裂可以促进NK细胞对肿瘤的敏感性。因此,激活CD16信号通路应是一个有效的活化与扩增NK细胞的方法。通过抗体阻断免疫检查点分子途径,如程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD1)与它的配体PD-L1及PD-L2的连接而阻断抑制信号的传递在多种实体瘤及血液系统肿瘤中都取得了巨大的成功。PD1是一种细胞膜蛋白受体,与表达于抗原递呈细胞上的PD-L1/2相互作用而传递抑制性信号,这在诱导和维持外周免疫耐受的负性调控免疫应答途径中起重要的作用。T细胞在肿瘤患者的肿瘤微环境中经常被诱导性表达PD1,它与肿瘤细胞上表达的PD-L1连接,阻断T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。PD1阳性的T细胞被认为是一群“疲乏”的T细胞,特征是功能效应和扩增指数减退。除此之外,源于多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)的NK细胞也表达PD1。既然PD1分子在T细胞的发展中可以被诱导表达,那么可以推测在体外NK细胞的活化和扩增过程中PD1的表达也可能会有所提高。因此,评估NK细胞扩增体系中PD1的表达和NK细胞的功能变化与PD1阻断的联系是很有意义的。多发性骨髓瘤(MM)是一种浆细胞克隆性增生性疾病,是来源于终末分化的B淋巴细胞的血液系统恶性肿瘤,以骨质破坏和异常免疫球蛋白大量生成为特征。随着新型抗骨髓瘤药物的发展和临床应用,如蛋白酶体抑制剂硼替佐米及免疫调节剂来那度胺,MM的治疗效果已经显着提高,但是依然不能治愈。类似于其他恶性肿瘤,由于微小病灶(minimal residue disease, MRD)中的肿瘤细胞对传统化疗不敏感,肿瘤的复发难以控制。免疫治疗包括NK细胞输注联合PD1/PD-L1/2途径阻断或许能够为消除MM及其他肿瘤的MRD提供很有意义的治疗方法。目的：研究体外高效扩增正常人外周血NK细胞的方法并通过其对骨髓瘤细胞株RPMi8226细胞的杀伤进行功能检测；探讨PD1阻断对体外扩增的NK细胞对抗骨髓瘤细胞的活性及功能的影响并进行机制研究；观察NK细胞输注联合应用PD1阻断对多发性骨髓瘤小鼠皮下移植瘤生长及生存时间的影响。方法1.研究人外周血自然杀伤细胞体外高效扩增的方法并进行功能检测1.1人外周血自然杀伤细胞体外高效扩增的方法：采用淋巴细胞分离液分离正常人外周血单个核细胞,重悬于全培养液,以1×106/ml的浓度种植于孔板中,并向体系内加入CD16抗体和重组人白介素-2(IL-2)刺激NK细胞生长,37℃培养箱中孵育,定期更换培养液,添加新鲜IL-2,直至培养周期结束。1.2体外检测扩增NK细胞的活性及其对抗骨髓瘤细胞株RPMI8226的能力：在扩增第14天和21天分别收集NK细胞,台盼蓝计数并观察存活率,流式细胞术检测NK细胞纯度及活化性受体(NKp44,NKp46,NKG2D)和抑制性受体(CD158a,CD158b,NKB1)的表达。分别以慢性粒细胞白血病细胞株K562和多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226为靶细胞,CD107a易位表达检测NK细胞的脱颗粒能力,并进行PKH26和Annexin-V标记靶细胞检测NK细胞的杀伤功能。2. 体外检测PD1/PD-L1/L2途径阻断对扩增NK细胞效应功能的影响2.1体外抗体阻断PD-L1/2检测其对NK细胞细胞毒作用的影响：流式细胞术检测RPMI8226细胞上PD-L1和PD-L2的表达,确定其表达后,PMI8226与不同浓度的PD-L1和PD-L2抗体共培养2小时,作为MTT实验的靶细胞检测扩增NK细胞对其杀伤能力。2.2检测PD1在扩增NK细胞上的表达及抗体阻断PD1对NK细胞功能的影响：流式细胞术分别检测扩增第0天,14天和21天NK细胞上PD1的表达,在扩增第7天向体系中添加浓度为2.5 μg/ml的抗PD1抗体,继续培养至21天,收集NK细胞(exNK+PD1 blockage),台盼蓝计数观察存活率,流式细胞术检测NK细胞脱颗粒能力及对RPMI8226细胞的杀伤功能,观察PD1阻断对NK细胞效应的影响,并检测NK细胞上活化性受体的表达。3.体内实验检测扩增NK细胞对多发性骨髓瘤SCID小鼠的抗瘤作用3.1建立SCID鼠多发性骨髓瘤模型：准备16只6-8周龄的SCID雌性小鼠,收集对数生长期的RPMI8226细胞,将细胞以1×108cells/ml的浓度重悬于生理盐水,每只小鼠前肢背部皮下接种100μl RPMI8226细胞悬液,当肿瘤体积达到约300 mm3时开始进行治疗。3.2观察扩增NK细胞及联合PD1/PD-L1/2途径阻断抑制荷瘤小鼠骨髓瘤生长的能力：随机将16只符合条件的荷瘤小鼠分配为生理盐水(NS, control)、扩增NK细胞(exNK cells)、PD1阻断的NK细胞(exNK+PD1 blockage)以及扩增NK细胞+PD-L2抗体(exNK+PD-L2 blocking)四组。除对照组外,每组辅以腹腔注射IL-2,NK细胞经尾静脉注射,PD-L2抗体瘤内注射。观察荷瘤小鼠肿瘤体积变化及生存时间,荷瘤小鼠不能爬行时处死小鼠作为实验终止点。结果1.研究人外周血自然杀伤细胞体外高效扩增的方法并进行功能检测1.1健康供者PBMCs的NK细胞扩增：结果显示经过CD16及IL-2培养的NK细胞获得了高效扩增。扩增第21天,PBMCs扩增倍数达1002.2±394.53倍,流式细胞术检测NK细胞纯度为79.6%±3.7%,第14天和21天,NK细胞扩增倍数分别达到549.9±154.7倍和4011.5±1082.4倍。1.2扩增NK细胞的活性及其对抗骨髓瘤细胞株RPMI8226的能力增强：扩增NK细胞台盼蓝计数显示其全部存活,流式细胞术检测NK细胞活化性受体和抑制性受体的表达都明显提高,对K562和RPMI8226细胞的脱颗粒能力也分别提高至38.12%±6.16%和36.25%±7.69%,对RPMI8226细胞的杀伤能力在效靶比为0.3：1和1：1时分别提高至27.93%±3.33%和59.1%±3.6%。2. PD1/PD-L1/L2途径阻断增强了扩增NK细胞的效应功能2.1 PD-L1和PD-L2的抗体阻断加强了扩增NK细胞的细胞毒性：流式细胞术检测显示RPMI8226细胞上PD-L1和PD-L2的表达分别为58.5%±13.0%和73.1%±7.5%。RPMI8226细胞与PD-L1及PD-L2抗体共培养后作为靶细胞检测NK细胞功能,结果显示经较低浓度(1.25μg/ml)抗PD-L1抗体处理的细胞比不加抗体和较高浓度(2.5μg/m1)处理的细胞在杀伤时诱导更显着的RPMI8226细胞裂解(P<0.05)。阻断PD-L2的抗体浓度为2.5μg/ml和5.0μg/ml,相应的RPMI8226细胞的死亡率分别为31.2%±6.6%和24.1%±3.9%,但是在PD-L2的阻断实验中并没有发现剂量依赖性。2.2 PD1在扩增NK细胞上的表达升高及PD1阻断增强了扩增NK细胞对抗骨髓瘤细胞的脱颗粒及溶细胞活性：流式细胞术测定结果显示PD1很少表达于静息的NK细胞即扩增第0天的NK细胞,但是随着扩增过程的延长,PD1的表达呈逐渐上升趋势,第21天约26%的NK细胞表达PD1。在扩增体系中加入抗PD1抗体显着提高了NK细胞对RPMI8226靶细胞的脱颗粒效应,阻断PD1的NK细胞(exNK+PD1 blockage)较对照组(exNK)呈现出更高比例的CD107a阳性细胞(CD3"CD56+CD107a+,64.0%±1.0% vs.53.1%±2.7%, P<0.05)。ExNK+PD1 blockage与exNK相比更加显着地诱导RPMI8226细胞的凋亡(63.2%±6.2% vs.44.9%±7.5%, P<0.05)。为了探讨这种差异的机制,进一步检测活化性受体的表达,结果证实PD1阻断后,exNK+PD1 blockage上活化性受体NKp44、NKp46及NKG2D的表达明显高于exNK组,推测其可能为PD1阻断增强NK细胞效应的机制之一。3.扩增NK细胞体内抑制骨髓瘤细胞生长并延长荷瘤小鼠的生存时间皮下注射RPMI8226细胞,2-3周后16只小鼠的肿瘤体积都达到300mm3左右。荷瘤小鼠随机分配至为NS、exNK、exNK+PD1 blockage以及exNK+PD-L2 blocking四组,结果显示对照组小鼠的肿瘤生长速度明显快于其他叁组,而exNK组和exNK+PD1 blockage组抑制肿瘤生长的效果要优于exNK+PD-L2 blocking组。治疗后的第2、3、4周,治疗组所有小鼠的肿瘤都明显小于对照组。为了检测NK细胞联合PD1/PD-L1阻断治疗的效果,我们比较了治疗后对照组第一只小鼠死亡时间点即第28天时四组肿瘤细胞的大小。结果显示exNK组、exNK-PD1 blockage组及exNK+PD-L2 blocking组的肿瘤体积要明显小于对照组,并且exNK+PD1 blockage组比exNK组表现出更有效的抑制肿瘤生长的效果,exNK+PD1 blockage组的肿瘤体积为1297.0±118.1mm3,而exNK组的肿瘤体积为2747.2±568.8mm3。我们又进一步对比了对照组与治疗组荷瘤小鼠的生存时间,结果显示对照组、exNK组、exNK+PD-L2 blocking组及exNK+PD1 blockage组的平均生存时间分别是30天、44天、49天及57天。对照组中最后一只荷瘤小鼠的死亡时间是第36天。而exNK组、exNK+PD-L2 blocking组及exNK+PD1 blockage组第一只小鼠的死亡时间分别是第35、42及47天。治疗后第53天,所有的小鼠都已死亡,叁个治疗组与对照组相比都明显延长了荷瘤小鼠的生存时间。经exNK+PD1 blockage治疗的小鼠存活时间明显长于对照组(P<0.01)和exNK组(P<0.05)治疗的小鼠,而只略长于exNK+PD-L2 blockage组(P>0.05)。结论1.CD16抗体和IL-2联合应用可以高效扩增NK细胞,其纯度(>70%)和倍数(4000倍)达到理想效果,活化性受体和抑制性受体的表达上调,并且能够有效杀伤K562和RPMI8226细胞。2. RPMI8226细胞高表达PD-L1/2, PD1在NK细胞上的表达随培养周期延长而上调,体外阻断PD1-PDL1/2途径能够增强NK细胞对抗骨髓瘤细胞的脱颗粒及溶细胞能力,其机制可能与活化性受体表达升高有关。3.NK细胞及联合抗体阻断PD1/PD-L1/2途径可以有效抑制体内骨髓瘤细胞生长并延长荷瘤小鼠的生存时间。
林宗伟[3]2017年在《动脉粥样硬化T细胞克隆变化及通过let-7e调控血管内皮功能的研究》文中研究指明1研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)被认为是有多种免疫反应参与的慢性炎症性疾病,主要以动脉壁的脂质浸润、积累以及各种炎症免疫细胞的参与为特点。异常的炎症免疫在动脉粥样硬化的发生发展中发挥关键作用,但其触发机制迄今仍未完全阐明。T细胞是获得性免疫和炎症反应的关键调控者,与动脉粥样硬化的发生和进展密切相关。在斑块形成之前的脂质条纹阶段,淋巴T细胞已存在于病灶区。但是,目前对于T细胞在AS发生发展中的具体作用仍然存在一些争论。人和小鼠的动脉斑块中的T细胞主要是表达αβT细胞受体(T cell receptor,TCR)的CD4辅助性T细胞,双敲(Apoe-/-or Ldlr-/-)的老鼠免疫缺陷可以减轻AS的发生发展,给予CD4T细胞能逆转免疫缺陷的抗AS作用。但是,有研究在CD4T细胞免疫缺陷的Apoe-/-小鼠中得出了不一致的结论,发现给予高脂饮食后的免疫缺陷和免疫状态良好的小鼠AS的发生发展并无明显区别。不同T淋巴细胞亚群在AS发生发展中作用的复杂性和多样性可能是导致这些争论的原因之一。这些争论提示T细胞在AS发生发展中的作用远比人们想象的复杂,而T细胞亚群/克隆组成的多样性和可变性是导致这种复杂性的主要原因之一。因此,深入的揭示AS患者T细胞的克隆构成和变化特征可能为解答上述复杂的问题提供证据。某一特定范围的所有特异性不同的T细胞克隆的综合,就是该范围T细胞的免疫组库,它的多样性和组成特征直接反应了免疫应答的状态。因此,T细胞免疫组库在很多疾病中都存在显着异常。基于高通量测序的免疫组库测序技术已开始应用于免疫组库研究领域,它以T/B淋巴细胞为研究目标,对于多重或cDNA 末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)PCR 技术获得的B细胞受体(B cell receptor,BCR)或T细胞受体(TCR)不同区域进行高通量测序,能够以单碱基分辨率确定数百万种不同T或B细胞克隆。这一技术使全面准确的评估免疫系统的多样性成为可能。本研究有助于深入理解T细胞在动脉粥样硬化性心血管疾病(Atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)发生发展中的作用,揭示AS病变中炎症免疫异常的机制。2目的(1)利用免疫组库测序技术,分析AS患者外周血和斑块内T淋巴细胞免疫组库的构成和分子特征,包括克隆频率、互补决定区3长度分布(Complement determining region 3,CDR3)、CDR3 多态性、V/D/J 基因利用率等;(2)揭示AS患者与正常人相比,外周血和斑块内细胞克隆的分子类型和变化。3方法3.1外周血样本和组织样本的收取收取55例符合急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)诊断的病人的外周血,每例5ml,并收取56例健康人的外周血作为对照。用Ficoll密度梯度离心方法分离外周血的单个核细胞。组织样品来自尸检标本和有AS斑块的标本。3.2基因组DNA的提取利用离心吸附DNA技术提取纯化外周单个核细胞和组织样本的基因组DNA,从相应分组中的每一个样本中,收取相同量的gDNA混在一起,组成ACS外周血、正常外周血、动脉斑块的样本池。3.3多重聚合酶链式反应通过多重聚合酶链式反应,使用用于TCR-[βCDR3V和J区的特异设计的引物组,从基因组DNA扩增重排的TCR-βCDR3区。3.4高通量测序纯化多重PCR的产物,对DNA片段进行文库构建。随后,通过Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus实时PCR系统评估文库质量(插入片段长度和文库浓度)。桥式PCR扩增后,在Hiseq2000测序平台上进行双端101-bp测序。3.5生物信息学分析经严格标准过滤原始测序数据。过滤后,使用miXCR进行序列比对,调整测序和PCR引入的数据错误,并鉴定不同的CDR3序列及提供其表达情况的信息。该软件还提供了 CDR3区域的氨基酸序列,以及相应读数、插入缺失和V-D-J基因的数目和频率。其他分析,如频率间隔分布、累积频率分布和VDJ利用率,使用自制脚本和Microsoft Excel软件进行分析。多样性指数,包括香农指数,辛普森指数和伯杰-帕克指数,使用BPMSG网站的多样性计算器得出。3.6实时定量多聚酶链式反应(RT-PCR)通过Nanodrop 2000对每组纯化的gDNA进行定量。然后,使用SYBR Green Master Mix在Bio-Rad CFX96上进行实时定量多聚酶链式反应。β-肌动蛋白用作内部对照。3.7数据分析数据表示为平均值±SEM,并使用双尾t检验或单因素方差分析进行比较。P<0.05被认为具有统计学意义。使用GraphPad Prism软件和Excel进行统计分析。4实验结果4.1 T细胞克隆种类和频率分布在AS病变中显着异常在健康受试者的外周血中,氨基酸和核苷酸水平的T细胞的特异克隆类型与ACS患者的外周血和AS斑块相比显着增高。此外,AS斑块中前1000位T细胞克隆的频率显着高于正常受试者和ACS患者的外周血中的频率。AS斑块中的T细胞克隆数显着高于正常受试者和ACS患者的外周血(0.1-0.4%)。而且,较少的T细胞克隆在AS斑块中具有较高的累积频率。4.2 T细胞克隆长度分布特征在氨基酸和核苷酸水平,叁组的共同克隆的CDR3长度显示正常分布。11-16个氨基酸长度的共同T细胞克隆的频率在AS斑块中显着高于正常受试者和ACS患者的外周血中的频率。此外,AS斑块中具有某些核苷酸长度的共同T细胞克隆的频率显着高于其他组中的频率。4.3共同克隆分布特征分析正常男性和女性外周血中共同T细胞克隆的频率和数量相似,并且显着高于ACS患者相应性别的外周血中的频率和数量。ACS男性患者外周血中共同T细胞克隆的频率分布和数量与ACS女性患者的频率分布和数量显着不同。此外,AS男性患者的斑块中的共同T细胞克隆显着升高。4.4 T细胞克隆开放读码框分析AS斑块中的开放读码框内T细胞克隆的比例显着高于正常受试者和ACS患者外周血中的比例,而AS斑块中的读码框外的T细胞克隆的比例低于其他组。4.5 T细胞克隆插入和氨基酸利用率的特点分析在所有组中T细胞克隆的TCR CDR3区域中的核苷酸插入无显着差异,所有组中T细胞的TCR CDR3插入的长度大多<20个核苷酸。在所有叁组的个体中TCR蛋白质中20种常见氨基酸的利用率没有显着差异。4.6 T细胞克隆多态性分析AS斑块中T细胞克隆的多样性指数包括香农系数、辛普森系数,伯杰-帕克指数显着降低,表明AS斑块的T细胞克隆的多样性是减少的。4.7 T细胞克隆VDJ基因利用率分析在斑块中T细胞的VJ基因的利用率显着减少。AS斑块中的高频T细胞克隆例如V20-1-J2-7和V20-1-J2-5与其他两组相比显着升高。AS斑块中一些V基因(例如 TRBV4-1、TRBV5-4、TRBV12-4)和 J 基因(例如 TRBJ2-5、TRBJ2-1、TRBJ1-6)的利用率显着不同于其他两组。4.8 AS斑块中显着扩增的T细胞克隆的PCR验证实时PCR验证结果显示,ACS患者外周血中V29-1 J2-1、V20-1 J1-6、V6-3 J2-7和V11-2 J2-2克隆的含量或频率显着高于正常受试者。5结论(1)与正常受试者和ACS患者外周血中的T细胞克隆相比,AS患者斑块中的T细胞克隆类型显着降低;(2)叁组中不同长度CDR3区域的TCR共同克隆的频率显着不同。与其他两组相比,AS斑块组的共同克隆(特别是高频共同克隆)升高;(3)AS斑块的T细胞克隆多态性显着降低,V和(或)J基因的利用率显着降低。1研究背景动脉粥样硬化(Atheroclerosis,AS)是急性心肌梗死等严重心脑血管事件的主要病理基础。主要特征为全身大中动脉的进行性脂质沉积、炎性细胞浸润和纤维组织增生。AS发病机制复杂,迄今尚未完全阐明,但大量研究表明氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)是触发血管炎症反应,造成血管内皮损伤,启动AS发生的主要物质之一。Ox-LDL造成内皮损伤的机制涉及免疫细胞和内皮细胞等多种细胞内和细胞间的复杂信号传递,主要包括:1)激活T细胞等炎症免疫细胞,通过细胞毒性作用或分泌细胞因子间接杀伤内皮细胞;2)被内皮细胞摄取,直接抑制其增殖和迁移,诱导凋亡,造成血管内皮损伤;3)诱导内皮细胞分泌炎症因子和粘附分子等,通过吸引炎症免疫细胞直接作用造成内皮损伤。目前人们已经在单一细胞中充分研究了 ox-LDL的作用,但它对不同细胞间信号传递的影响和机制的研究还不充分。明确细胞间信号传递的分子,揭示ox-LDL对免疫细胞和其它细胞间通讯的作用和机制,将有助于全面理解ox-LDL和炎症免疫在AS发生发展中的作用,为寻找有效的干预措施提供理论依据。各种激素、细胞因子和血管活性物质都是细胞间通信的重要信使分子,它们或者被直接分泌到细胞外,或者在微粒体和外泌体等细胞外膜结构中,传递信号、调控相应靶细胞的功能。研究表明除了经典的蛋白质分子,在细胞外环境中也存在稳定的miRNA分子(在血浆或血清中的即为循环miRNA),这些细胞外miRNA是一类新的具有细胞间通讯功能的信号分子,能以自分泌/旁分泌的方式发挥调控作用,也能通过循环到达远端靶细胞,以内分泌的方式调控靶细胞功能,是一种普遍而重要的细胞间通讯方式。有研究认为循环miRNA主要是包装到外泌体和微粒体等胞外膜结构中运输,但也有研究则认为循环miRNA主要以核酸蛋白复合物的形式在循环中运输;最近有研究表明循环miRNA选择何种形式运输可能与miRNA的种类、细胞来源和疾病病程等有关,但关于循环miRNA如何识别并结合靶细胞的细节,以及在疾病中这一过程有何异常及其意义目前仍不清楚。这些争论和问题说明人们对循环miRNA这种新的细胞间信号分子的功能和机制了解还很少,深入研究循环miRNA在AS发生发展中的作用及其机制,对于将循环miRNA作为AS的生物标志物和治疗手段用于临床有重要意义。2目的(1)寻找细胞间信号传递分子,高通量测序方法阐述免疫CD4+T细胞分泌的外泌体中RNA种类构成;(2)研究外泌体运输的let-7e在调节内皮功能方面的角色,揭示ox-LDL在免疫细胞和内皮细胞通讯中发挥的作用和机制。3方法3.1 CD4+T细胞的提取及内皮细胞的培养收取ACS患者外周血,经Ficoll密度梯度离心方法分离PBMCs,磁珠抗体分离高纯度的CD4+T细胞。HUVECs细胞在ECM培养基,5%CO2,37℃的培养箱中培养,购买自ATCC。3.2 CD4+T细胞分泌的外泌体的提取Ox-LDL刺激提取的CD4+T细胞48h后,收取培养基,经超速离心得到外泌体沉淀。3.3实时定量聚合酶链反应通过RNA提取,逆转录和RT-PCR的方法对样本let-7e表达水平进行检测,U6作为对照。3.4免疫印迹(western blot)检测经过提取总蛋白、凝胶电泳、转膜、标记一抗和二抗、ECL曝光等步骤观察目的蛋白的表达。3.5高通量测序分析及数据分析提取外泌体total RNA构建RNA文库,对文库质量进行评估后,桥式PCR扩增,在Hiseq2000测序平台上进行配对末端151-bp测序。经过严格标准过滤原始数据,经过组装后,与RNA数据库比对,鉴定不同的miRNAs和mRNAs及提供其表达情况的信息。3.6免疫荧光及凋亡检测PKH-26标记外泌体后与HUVECs共同培养,24h后观察HUVECs的摄取外泌体和凋亡情况。4结果4.1 CD4+T细胞的分选纯度磁珠分选CD4+T后,流式细胞仪检测CD4+T细胞的纯度可达98%,高纯度的细胞利于下一步实验的顺利开展。4.2外泌体的分泌及鉴定Ox-LDL刺激CD4+T细胞后,可促进其分泌外泌体进入培养基,收取培养基中的外泌体,进行电镜检测,发现颗粒处于50-100nm之间,western blot发现其有CD63的表达。4.3外泌体RNA测序数据分析测序结果发现外泌体不仅含有众多的miRNA,还包含着许多mRNAs和IncRNAs,对mRNA基因功能富集分析发现,外泌体可能参与了众多生物学过程,包括细胞的凋亡、增殖、炎症免疫等反应。4.4 CD4+T以外泌体的形式分泌let-7eRNA测序结果发现CD4+T分泌的外泌体含有众多miRNAs,其中包含了丰度值较高的let-7e。而且RT-PCR发现与正常人的CD4+T细胞相比,AS病人的CD4+Tlet-7e表达量明显升高。同时我们发现,ox-LDL刺激CD4+T细胞后,其分泌的外泌体中的let-7e表达量明显升高,说明ox-LDL能促使CD4+T细胞以外泌体形式分泌let-7e。4.5 CD4+T分泌的外泌体可以被内皮摄取影响内皮功能提取CD4+T细胞分泌的外泌体,与HUVECs共培养发现CD4+T分泌的外泌体可被内皮细胞所摄取,且经过ox-LDL处理的CD4+T分泌的外泌体能够明显促进内皮细胞的凋亡。5结论(1)CD4+T细胞可分泌外泌体进入培养基或者血浆,它们不仅含有大量的miRNAs(包括 let-7e),还包含众多 mRNAs 和 IncRNAs。(2)ox-LDL处理CD4+T细胞后,其分泌的外泌体中包含的miRNAlet-7e表达升高。(3)CD4+T细胞释放的外泌体转运let-7e进入HUVECs,并影响了内皮细胞的凋亡。1研究背景血管内皮细胞(Endothelial cells,ECs)在免疫和炎症反应中发挥至关重要的作用。在炎症刺激激活的ECs中,通过抑制抗炎细胞因子可使许多粘附分子和促炎细胞因子上调(例如ICAM1,SELE和IL-6)。过度的炎症刺激引起的内皮功能障碍是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)和许多其他心脑血管疾病发展中最重要的起始事件之一。许多细胞和分子参与ECs的炎症反应,但是其调节机制非常复杂,迄今尚未完全阐明。有研究表明miRNA可作为ECs中炎症的关键调节剂。例如,miR-146a和miR-10a可通过靶向ECs中NF-kB途径的多种组分(TRAF6/IRAK4)抑制炎症;miR-92a通过靶向抑制NF-kB表达的KLF2/KLF4促进ECs中的炎症。另外,miRNA也直接靶向各种粘附分子,在活化的ECs中发挥抗炎作用,例如miR-31靶向SELE和miR-17-3p靶向ICAM1。此外,miRNA参与内皮炎症在众多疾病如动脉粥样硬化和糖尿病中发挥关键作用。因此,需要进一步的研究揭示更多的miRNA及其参与内皮细胞炎症反应的作用机制。let-7家族可以通过靶向促炎因子(例如let-7d靶向IL-13;let-7a靶向IL-6)发挥抗炎作用,也可以通过靶向抗炎因子例如IL-10而充当促炎因子。另外,let-7家族与内皮功能密切相关,包括凋亡、血管生成和内皮-间质转化。Let-7e是let-7家族的一员,具有调节内皮功能和炎症的重要功能。此外,有研究表明let-7e在包括冠心病在内的许多心血管疾病中表达显着增加。因此,我们推测let-7e可能通过直接或间接靶向某些炎症基因在调节内皮细胞的炎症反应中起关键作用。然而,到目前为止还没有证实这种假设的研究。2目的(1)系统阐述let-7e参与调控内皮细胞的各种生物学过程;(2)揭示let-7e调控内皮功能和炎症反应的机制。3方法3.1细胞培养及处理HUVECs细胞在ECM培养基,5%CO2,37℃的培养箱中培养。内皮细胞经50μg/ml ox-LDL处理,并在12h、24h、48h后收取细胞。3.2质粒构建及转染IkBβ和野生/突变体Inc-MKI67IP-3的pCMV6载体和siRNA购自GenePharma 和 Origene。使用 lipofectamine RNAIMAX 或 3000 试剂将 let-7e的模拟物/抑制剂/阴性对照(Negative control,NC),siRNA或不同载体分别转染到HUVEC中。3.3 RNA提取转染了 let-7e模拟物或抑制剂和相应的NC的HUVECs提取total RNA,并通过Nanodrop 2000分光光度计和Qubit 3.0荧光计定量。它们的质量也使用Agilent 2100生物分析仪进行评估.3.4芯片分析总RNA用cy3标记并与Agilent人类LncRNA 4×180K微阵列杂交。将mRNAs和IncRNAs的表达数据过滤并标准化,然后使用GeneSpring GX11.5确定 let-7e 调节的 IncRNAs 和 mRNAs。3.5生物信息学分析3.5.1功能富集分析使用用于注释,可视化和集成发现的数据库(DAVID)v6.7进行功能富集分析。3.5.2 let-7e潜在靶基因预测Let-7e 靶基因由 Targetscan,Micro T-CDS 和 miRanda 进行预测。在 let-7e模拟物组和let-7e抑制剂组中相反表达的转录本与上述工具预测的靶基因取交集,被认为是let-7e在HUVECs中的潜在靶基因。3.5.3构建共表达网络基于let-7e的预测靶点,使用CoExpress v1.5构建潜在地结合let-7e的IncRNAs和可能靶向let-7e的mRNAs的共表达/相关网络(Pearson相关系数>0.99,P<0.05)。然后,使用Cytoscape软件分析其拓扑结构和核心子网。3.6实时定量聚合酶链反应通过RNA提取,逆转录和RT-PCR的方法对各样本let-7e,pri-let-7e和mRNA表达水平进行检测,U6和β-actin作为对照。3.7酶联免疫吸附实验EILSA收集的培养基通过ELISA试剂盒检测ICAM1,VCAM1,SELE,SELP和IL-6的表达水平。3.8免疫印迹(western blot)检测经过提取总蛋白,胞浆蛋白和核蛋白、凝胶电泳、转膜、标记一抗和二抗、ECL曝光等步骤观察目的蛋白的表达。3.9荧光素酶报告实验将IkBβ3'-UTR或Inc-MKI67IP-3中let-7e的靶/结合序列(或其突变体)克隆到pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体中构建萤光素酶报道载体,分别用这些载体和let-7e模拟物/抑制剂或相应的NC转染HUVEC。双荧光素酶报告测定系统测定样本的萤火虫和海肾萤光素酶活性。3.10数据分析使用Benjamini-Hochberg校正来校准多个测试中的P值。使用自制脚本计算相关系数和P值。数据表示为平均值±SEM,并使用双尾t检验或单因素方差分析进行比较。P<0.05被认为具有统计学意义。R程序语言包用于所有计算。4实验结果4.1 let-7e调节的mRNAs/IncRNAs表达谱和功能富集分析芯片分析结果显示let-7e明显影响mRNAs和IncRNAs的表达,选择let-7e潜在靶向的385个mRNAs和let-7e潜在结合的102个IncRNAs分层聚类。let-7e模拟物抑制基因表达的作用非常明显,而let-7e抑制剂的作用与之相反。487转录本的基因集富集分析显示let-7e参与许多重要的生物过程和途径,例如免疫、细胞粘附、VEGF途径、NF-kB/MAPK途径。大多数途径与细胞增殖、凋亡和炎症反应密切相关。4.2 let-7e潜在调节的共表达相关网络基于上述487个转录本的表达数据构建共表达/相关网络,这个大网络的拓扑分析显示26个重要节点,包括NFKBIB(IkBβ)、MAPK1、DNMT3A和TP53BP1,它们参与炎症、增殖和凋亡的调节。选择与IkBβ显著共表达的节点构成的子网,在这些节点中,IkBβ和Inc-MKI67IP-3变化最显着。4.3 let-7e在内皮细胞中的促炎作用芯片数据表明let-7e可以上调HUVEC中许多关键的促炎细胞因子和粘附分子的表达,如 IL-1B、IL-6、ICAM1、VCAM1、SELE 和 SELP,而 let-7e 抑制剂作用相反。此外,他们大多数都受NF-kB调节。let-7e模拟物可以显着增加上述因子的分泌和mRNA表达,而let-7e抑制剂的作用不显着。4.4let-7e通过靶向IkBβ促进NF-kB发挥促炎作用let-7e模拟物在HUVEC中在mRNA和蛋白水平上显着降低IkBβ表达,但let-7e抑制剂相反作用。荧光素酶活性检测还显示let-7e模拟物显着降低转染了Luc-IkBβ-WT的HUVEC中的相对荧光素酶活性。Let-7e模拟物促进NF-kB转移到细胞核中并激活。4.5 Lnc-MKI67IP-3作为ceRNA抑制let-7e的促炎作用预测结果表明let-7e可以结合Inc-MKI67IP-3。萤光素酶报告检测显示,let-7e模拟物显着降低了用Iuc-Inc-MKI67IP-3-wt转染的HUVEC中的相对荧光素酶活性。与对照组相比,Inc-MKI67IP-3-wt载体可以减弱let-7e抑制IkBβ表达,显着增加IkBβmRNA和蛋白的表达。此外,let-7e模拟物显着下调Inc-MKI67IP-3表达,而let-7e抑制剂显着上调其表达。4.6 let-7e在ox-LDL处理的内皮细胞中和动脉斑块中上调ox-LDL处理HUVECs不同时间后,RT-PCR发现ox-LDL显着上调let-7e和pri-let-7e的表达,而IkBβ和Inc-MKI67IP-3的表达显着下调。此外,let-7e,IkBβ和Inc-MKI67IP-3在人动脉粥样硬化斑块中的表达与ox-LDL处理的HUVEC中的表达相似。5结论(1)通过抑制其靶基因IkBβ,let-7e可促进NF-kB转移到细胞核和活化,增强ECs中的炎症反应。(2)let-7e通过ceRNA交互作用网络机制调控NF-kB信号通路,发挥促炎调节因子的作用。(3)Inc-MKI67IP-3可以拮抗let-7e对IkBβ的抑制作用,而let-7e可下调Inc-MKI67IP-3,形成正反馈加重炎症。(4)let-7e,Inc-MKI67IP-3和IkBβ在oxLDL处理的HUVEC和动脉粥样硬
周武元[4]2017年在《苦参碱对肝细胞肝癌的抑制作用及其作用机制研究》文中提出肝癌的80%～90%病因是肝细胞肝癌(HCC),并且这也是世界上最流行的癌症之一。传统的化疗在肝细胞肝癌患者中常常发展出化学抗性。苦参碱是一个传统中药的一个有效成分,也是一个被承认的可用的肝细胞肝癌药物。在本研究中,主要考察了苦参碱对于人肝细胞肝癌细胞株HepG2的治疗效果及潜在的分子机制。高剂量的苦参碱(1.0mg/mL)能够显着性(P<0.05)抑制细胞增殖达48.39±3.32%,在这种情况下可观察到细胞收缩和破坏。苦参碱处理48小时后,流式细胞学分析表明G1/G0期细胞的比例显着性增加,而S和G2/M期细胞显着性降低。上述结果表明苦参碱的加入致细胞停滞。低浓度的苦参碱(0.2mg/mL)处理后,使用流式细胞术,定量实时PCR,免疫组织化学(IHC)和western blot分析可检测到肝特异性miR-122的上调,随后是miR-122的目标基因周期蛋白cyclin G1(CG1),以及凋亡抑制蛋白Livin和Survivin的下调。综上所述,苦参碱通过在人肝细胞肝癌HepG2细胞株中恢复肝特异性miR-122的表达诱导细胞停滞和凋亡。背景与目的肝癌是一类严重的健康问题,世界卫生组织(WHO)认为它是第四大癌症死亡的最普遍原因[1]。在2009年美国有22,620起新病例及18,160起死亡与肝癌相关。中国占全世界肝癌死亡的53%。在中国超过90%的原发肝癌为肝细胞肝癌(HCC)。它是第二大重要的癌症杀手,主要是影响到在最有生产力的全盛时期的中年人群[2]。肝癌在中国发病率高,死亡率在各种肿瘤死亡人数中排第二位,是影响我国人民生命健康的主要杀手[2]。当今世界治疗肝癌的方法,临床疗效不甚理想,开发新的抗肝癌药物是我国的重要抗癌任务之一。虽然肝脏切除手术是一种合适的HCC治疗选择,但它仅仅适用于处于肝细胞肝癌早期的一小部分患者[3]。传统的化疗仍然是人类癌症的一个重要治疗策略。但是,治疗肝细胞肝癌的大部分化疗药物是有高风险副作用的细胞毒性试剂,例如阿霉素(ADM),顺铂(cisplatin),5-氟尿嘧啶(5-FU)和多柔比星(doxorubicin)[4,5]。更多地是,化学抗性在肝细胞肝癌患者中产生,在化疗治疗的长期效用上表现为一种主要的障碍[6]。作为我国的特有的药物—中药,其对肿瘤的治疗作用近年来也开始受到世界各国的重视。因此,必须发展替代性治疗方法以改进肝细胞肝癌治疗效果。目前,大量的研究证据表明细胞增殖、分化、凋亡之间的平衡或失调与肿瘤的发病相关,那么利用药物诱导肿瘤细胞凋亡可以成为肿瘤治疗的一条新路,这样就产生了一个全新的途径,可以将包括肝癌在内的肿瘤治愈。传统中药(TCM)因其5000年历史,以及在中国初级卫生保健中仍然占有重要地位而被重视。传统中药通过使用现代技术可补充西药,因而,可看到西方世界对传统中药的兴趣越来越大。豆科槐属植物苦参(SF)在中国是一种广泛使用的传统中药,用于包括病毒性肝炎,心因性心率不齐和皮肤炎症等一系列疾病中。豆科槐属植物苦参的活性成分是各种不同的生物碱,其中苦参碱已经被表征为主要的生物活性成分[8,9]。苦参碱是中药苦参的提取物,它属于苦参类生物碱,其在抗心律失常、抗肿瘤、保肝和调节免疫的作用已经得到业内认可。其抗病毒活性使其可以用于慢性乙型肝炎的治疗[10]。有报道称肌肉注射苦参碱可改善慢性乙型肝炎患者的临床症状,修复肝脏功能并使血清从HBVDNA阳性转化成阴性[11]。还有表明苦参碱具有抗纤维化活性,抑制肝星形细胞中血小板驱动的生长因子和转换生长因子β(TGF-β)作用[12]。研究表明苦参碱在抑制细胞生长和促进人白血病细胞K562分化中有效[9,13,14]。苦参碱也是SMMC-7721细胞的分化诱导因子[15]。在人类多发性骨髓瘤细胞核胃癌MKN45细胞中,苦参碱能通过扰乱细胞-细胞粘附诱导肿瘤细胞凋亡并抑制癌症转移[16,17]。另外,也有报道指出,氧化苦参碱可以抑制体外培养的人肝癌细胞增殖。从而,表明氧化苦参碱可能的作用就是抗肝细胞肿瘤,其机制可能是诱导肝癌细胞凋亡。苦参碱可能会阻止肿瘤侵袭[18,19]。因此,苦参碱能成为一种用于肝细胞肝癌治疗的有希望的替代性抗癌药物。目前,苦参碱已被用于小鼠的肝细胞肝癌治疗[7],但是,苦参碱抗肿瘤治疗的效力和潜在的分子机制,以及与人类肝细胞肝癌相关的生理学和药理学效果还没有很好地表征出来。MicroRNA(miRNA)是由18-23个核昔酸组成的非编码小RNA分子,它由长约70～80nt的单链RNA形成的茎环结构经Dicer酶加工后生成,序列高度保守,以部分或完全互补的方式结合靶mRNA分子的3' UTR(非编码区)。miR-122a定位于人染色体的18q21.31,是特异性表达于肝脏的一种miRNA,并在肝脏总microRNA中有很高丰度,约占成年人肝脏总表达miRNAs的70%,在每个肝细胞表达在66000拷贝数以上,参与肝细胞分化、增殖、凋亡等一系列细胞内的生物学过程,有研究[20]发现在70%肝癌组织和肝癌来源的细胞系中miR-122表达下调,并且miR-122与肝癌的发生相关已经得到证实。相关研究显示,在肝癌细胞Hep3B和正常肝上皮细胞L02中利用miRNA芯片技术筛选miRNAs的表达差异,发现在Hep3B细胞中miR-122表达较低,另外,有研究表明miR-122表达水平的改变与肝癌细胞株对化疗药物的敏感性相关,而miR-122a的表达与肝癌细胞的细胞周期和凋亡的关系国内外尚没有相关研究。有研究显示[21],提高肝癌细胞系中miR-122的表达量,可显着抑制肝癌细胞的增殖并对凋亡有促进作用,然而抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡的具体作用机制,及其作用靶点目前还不得而知,需要继续研究。本研究中,苦参碱关于人类肝细胞肝癌细胞株HepG2的治疗效果和潜在的分子机制得到研究,我们设计实验以HepG2肝癌细胞株作研究对象,利用分子生物学和生物化学的研究方法,主要对苦参碱对肝癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响作研究,并研究了苦参碱对肝特异性miR-122在HepG2细胞系的作用,包括考虑到细胞增殖的抑制效果,细胞形态学的变化,细胞凋亡的诱导,以及肝特异性miR-122和其目标基因周期蛋白G1(CG1)、凋亡抑制蛋白Livin和Survivin的表达。进而探讨苦参碱诱导肝癌细胞凋亡的作用机理,为苦参碱在临床的应用提供实验依据和联合用药。方法细胞株和苦参碱处理人肝细胞肝癌细胞株HepG2(美国模式培养物保藏所(ATCC)编号HB-8064)购自中国医科大学癌症研究所(中国沈阳)。细胞用IMDM培养基(Iscove' s modified Dulbecco's medium)加10%胎牛血清和庆大霉素培养。苦参碱获自西安Botany Garden(中国陕西),HPLC检测纯度>99%。苦参碱储液为溶于ddH20制备为10mg/mL。对数期生长细胞以1×105细胞/mL接种,并在浓度范围从0.0(阴性对照)至1.0mg/mL的苦参碱中处理48小时。MTT试验苦参碱对细胞活力的影响通过参考文献描述的MTT试验[22]评估。简短地说,细胞以3000个细胞每孔密度铺板至96孔板中。处理结束时,去除上清,加入20μL四唑混合物,MTT,和270mL新鲜的IMDM培养基。在37℃C孵化4小时后,每孔加入120μLDMSO溶解四唑结晶。最后,使用多孔板酶标仪(Tecan,Manennedorf,Switzerland)。每个实验重复四次。结果表示为相对于未处理细胞的生长抑制百分比。显微观察消化细胞培养物(3×105细胞/mL)加入24孔板中(0.9mL每孔)并孵育12小时。然后每孔加入0.1mL苦参碱(低浓度0.2mg/mL或高浓度1.0mg/mL)。观察前细胞孵育48小时。检查细胞使用OlympusIX70倒置显微镜。流式细胞学(FCM)分析收集处于对数期的HepG2细胞至终浓度为2×105细胞/mL,并在6孔板中孵育12小时(2.7mL/孔)。然后每孔加入0.3mL苦参碱(低浓度0.2mg/mL或高浓度1.0mg/mL)用于诱导细胞,孵育48小时。同时,取0.3mL细胞培养物作为阴性对照,培养48小时,收集,用PBS洗涤,随后用70%乙醇固定。细胞离心以去除乙醇,PBS洗涤并使用碘化吡啶(PI)在暗处染色30分钟后进行流式细胞仪分析。最后,使用BD FACSCalibur(BD,USA)检测细胞周期。每个实验重复叁次。凋亡检测1×106个细胞用不同浓度的苦参碱处理48小时,然后离心收集。细胞沉淀通过 DNA 降解缓冲液进行降解(10mM Tris,pH7.5,400mM EDTA,和 1%Triton X-100),再离心。得到的上清在37℃加蛋白酶K(0.1mg/mL)过夜孵育,然后用RNA酶(0.2mg/mL)孵育2小时。用酚氯仿(1:1)提取后,DNA通过2%琼脂糖凝胶电泳分离并用溴化乙锭染色后在紫外光下观察。凋亡细胞的定量评估通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶叁磷酸缺口末端标记(TUNEL)法进行,该方法通过使用BD ApoAlert DNA片段试验试剂盒检查凋亡期间的DNA链的断裂。免疫组织化学染色免疫组织化学染色采用高度特异亲和力纯化的多克隆抗CG1抗体进行实验。阴性对照则采用未免疫血清代替第一抗体。简而言之,部件在保湿室中与磷酸缓冲液稀释至1.5%正常羊血清中室温孵育4小时后用磷酸缓冲盐溶液中洗涤。这些部件在用终浓度为2μg/mL的抗CG1抗体孵育过夜。用含0.02%Triton X-100的磷酸盐缓冲液洗6次,每次不少于15分钟后,切片用抗生物素蛋白-生物素化的过氧化物酶复合物法(Vector Laboratories,Burlingame,CA)按照使用者指南进行免疫染色处理。组织部件在装片前用迈尔的苏木精简短地复染。培养的细胞在组织培养皿的无菌盖玻片中生长过夜,用45%丙酮/10%甲醛(溶于0.1M磷酸缓冲液)固定5分钟,然后按照上述方法进行免疫组织化学试验处理。定量实时PCR试验成熟has-miR-122(P/N:4373151)在HepG2细胞中的表达由Taqman MicroRNAAssays(Applied biosystems)按照Gramantieri等[24]作一些修正后进行分析。每个样品分析叁次。逆转录反应从10ng全RNA开始,并使用环状引物。定量实时PCR在7500实时PCR系统(Applied biosystmes,USA)上使用标准Taqman MicroRNAAssays实验方案进行。20μLPCR混合物包括1.4μL逆转录产物,10μL2×taqmanUniveralPCRMaster混合液,5μL0.2μmol/LTaqman探针,1.8μL1.5μmol/L正向引物,和1.8μL0.7μmol/L反向引物。反应条件:96孔板,95oC孵育10分钟,然后以95oC孵育15秒和60oC孵育1分钟进行40个循环。基因表达相对定量的△△Ct法被用于检测miRNA表达水平。△Ct的计算为从待测miRNA的Ct减去U6RNA的Ct。△△Ct的计算为从每个样品的△Ct减去参照样品(未处理的HepG2)的△Ct。用方程2-△△Ct生成倍数变化。叁种参照样品的集合用于标准曲线计算和作为参照样品的△ACt。U6RNA的Taqman MicroRNAAssays(RNU6B,P/N:4373381;Applied Biosystems)。Western blot 分析细胞裂解物用RIPAbuffer(50mmol/LTris-HCl缓冲液,pH7.4,150mmol/L NaCl,1%TritonX-100,1%脱氧胆酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠)添加1Xhalt蛋白酶抑制剂混合物和1Xhalt磷酸酶抑制剂混合物(Pierce,Rockford,IL)制备。Bio-Rad蛋白分析用于确定蛋白浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜(Whatman,Boston,MA)。第一次杂交的膜用特异的第一抗体,然后用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体(Cell SignalingTechnology)。蛋白条带用商业化的Immobilon Western化学发光辣根过氧化物酶底物检测试剂(Millipore,Billerica,MA)显示。转移到PVDF膜的化学发光的蛋白用ECL Plus(GE Healthcare Amersham,Piscataway,NJ)检测。相对蛋白表达值通过ImageJ软件灰度测量进行定量检定。数据分析所有的数据用软件包SPSS19.0进行分析。结果用平均值±标准差。研究的统计学显着性由参变量的非配对Student's t检验确定。P<0.05的差异性可认为是显着的,P<0.01认为高度显着。结果苦参碱对HepG2细胞的生长抑制为检验苦参碱对HepG2细胞生长调节的效应,使用了一个苦参碱浓度范围为:0.2,,0.5,0.8和1.0mg/mL。苦参碱处理后48小时,与对照组相比,0.8和1.0mg/mL高浓度组观察到明显的细胞生长抑制,平均生长抑制率分别为44.03±4.18和48.39±3.32%。但是,低浓度苦参碱(0.2和0.5mg/mL)与对照组相比,对细胞生长没有明显影响。这些结果表明苦参碱对HepG2细胞的生长抑制效应具有浓度依赖性。细胞的形态变化苦参碱处理48小时后,用FIMS观察细胞形态。在低浓度苦参碱(0.2mg/mL)下处理的细胞与对照组相比没有表现出明显的不同;而相比对照组而言,清晰的形态变化,包括细胞收缩,破裂和破坏,均在高浓度苦参碱(1.0mg/mL)处理的细胞中观察到。高浓度苦参碱能够导致细胞群落减少,这可以从细胞屈光度下降中反映出来。通过苦参碱诱导细胞凋亡为检测苦参碱介导的细胞增殖抑制相关机制,利用流式细胞学分析评估细胞周期分布。与对照组相比,可以看到,G1/G0期细胞比例显着增加,而S和G2/M期细胞比例显着减少;用低和高浓度(0.2和1.0mg/mL)苦参碱处理后大部分细胞停留在G1期。二倍体比例略有增加而单倍体减少;另外,与对照组相比,细胞碎片大幅度增加。苦参碱对HepG2细胞凋亡的诱导作用也通过DNA碎片试验进行检验。在48小时,琼脂糖凝胶电泳表明苦参碱的处理导致HepG2细胞里DNA碎片的形成。通过TUNEL做出一个定量评估以检测DNA链断裂。与对照组细胞相比,在48小时1.0mg/mL苦参碱诱导33.1%的HepG2细胞凋亡。该结果表明,细胞用苦参碱处理引起HepG2细胞周期进程的显着性抑制,导致与对照组相比在G1期细胞百分比明显上升。苦参碱处理的细胞中肝特异性miR-122的上调为研究苦参碱处理和肝特异性miR-122表达量之间的相关性,不同样品的miR-122的相对表达量被检测。通过定量实时PCR分析确定苦参碱处理的HepG2细胞中miR-122表达量明显上调。这个上调通过提高苦参碱浓度被进一步增强,并达到峰值,约4.39倍,此时苦参碱浓度增至1.0mg/mL。苦参碱处理细胞中miR-122靶向的CG1下调免疫组织化学染色表明在低浓度(0.2mg/mL)苦参碱处理48小时后几乎所有细胞核和褐色细胞质颗粒是棕褐色。每一组的平均OD值表示CG1基因的表达水平。对照组的平均OD值是0.5367±0.0235;苦参碱处理组的值是0.3888±0.0826.苦参碱处理组的平均OD值是高显着性的,高于对照组的值,证明低浓度苦参碱足以抑制CG1基因表达。这些结果也被Westernblot实验所确认。对照组的条带比苦参碱处理细胞的要更为清晰明亮(约1.5倍)。苦参碱处理细胞中凋亡抑制基因Livin、Survivin表达下调不同浓度苦参碱作用于HepG2细胞后,随药物浓度越高,Livin、Survivin的mRNA和蛋白表达水平均越低,当苦参碱浓度为1.5mg/mL时,Livin、Survivin蛋白表达的抑制作用更显着(P<0.05)。讨论虽然传统化疗仍然是一个癌症治疗的主要方法,但癌细胞经常发展抗药性以显着降低化疗处理的效力。此外,考虑到与一些肝癌相关的贫乏的预后以及除手术之外的有限的治疗选择,患者可能会寻找替代治疗,包括传统中药产品,单独或与标准护理组合使用[1]。近几年,来自用于传统中药的药用植物的天然产物的潜力已被西方世界的科学团队所认识。许多天然产物及派生物因此列于癌症化疗的标准清单上[25]。新的传统中药获取的抗癌药物包括叁氧化二砷,喜树碱,斑蝥素,高叁尖杉酯碱,足叶草毒素,长春碱和长春新碱(见参考文献[25])。证据表明这些抗癌传统中药功能有1)凋亡诱导剂,通过与调节细胞增殖,血管再生或凋亡相关基因抑制细胞生长[26,27];2)免疫增强剂,促进免疫学功能或者加强对肿瘤和病毒的抵抗力[28]。本研究的结果证明苦参碱在抑制人的肝细胞癌细胞株HepG2的肿瘤细胞生长中起重要作用。苦参碱以剂量依赖性的方式降低HepG2细胞的生存。我们发现低浓度(0.2mg/mL)苦参碱足够抑制HepG2细胞生长;该细胞生长停滞为浓度依赖性,例如,当剂量增加时可观察到抑制作用提升。但是,细胞形态在低浓度(0.2mg/mL)下没有明显变化,除非剂量增加到1.0mg/mL(高浓度)。通过FCM分析检测相应的细胞周期,与未处理对照相比,时期的变化表明,随着细胞生长停滞,在苦参碱处理后48小时HepG2细胞被诱导凋亡。用MTT分析可得在低和高浓度(0.2和1.0mg/mL)苦参碱处理后,S和G2/M期部分显着性(P<0.05)降低,随后G1/G0其细胞比例增加。这些结果与苦参碱对鼠H22细胞增殖的抑制作用类似[7]。在苦参碱对鼠H22细胞的剂量作用中,使用0.5mg/mL苦参碱处理48小时发生明显的抑制,与此不同的是,在我们的研究中,在人HepG2细胞中低浓度(0.2mg/mL)作用48小时足以诱导细胞凋亡。这些结果表明低浓度苦参碱通过阻滞细胞生长以延长细胞周期来抑制HepG2细胞增殖。在本研究中细胞凋亡比例略微偏低,表明苦参碱对HepG2细胞的抑制作用主要通过细胞周期延迟(细胞生长延长和增殖减缓)而不是细胞凋亡来获得。G1/G0期细胞的明显增加和G2/M期细胞的减少暗示苦参碱对HepG2增殖的抑制作用可能主要是由于细胞在G1期停滞。但是,需要进一步的研究以确定这些结果并调查潜在的机制。肝细胞特异性miR-122通常被发现在所有肝细胞癌来源的细胞株中下调[24]。使用qPCR计数,在现在的研究中可以测定肝细胞特异性miR-122的表达量。与无苦参碱处理的HepG2细胞(对照组)相比,在所有苦参碱处理组miR-122的剂量依赖性上调证明了在人的HepG2中苦参碱和miR-122的相关性。这些线索通过Western blot分析CG1,肝细胞特异性miR-122的一个靶点,的下调进一步得到增强。低浓度的苦参碱(0.2mg/mL)抑制CG1,比对照组低1.5倍,而负相关的是miR-122的表达量提高了 1.861倍。这些结果表明抗肿瘤的传统中药苦参碱能够诱导细胞细胞停滞和凋亡,并伴随恢复人肝细胞癌HepG2细胞株中的肝特异性miR-122的
徐恩五[5]2016年在《LncRNA DB327252在非小细胞肺癌中的表达及促进肺癌细胞增殖的机制研究》文中研究指明研究背景与目的：肺癌是世界上发病率和死亡率最高,增长最快的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的健康和生命。2016年1月25日,全球癌症领域顶级杂志--《CA：临床医师癌症杂志》(CA Cancer J Clin)在线发表了国家癌症中心公布的2015年癌症统计数据显示：2015年中国癌症总发病429.16万例,总死亡281.42万例,其中肺癌的发病率最高,并且肺癌的死亡率也排在各种不同类型肿瘤之首。据统计,2015年全国肺癌发病73.33万,死亡61.02万。虽然在肺癌的诊断和治疗上取得了长足的进步,然而肺癌的5年生存率仍然低于15%。究其原因,一方面限于目前对肺癌的发生、发展及转移等机制还不是非常明确,同时缺乏有效、敏感的早期诊断、监测等指标,患者就诊时往往已经是肿瘤晚期,这是导致患者预后不良的主要因素；另一方面,目前肺癌的治疗手段除了手术以外,常规的放／化疗有效率不高,虽然靶向药物的临床应用使得肺癌的治疗取的比较瞩目的进展,但是如何提高药物治疗的有效率,解决化疗及靶向药物治疗过程中出现的耐药问题,仍然是当前肺癌治疗过程中亟需解决的一个问题。已有的研究表明,基因表达和基因调控异常可能是恶性肿瘤发生、发展的内因和基础,通过对肺癌发生机制进行深入探讨,寻找可能存在的与肺癌生物学活性相关的生物学标记物,探讨其作用于肺癌发生、发展的机制,从而做到对肺癌治疗的有的放矢。在早期的肿瘤研究中,人们的注意力主要集中在蛋白编码基因在肺癌发病机制上的研究。上世纪末进行的人类全基因组研究发现,在人类基因组的转录本当中,大约只有2%的基因具有编码蛋白能力,与此同时,90%以上的基因并不具备编码蛋白的能力,他们往往被转录成非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA),这些ncRNAs发挥的基因调控作用在肺癌的发生、发展过程中发挥着重要的作用。依据核苷酸的长度,我们把ncRNA又分为两大类：分别为核苷酸长度少于200nt的短链非编码RNA和核苷酸长度大于200nt的长链非编码RNA (lncRNA)。在相当长的一段时间里,人们一度对短链ncRNA的研究比较多,研究结果也提示了短链非编码RNA与宿主基因之间的相互调控作用在肿瘤演变的过程中扮演着重要的角色。随着近几年对lncRNA的研究不断深入,越来越多的研究提示lncRNA与短链RNA在肿瘤的演变过程中,发挥着类似的调控基因功能的作用。lncRNA一度曾被认为仅仅是RNA聚合酶Ⅱ转录时的副产物,是基因转录时的“噪音”和“垃圾”,并不具有特定的生物学功能,是一个“暗物质”。然而,随着这些年的研究发现,lncRNA在多种类型肿瘤细胞(包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等)的增殖、克隆、凋亡、侵袭、转移以及药物耐药等方面均发挥着重要的过程,至此,lncRNA的面纱才逐步揭开。随着研究的逐步深入,越来越多的lncRNA在基因调节等方面的功能被揭示出来。在已完成的一些关于1ncRNA与肺癌关系的研究中,提示lncRNA通过干扰蛋白编码基因表达、介导染色质重构和蛋白修饰、干扰nRNA的剪切、调控基因表达水平、调节响应单白活性、改变蛋白的胞质定位等机制参与肺癌细胞的增殖、侵袭转移、凋亡以及细胞耐药等一系列过程。但总体来说,lncRNA的调控作用概括起来主要在叁个层面实现,分别为：转录调控、转录后调控和表观遗传学调控。为了更好的了解lncRNA在非小细胞肺癌转化过程中的作用,我们收集了广州军区广州总医院胸外科2014年1月到2014年6月临床上符合本研究的83例原发性非小细胞肺癌的标本及其癌旁组织(>5cm),通过基因芯片进行筛选,发现一些在肺癌组织与癌旁组织中表达有差异的LncRNA,并在其中挑选出表达差异比较大的lncRNA DB327252作为本课题的研究对象,通过与所收集的标本的临床病理资料进行比较,探讨lncRNA DB327252的表达与临床特征之间的关系。进一步的研究是通过选择lncRNA DB327252表达水平比较高的肺癌A549&16HBE-T细胞作为研究对象,构建干扰序列siRNA,通过转染沉默A549及16HBE-T细胞株中的DB327252的表达,观察目的基因沉默后在细胞周期、凋亡、侵袭能力、迁移能力等方面发生的变化,进一步构建shRNA质粒稳定表达载体,通过体外软琼脂集落实验及裸鼠体内成瘤实验,观察lnc DB327252表达与肿瘤生长之间的关系。方法1.肺癌组织样本采集收集2014年1月至2014年6月期间,中国人民解放军广州军区广州总医院胸外科进行的肺癌根治手术或肺癌姑息性切除手术患者的肺癌原发病灶的肿瘤组织及癌旁组织标本(要求癌旁组织距癌中心组织距离>5cm),选取符合本研究要求的83例原发性肺非小细胞肺癌标本进行研究,标本要求在术前未进行过放化疗及免疫、靶向治疗,同时收集肿瘤样本患者的一般临床信息和详细的病理资料,建立随访数据库。生物标本的收集符合无菌的原则,并征得患者本人同意及广州军区广州总医院伦理委员会的批准。2.细胞系及培养方法通过购买或受赠获得正常人类支气管上皮细胞株BEAS-2B、16HBE-N;肺癌细胞株A549、H1299、H446、H460以及通过恶性诱导转化成的16HBE-T细胞株,使用含有10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和1%青链霉素混合液(100IU/ml青霉素,100ug/ ml链霉素)的MEM培养基(Modified Eagle's Medium,美国HyClone公司)或RPMI-1640培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)进行培养,置于37℃,5 %(v/v) CO2,饱和湿度的恒温培养箱中。3.总RNA提取及qRT-PCR分析应用Trizol法提取组织细胞总RNA,应用荧光染料法(SYBR Green II)进行基因芯片实验,检测1ncRNA的表达含量,并通过实时定量(qRT-PCR)检测各细胞株中的lncRNA DB327252的表达水平,并筛选出表达比较高的细胞株作为进一步实验研究的对象。4. SiRNA干扰序列的瞬时转染 制备lncRNA DB327252 siRNA/ Lipofectamine-2000复合物,依照转染说明书中的步骤对A549、16HBE-T细胞进行转染,用qRT-PCR对干扰的效果进行定量分析,分别在4Onmol/L浓度下和转染48h后进行观察,筛选出干扰效率最高的siRNA (>70%)进行下一步研究。5.细胞增殖能力检测将适量细胞接种于96孔板上,分别于转染后6 h、12h、24h、48h和72h进行检测,用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)试剂盒检测A549/siRNA、16HBE-T/siRNA细胞增殖能力。全自动酶标仪检测各组样品吸光值,根据细胞增殖率计算公式,计算出细胞活力。6.平板克隆情况检测取对数生长期细胞,接种于6孔板,接种14天后观察,当肉眼可见细胞克隆时终止实验,用0.1%结晶紫染色,计算克隆形成率。7.细胞周期情况检测6孔板接种细胞后无菌抗菌素培养基37℃, 5％CO2培养24h后转染siRNA,48h后收集细胞并用70%乙醇固定,-20℃过夜,再用PI染色,通过流式细胞仪检测各细胞周期细胞的分布情况。8.细胞凋亡检测将适量细胞接种于6孔板,培养基37℃,5%C02培养24h后转染siRNA,48h后收集细胞,洗涤、固定、透化,按照Annexin V-FTIC/PI试剂盒说明书步骤对细胞进行染色,应用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。9.体外侵袭实验转染24h后,用胰酶消化并制成单个细胞悬液,于每孔5×104个细胞的密度接种于Tanswell用的24孔板的上室,将500ul含20%FBS的DMEM培养基加入小室下层,培养24h后计算细胞侵袭率。10.细胞划痕实验细胞转染24h后,待细胞生长至100%汇合时,用枪头垂直在平板上划线。把脱落的细胞冲洗干净,37℃培养基培养24h,每6h显微镜下检测一次,并拍照记录,计算细胞生长覆盖区面积比。11.软琼脂实验6孔板每孔先铺好含2ml 0.6%底层琼脂,再于每孔加2 ml含细胞混合液(细胞浓度1×104个/ml)的0.3%低熔点琼脂糖,配置成上层琼脂,培养箱培养21天后,计算细胞克隆数(>50个细胞)。12.建立稳转细胞株用500ug/ml的G418筛选培养浓度,Lipofectamine-2000转染shRNA,24h后细胞传代,继续培养,10-14天左右挑选单克隆细胞,制备成悬液并进行计数。继续培养,等待细胞大量扩增以后,提取细胞总RNA,采用荧光定量检测的办法检测目的基因的表达是否下降。13.裸鼠成瘤实验用PBS把已用胰酶消化的细胞洗涤两遍后重悬,于4周龄的BALB/c裸鼠腹股沟皮下注射分别注射约150μ1含5×106个细胞的细胞悬液,两侧腹股沟分别注射siRNA-nc和shRNA细胞作为对比。注射后每人观察裸鼠的精神状态、反应、饮食、活动力、毛色、毛顺滑度及腹股沟皮下肿瘤的生长的情况,记录成瘤的潜伏时间。成瘤后隔天应用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b),28天后将裸鼠处死,解剖取出肿瘤,电子称称重。14.统计分析采用SPSS 20.0软件对测量的数据进行统计分析。所有的试验数据均至少重复3次测量,数据以x±s表示。计数资料两组间的比较用双侧t检验,3组资料的比较采用单因素的方差分析,取p<0.05为差异有统计学意义。结果1.基因芯片检测结果提取83例非小细胞肺癌组织及其癌旁组织细胞的总RNA,应用基因芯片进行筛选,发现lncRNA DB327252的表达水平明显高于癌旁组织,统计学有明显差异(p<0.05)。2.LncRNA DB327152表达与肺癌临床特征的关系以中位数的LncRNADB327152表达水平(M=4.39)为界点,将临床资料分为高表达组(>4.39)和低表达组(<4.39),通过比较发现,DB327252的高表达与患者的性别、年龄、淋巴结转移不相关(P>0.05),与吸烟(p=0.045)、组织学类型(p=0.023)、肿瘤大小(p=0.037夕以及TNM分期(p=0.002)相关,其中吸烟组人群中DB327152表达高于非吸烟组人群,腺癌组的表达水平明显高于非腺癌组,≥3cm肿瘤组的表达水平高于<3cm肿瘤组,TNM/Ⅱ-Ⅳ期中的表达明显高于TNM/I期中的表达水平。3.LncRNA DB327152在不同细胞株的表达水平与正常人类的支气管上皮细胞株BEAS.2B细胞相比较,16HBE-N是BEAS-2B的(1.184±0.137)倍,差异无统计学意义(P>0.05)；16HBE-T、A549、H1299、H446、H460分别是BEAS-2B的(16.259±1.209)倍、(20.596±1.81)倍、(17.009±0.890)倍、(16.088±2.002)倍、(12.496±0.907)倍,差异均有统计学意义(p<0.05),提示在恶性肿瘤细胞中,ncRNA DB327152普遍高表达。4.筛选siRNA分别用1个阴性对照序列(siRNA-nc)和4个siRNA序列 (siRNA-1.siRNA-2.siRNA-3.siRNA-4)转染,来下调目的基因的表达,并检测转染后的干扰效果。结果发现在A549细胞株中,siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4的干扰效率分别达到66%、77%、58%,差异有统计学意义(p<0.05)；在16HBE-T细胞株中,siRNA-2、siRNA-3的干扰效率分别达到65%、67%,同样差异有统计学意义(p<0.05)。5. lncRNA DB327252对细胞增殖的影响A549细胞株中,与空白组相比,转染阴性对照组siRNA-nc的细胞存活比例为(99.15±2.87)%,差异无统计学意义(P>0.05),可将siRNA-nc作为标准。将siRNA-2组、siRNA-3组细胞与siRNA-nc进行比较,发现siRNA-2组、siRNA-3组细胞的存活比例分别降至(36.20±1.88)%、(34.17±2.27)%,差异均有统计学意义(p<0.05);在16HBE-T细胞株中,与空白组相比,siRNA-nc组细胞存活比例为(96.21±1.2)%,差异无统计学意义(P>0.05),与siRNA-nc组相比,siRNA-2组、siRNA-3组细胞的存活比例分别降为(37.32±5.41)%、(39.00±1.72)%,差异均有统计学意义(p<0.05),提示lnc RNA DB327252的表达下调,A549/siRNA-2、A549/siRNA-3、 16HBE-T/siRNA-2、16HBE-T/siRNA-3细胞的增殖受到明显抑制。6.平板克隆检测 观察染色后>50个细胞的克隆数,经过计算,得出A549/siRNA-1、siRNA-2克隆形成率与A549/siRNA-nc相比,差异有统计学意义(p<0.05)；同样,16HBE-T/siRNA-1、siRNA-2的克隆形成率与16HBE-T/ siRNA-nc相比,差异有统计学意义(p<0.05),提示lncRNA DB327252的表达下调,A549/siRNA-2、A549/siRNA-3、6HBE-T/siRNA-2、16HBE-T/siRNA-3细胞的克隆能力下降。7. lncRNA DB327252对细胞周期的影响应用流式细胞仪对PI染色后的细胞进行检测发现,在A549/siRNA细胞株中,与siRNA-nc组相比,siRNA-2组中G0/G1细胞的比例上升至80.7%,差异有统计学意义(p <0.05)；siRNA-3组G0/G1细胞的比例上升至81.3%,差异有统计学意义(p<0.05)。在G2/M期中,siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至5.61%、7.87%,但差异无统计学意义(P>0.05);在S组中, siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至13.72%和10.88%,差异均无统计学意义(P>0.05);16HBE-T/siRNA细胞株中,与siRNA-nc组相比,siRNA-2组中G0/G1细胞的比例上升至84.22%,差异有统计学意义(p<0.05);siRNA-3组G0/G1细胞的比例上升至83%,差异有统计学意义(p<0.05)。在G2/M期中,siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至6.85%、7.20%,但差异无统计学意义(p>0.05);在S组中,siRNA-2组和siRNA-3组的比例分别降至8.93%和9.80%,差异均无统计学意义(p>0.05)。说明lncRNA DB327252表达下调,位于细胞周期中G0/G1期的比例增高,肿瘤生长受到抑制。8.lncRNA DB327252对细胞凋亡的影响A549/siRNA-1、siRNA-2凋亡率与A549/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05);16HBE-T/siRNA-1、 siRNA-2凋亡率与16HBE-T/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05),提示lncRNA DB327252基因在调节NSCLC细胞演变过程可能与细胞的凋亡无关。9. IncRNA DB327252对细胞侵袭能力的影响 转染处理24h后,A549/siRNA-1、siRNA-2组细胞的侵袭能力降低,但与A549/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05); 16HBE-T/siRNA-1、siRNA-2组细胞的侵袭能力也降低,与16HBE-T/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05)。10. IncRNA DB327252对细胞迁移能力的影响A549/siRNA-1、siRNA-2组划痕间距与原间距之间的比值与A549/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05);16HBE-T/siRNA-1、siRNA-2组划痕间距与原间距之间的比值与16HBE-T/siRNA-nc相比,差异无统计学意义(p>0.05)。11.软琼脂集落实验在A549细胞株中,与shRNA-nc组集落的形成率(64.93±5.10)%相比,shRNA转染沉默组的软琼脂集落形成率显着降低至(23.60±5.05)%,差异有显着的统计学意义(P<0.01);16HBE-T细胞株中,与shRNA-nc组集落的形成率(67.73±6.56)%相比,shRNA转染沉默组的软琼脂集落形成率显着降低至(34.80±6.06)%,差异有显着的统计学意义(P<0.01)。12.裸鼠成瘤实验将shRNA和shRNA-NC转染的A549和16HBE-T细胞分别注射到裸鼠腹股沟两侧的皮下,通过观察,A549/shRNA稳转组的肿瘤生长速度要慢于shRNA-NC组,P<0.05；同样,16HBE-T/shRNA稳转组的肿瘤生长速度慢于shRNA-NC组,P<0.05差异均有统计学意义。A549/shRN A组的肿瘤体积明显低于A549/shRNA-nc组(667.32±41.35 mm3 vs 1691.45±44.70 mm3),差异有明显的统计学意义(P<0.05)。重量A549/shRNA对比A549/shRNA-nc组(233.2±86.37mg vs 448.2±120.8mg),差异有统计学意义(P<0.05); 16HBE-T/shRNA组肿瘤体积也低于16HBE-T/shRNA-nc组(633.18±46.75 mm3 vs 1448.20±85.69 mm3),差异有统计学意义(P<0.05),重量16HBE-T/shRNA 对比 16HBE-T/shRNA-nc组(267.3±74.86mg vs 391.4±86.61mg),差异具有统计学意义(P<0.05)。提示：DB327252基因表达下调后,体内试验中肿瘤的成瘤速度及成瘤体积及重量均出现了下降,说明了肿瘤的生长减慢。结论1. LncRNA DB327252在非小细胞肺癌组织中呈高表达状态,具有类癌基因的功能,与非小细胞肺癌恶性程度增加相关。2. LncRNA DB327252的表达水平在性别、年龄、淋巴结转移上无统计学差异(P>0.05),在吸烟、病理组织学类型、肿瘤大小、TNM分期上的差异具有统计学意义(P<0.05),在吸烟组、腺癌组、肿瘤≥3cm组、TNM分期Ⅱ-Ⅳ期组中呈现高表达。3. LncRNA DB327252 ± A549、H1299、H446、H460及16HBE-T细胞株中均呈现高表达状态,具有恶性的生物学活性；4. LncRNA DB327252主要通过调控A54、16HBE-T细胞增殖和影响肿瘤细胞周期来促进肿瘤的转化过程;5.体外细胞软琼脂实验及裸鼠体内成瘤实验证实LncRNADB327252在促进肿瘤生长方面发挥着重要的
刘方兰[6]2016年在《TGF-β1在乳腺癌微环境诱导肿瘤相关成纤维细胞形成的机制研究》文中提出肿瘤微环境已经成为肿瘤治疗的重要靶点。对于许多实体瘤而言,尤其是癌组织,他们的微环境由肿瘤细胞本身、内皮细胞、免疫细胞和成纤维细胞组成,通过分泌细胞因子或者细胞之间互相作用促进肿瘤的发生。尤其是肿瘤相关成纤维细胞(CAFs),是肿瘤微环境中激活的成纤维细胞,在肿瘤的发展进程和转移中起着重要作用。TGF-β1作为一个转化生长因子,在肿瘤微环境起着重要的作用,既可以促进肿瘤的生长,也可抑制肿瘤的生长。但是,TGF-β1在肿瘤微环境中的作用机制尚不明确。而且,我们的临床结果显示在乳腺癌病人的肿瘤组织中TGF-β1的表达与CAFs的表型标志蛋白α-SMA的表达成正相关关系,说明TGF-β1的表达与CAFs的形成有关,但是其机制有待进一步探讨。首先,本课题将小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3血清饥饿24 h,建立体外营养剥夺模型,也是为了模拟肿瘤微环境中营养剥夺的条件。并考察TGF-β1在一定浓度下(2.5 ng/ml)对血清饥饿的NIH3T3细胞的作用。实验结果显示TGF-β1不仅缓解了饥饿导致的生长抑制、线粒体损伤和细胞凋亡,而且TGF-β1能够诱导饥饿的成纤维细胞NIH3T3的CAFs表型的形成。实验结果还显示,TGF-β1能够增强经饥饿处理NIH3T3细胞的MDC阳性率、自噬相关基因和蛋白的表达,而自噬抑制剂3-MA却阻断了TGF-β1的作用,降低了自噬的发生。共聚焦和电镜的结果进一步发现TGF-β1增强经饥饿处理的NIH3T3细胞自噬的发生。其次,自噬是应激条件下修复细胞损伤的主要机制之一,并且自噬与肿瘤的发生和发展也密切相关。因此,本课题以TGF-β1增强血清饥饿状态下NIH3T3细胞自噬功能的角度研究和探讨了TGF-β1缓解血清饥饿导致的细胞损伤和诱导NIH3T3细胞CAFs的表型形成的作用机理。为此,我们依次进行了以下实验:(1)采用自噬促进剂(Rapa)和自噬抑制剂(3-MA)探讨了自噬是否参与了TGF-β1诱导的细胞保护作用和CAFs的转变作用,实验结果显示自噬促进剂进一步增强TGF-β1诱导的细胞增殖和线粒体功能,而自噬抑制剂则抑制了TGF-β1的作用,阻断了TGF-β1的抗凋亡作用和CAFs转变作用。(2)采用siRNA技术干扰Atg5后检测自噬水平、细胞凋亡和坏死情况以及CAFs表型蛋白α-SMA和FAP-α的表达。实验结果显示Atg5 siRNA不仅阻断了TGF-β1诱导的自噬的发生,而且废除了TGF-β1对经饥饿处理NIH3T3细胞的作用,提示自噬是TGF-β1缓解血清饥饿状态下NIH3T3细胞损伤和诱导CAFs表型形成的作用靶点。(3)我们采用TGF-βR1/ALK5抑制剂LY-2157299探讨了TGF-β1介导的自噬缓解血清饥饿状态下NIH3T3细胞损伤和诱导CAFs表型形成的具体分子机制。实验结果发现LY-2157299能够阻断TGF-β1的经典通路-Smad通路,而且进一步阻断了TGF-β1诱导的自噬相关蛋白的表达和CAFs表型标志蛋白的表达。综合以上所有结果,我们推断出TGF-β可以通过激活Smad通路提高线粒体自噬的水平,在营养剥夺状态下清除受损的线粒体和降低细胞凋亡水平,从而一定程度上修复细胞损伤;并且TGF-β可通过Smad/自噬通路在营养剥夺状态下诱导成纤维细胞CAFs表型的形成。最后,为了进一步验证TGF-β1介导的自噬在营养剥夺状态下能够修复成纤维细胞的损伤和诱导肿瘤微环境中CAFs表型的形成,我们采用小鼠混合移植瘤模型,即小鼠乳腺癌细胞4T1和小鼠成纤维细胞NIH3T3以1:2的比例混合接入Balb/c小鼠内,从体内去探讨TGF-β1诱导的自噬对肿瘤微环境中成纤维细胞的作用以及其对肿瘤发展进程实验的影响。实验结果显示,与正常组相比,血清饥饿显着提高了肿瘤组织的自噬水平,但是却抑制了肿瘤的生长,增加了肿瘤组织的凋亡和坏死水平。而TGF-β1能够显着增强肿瘤组织的自噬水平和诱导CAFs表型的形成,并且促进了肿瘤的生长,也缓解了肿瘤组织的凋亡和坏死情况。而自噬抑制剂3-MA则抑制了TGF-β1诱导的自噬,废除了TGF-β1诱导的CAFs转变作用,从而抑制了肿瘤的生长。综上所述,TGF-β1诱导的自噬促进了肿瘤微环境中的营养剥夺状态下成纤维细胞的存活,并且促进了CAFs表型的形成,从而促进了肿瘤的生长。阐明了TGF-β1在肿瘤微环境中诱导CAFs转变以促进肿瘤生长的分子机制。本实验研究结果为研究和开发抗乳腺恶性肿瘤药物提供了新的作用靶点。
戴珅[7]2016年在《一、人CD59分子联合ILY在小鼠体内特异性清除靶细胞方法的建立及其应用 二、3-甲基腺嘌呤对小鼠动脉粥样硬化斑块的抑制作用及相关机制》文中研究表明目的近叁十年,生物学研究在不断更新的科学技术带动下得到了快速发展。在基因水平的研究中,无论是在体内还是体外,靶基因敲除和过表达技术已经成为研究特定基因功能的强有力的手段。在细胞水平的研究中,针对靶细胞群体的体内清除对研究特定细胞群体的功能和疾病的关系有重要价值。更重要的是,特异性细胞清除还适用于研究细胞的再生、细胞和组织分化,这对再生医学的发展有着深远的意义。然而,目前体内清除细胞技术与基因敲除技术相比相对落后和有限。早期的体内细胞清除研究主要使用诸如外科手术的方法在小鼠体内清除靶细胞群,例如,通过显微解剖、激光清除和抗体介导的细胞清除。但是由于这些方法往往存在技术难度、重复率低、造价高、效果差和对非靶细胞有毒性等弊端,其使用受到限制。近年来,基因工程学方法开始用于细胞的体内清除,包括：通过转基因技术在靶细胞中表达C aspase-3或 Caspace-8来促使靶细胞凋亡、在靶细胞表面表达单疱疹病毒1胸苷激酶(Herpes simplex virus 1 thymidine kinase, HSVtk)或者白喉毒素(Diphtheria toxin, DT)受体(DT receptor, DTR),再用核苷类似物或DT毒素在小鼠体内清除靶细胞。虽然这些方法大大提高了体内清除靶细胞的效率,但仍然存在不可忽视的弊端。通过转基因表达Caspase-3或Caspase-8诱导靶细胞凋亡对实验动物仍然存在毒性,而且清除靶细胞的速率很低。HSVtk转基因小鼠模型只能用于清除进行分裂的细胞,而对于未进行分裂的细胞不适用。DT/DTR介导的细胞清除是近二十年来应用最广泛的模型,但DT本身的毒性作用导致它的药理学安全窗口很窄,在实际研究中很难进行剂量依赖性细胞清除研究。故迫切需要建立一种更有效、简便和安全窗口大的细胞清除方法。中间链球菌毒素(Inrermedilysin, ILY)是一种由中间链球菌分泌的胆固醇依赖性细胞溶解素。可通过和细胞表面的人补体调节蛋白CD59分子特异结合发生多聚化,然后在细胞膜上形成细胞毒性孔道来裂解人的细胞。由于ILY仅选择性结合人的CD59 (human CD59, hCD59),而不结合其他种属的CD59,故对动物来说是很安全的。我们实验室在前期研究中已经发现ILY在hCD59转基因小鼠体内可选择性有效清除表达hCD59的红细胞和内皮细胞。提示hCD59联合ILY对细胞的杀伤可以成为一种新的动物体内细胞清除方法。但如何利用简单的方法建立多种靶细胞特异表达hCD59的转基因小鼠,以便利用ILY选择性清除靶细胞、使这种模型有更广泛的应用价值,成为亟待解决的问题。Cre是一种噬菌体的重组酶,它可以通过识别两个邻近的LoxP位点对位点间的基因序列进行环化切除,已被广泛应用于条件性基因敲除或条件性敲入小鼠的制备。如果能建立带有LoxP的hCD59转基因小鼠,将可利用现有的千余种细胞特异性表达Cre的转基因小鼠,制备出依赖Cre表达调控细胞特异性表达hCD59的转基因小鼠,进而用ILY方便地选择性清除多种靶细胞。因此本论文的目标为：1.制备LoxP-hCD59转基因小鼠(ihCD59、鼠),并通过与细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠(Cre+小鼠)杂交,获得细胞特异性表达hCD59的双转基因小鼠(Cre+ ihCD59+小鼠)。2.通过注射ILY在生理条件下和不同疾病模型中检测其对小鼠体内多种靶细胞的清除效果,研究其在细胞再生、修复和疾病研究中的应用。方法一, LoxP-Stop-LoxP-hCD59小鼠和细胞特异性表达人CD59转基因小鼠的制备(一) Lox-Stop-Lox-hCD59重组表达载体的构建1.制备Cre条件性表达hCD59载体通过将hCD59开放读码框插入CAG启动子及两端有LoxP位点的STOP转录终止元件(LSL)的下游,得到pCAG-LSL-hCD59载体。2.体外验证pCAG-LSL-hCD59载体的Cre依赖性在NIH 3T3细胞中共转染pCAG-LSL-hCD59载体和Cre重组酶表达载体(Cre+)或者单独转染pCAG-LSL-hCD59载体(Cre-),转染48小时后用hCD59荧光染色检测细胞表面hCD59分子表达情况。(二)LSL-hCD59转基因小鼠(ihCD59小鼠)的制备利用TARGATT技术,把CAG-LSL-hCD59的载体序列和体外转录得到的mRNA混合物通过TARGATTTM技术显微注射入80个FVB遗传背景的受精卵前核中,然后这些受精卵被移植入四只CD1培育小鼠体内。通过TARGATTTM载体上的attB位点和染色体上的attP位点之间的遗传重组,转基因CAG-LSL-hCD59被整合在H11位点。显微注射后共得到了23只子代小鼠,利用PCR检测小鼠基因组DNA中是否成功整合了LSL-hCD59序列。(叁)系统表达Cre和hCD59双转基因小鼠的制备1.获得系统表达hCD59的Meox2Cre+ihCD59+小鼠将ihCD59小鼠与系统表达Cre的Meox2Cre+小鼠杂交。在子代小鼠中通过基因鉴定得到基因组表达hCD59的Meox2Cre+ihCD59+双转基因小鼠和没有hCD59表达的Meox2Cre-ihCD59+小鼠(双转基因小鼠中的+代表+/-杂合子)。2.检测Meox2Cre+ihCD59+小鼠体内hCD59在各个器官的表达通过流式细胞术和免疫组织化学染色确定hCD59在Meox2Cre+ihCD59+小鼠的循环系统和各器官中的表达情况。以Meox2Cre-ihCD59+小鼠和C57BL/6小鼠作为对照。(四)多种细胞特异性表达Cre和hCD59的转基因小鼠的制备1.T细胞、髓系细胞和树突状细胞特异表达hCD59转基因小鼠的制备1)通过杂交诱导hCD59在T细胞、单核细胞和树突状细胞表达：为了使hCD59特异的表达在T细胞、单核细胞和树突状细胞中,首先将ihCD59小鼠与多个Cre特异表达的小鼠杂交,包括LckCre+小鼠、LyzCre+、鼠和(CD11cCre+、鼠。通过基因鉴定在子代小鼠中得到hCD59表达阳性的Cre+ihCD59+双转基因小鼠。2)检测hCD59的表达特异性：通过流式细胞术检测hCD59在各个子代Cr+ihCD59+双转基因小鼠品系外周血中的表达。2.肝脏细胞和胆管上皮细胞特异表达hCD59的转基因小鼠系的制备1)用多个方法诱导hCD59特异的在肝细胞和胆管上皮细胞中表达：①用ihCD59小鼠和AlbCre+小鼠杂交使hCD59在子代小鼠的肝细胞和胆管上皮细胞中同时表达。②用Alb启动子调控的腺病毒表达载体Ad-AlbCre+感染ihCD59小鼠使hCD59在小鼠肝细胞中表达。③用ihCD59小鼠和tamoxifen诱导性5ox9creERT+小鼠杂交使hCD59在子代小鼠的胆管上皮细胞中表达。2)检测hCD59在肝脏细胞中的表达：用hCD59抗体和胆管上皮细胞标志分子CK19进行免疫荧光染色检测,检测肝细胞和胆管上皮细胞中hCD59的特异表达。3.星形胶质细胞特异表达hCD59的转基因小鼠的制备1)制备有hCD59表达的mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠：用ihCD59小鼠和mGFAP-Cre+、鼠杂交,通过基因鉴定得到hCD59表达的mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠。2)检验hCD59在星型胶质细胞中的特异表达：对mGFAP-CreihCD59+小鼠的脑冰冻切片进行GFAP和hCD59的免疫荧光共染色,确定hCD59在星形胶质细胞中的特异表达。二、ILY/ihCD59介导的靶细胞清除方法在生理和病理条件下的应用(一)ILY的制备及活力测定和药理学特性的测定1.ILY的表达、纯化及活性检测1)将装载有重组ILY的表达载体转染到XL1-blue大肠杆菌中。用TB培养基摇菌,待培养液OD600达到0.5左右时加入IPGT诱导蛋白质大量表达。过夜培养后通过离心将菌体收集。2)用裂解液结合高速离心裂解大肠杆菌,通过His亲和柱分离纯化大肠杆菌裂解液中带有His标记的重组ILY。3)将含洗脱的ILY加到内毒素亲和柱上,按照说明书滤出的即为无内毒素的ILY。4)将ILY加入透析膜进行透析48小时去除洗脱液。5)用聚丙烯酰胺凝胶电泳确定ILY浓度,以已知浓度的BSA标准液作为参照。6)体外红细胞溶血实验检测提纯的ILY的活性,用热灭活ILY作为对照。2.检测ILY的药理学特征用高于实验浓度十倍到二十倍的ILY及热灭活的ILY分别注射ihCD59小鼠,确定ILY的药理学特性,检测注射后不同组织中ILY的分布以及对动物体是否具有毒性。3.检测胆固醇对ILY作用的影响方法同红细胞溶血实验,在反应体系中加入不同浓度的胆固醇(100ug/ml至1600ug/ml).(二)在生理状态下ILY对靶细胞的清除1.生理状态下ILY对免疫系统靶细胞的清除1)分离LckCre+ihCD59+小鼠的脾脏细胞并在体外进行ILY孵浴,用流式细胞术检测ILY在体外对hCD59阳性细胞的杀伤效果。2)分别给予LckCre+ihCD59+小鼠、LckCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠单次或多次ILY尾静脉注射(75ng/g小鼠体重),通过流式细胞术和免疫荧光染色检测相应小鼠中T细胞、单核细胞和树突状细胞在外周循环系统、脾脏和胸腺中的清除效果。3)检测高浓度ILY(150ng/g和300ng/g)对LckCre+ihCD59+小鼠、LyzCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠体内靶细胞的清除。4)检测单次ILY杀伤LckCre+ihCD59+小鼠、LyzCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠体内靶细胞后,靶细胞在外周循环系统和脾脏中的恢复情况。5)检测ILY对LyzCre+ihCD59+小鼠肝脏中巨噬细胞和枯否细胞的杀伤和细胞损伤后的修复。2.生理状态下ILY对实质器官中细胞的清除及细胞清除后再生的影响1)在不同小鼠系中检测ILY对肝细胞和胆管上皮细胞的清除对AlbCre+ihCD59+小鼠(肝细胞和胆管上皮细胞均表达hCD59). Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠(肝细胞表达hCD59)和经tamoxifen诱导过的Sox9Cre+ihCD59+小鼠(胆管上皮细胞表达hCD59)进行ILY尾静脉注射,并测量小鼠血清中ALT和胆红素变化。2)检测肝细胞和胆管上皮细胞受损后的修复在ILY注射40h后收集小鼠肝脏,通过BrdU染色检测各个小鼠系中肝细胞和胆管上皮细胞的增殖。3)利用ILY对小鼠肝细胞和胆管细胞的有效清除模拟了慢性损伤模型,对AlbCre+ ihCD59+小鼠、Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠和Sox9Cre ERT+ihCD59+小鼠分别进行了为期9天的多次ILY尾静脉注射(150ng/g,每叁天注射一次),在最后一次ILY注射48小时后收集各组小鼠器官,用免疫组化染色检测肝细胞和胆管上皮细胞的增殖。(叁)ILY/ihCD59介导的靶细胞清除在研究病理机制方面的应用1.免疫细胞清除与急性肝损伤1)清除DC细胞对α-GalCer诱导急性肝损伤的影响对CD11cCre+ ihCD59+小鼠进行尾静脉注射ILY或PBS,1小时后用a-Galcer诱导肝损伤。24小时后检测血清中的细胞因子和ALT变化。2)清除T细胞、B细胞和髓系细胞对Con A诱导急性肝损伤的影响对LckCre+ ihCD59+小鼠,CD19Cre+ihCD59+小鼠,LyzCre+ihCD59+小鼠和ihCD59+小鼠进行尾静脉注射ILY或PBS。3小时后用ConA诱导肝损伤。24小时后检测血清中AST和ALT变化以及对肝脏进行H&E染色。2.清除T细胞、B细胞和髓系细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响1)建立实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE)：用MOG免疫LckCre+ihCD59+小鼠,(:D19Cre+ihCD59+小鼠,LyzCre+ihCD59+小鼠和ihCD59+小鼠,诱导EAE发生。(2)ILY清除免疫细胞：免疫小鼠3天后开始对小鼠进行ILY注射,持续17天。每天观察并记录小鼠EAE发病的临床分数,免疫后第17天处死小鼠并观察小鼠脊髓中MBP和神经丝的变化。3.清除星形胶质细胞对中枢神经系统损伤后修复的影响(1)脑损伤模型：用立体定位系统对mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠造成脑损伤,并在损伤局部添加ILY处理杀伤胶质细胞。在损伤后7天收集脑组织进行切片染色,检测胶质细胞的清除水平。(2)脊髓损伤模型：对mGFAP-Cre+ ihCD59+小鼠制造脊髓损伤,用明胶海绵在损伤局部添加ILY处理杀伤胶质细胞。在术后观察小鼠行动力的恢复情况,损伤后7天收集脊髓,检测损伤区域胶质细胞的清除情况。结果一、获得了LoxP-Stop-LoxP-hCD59转基因小鼠(ihCD59小鼠)通过将hCD59开放读码框插入CAG启动子及两端有LoxP位点的STOP终止元件(LSL)下游,得到pCAG-LSL-hCD59载体；利用体外实验证实,转染pCAG-LSL-hCD59载体的NIH3T3细胞仅在共转染Cre重组酶表达载体的情况下,细胞膜表面有hCD59表达；通过Applied Stem Cell Inc公司的TARGATTTM定点敲入技术,把CAG-LSL-hCD59序列插入到FVB/NJ小鼠基因组的Hipp11(H11)位点,获得Cre诱导性表达的Lox-Stop-Lox-hCD59转基因小鼠(Cre inducible hCD59 mice, ihCD59小鼠)。在获得的23只子代小鼠中,通过PCR方法验证hCD59是否整合入小鼠的基因组DNA中。检测后共得到了一只ihCD59雌性小鼠和一只ihCD59雄性小鼠。值得说明的是,ihCD59小鼠为+/+纯合子小鼠。二、获得系统和多种细胞特异性表达Cre和hCD59的双转基因小鼠(Cre+ihCD59+小鼠)(一)获得系统表达hCD59的月eox2Cre+ihCD59+小鼠通过将ihCD59小鼠和系统表达Cre重组酶的Meox2Cre+小鼠杂交,并对子代小鼠进行基因鉴定,得到有hCD59表达的Meox2Cre+ ihCD59+、鼠和没有hCD59表达的Meox2Cre-ihCD59+小鼠(双转基因小鼠中的+代表+/-杂合子)。通过流式细胞分析术和免疫组织化学染色,发现hCD59在Meox2Cre+ ihCD59+小鼠的所有器官均有表达,而未表达于Meox2Cre-ihCD59+鼠和C57BL/6野生型小鼠中。说明通过ihCD59小鼠和Cre阳性小鼠杂交来获得hCD59表达阳性的子代小鼠是可行的；hCD59小鼠的诱导性hCD59表达在各个器官中非常均一。同时,hCD59在子代小鼠体内的表达严格受到Cre的调控。(二)获得多种细胞特异性表达hCD59的转基因小鼠1.获得T细胞、髓系细胞和树突状细胞特异表达hCD59的转基因小鼠通过将ihCD59小鼠分别与LckCre+小鼠、LyzCre+小鼠和(D11cCre+小鼠杂交,并对子代小鼠进行基因鉴定,使hCD59特异表达在：LckCre+ihCD59+小鼠的T细胞、LyzCre+ihCD59+小鼠的髓系细胞和CD11cCre+ihCD59+小鼠的树突状细胞中。通过流式细胞术发现hCD59仅在LckCre+ihCD59+小鼠的T细胞、LyzCre+ihCD59+小鼠的髓系细胞(如单核细胞和中性粒细胞)以及CD11cCre+ihCD59+小鼠的树突状细胞中特异表达。2.获得肝脏细胞和胆管上皮细胞特异表达hCD59的转基因小鼠系用ihCD59小鼠和Albcre+小鼠杂交,在子代获得hCD59在肝细胞和胆管上皮细胞同时表达的AlbCre+CD59+小鼠；用Alb启动子调控的腺病毒表达载体Ad-AlbCre感染ihCD59小鼠,得到Ad-AlbCre+ihCD59小鼠；用ihCD59、鼠和Sox9CreERT+小鼠杂交,并通过对子代Sox9CreERT+ihCD59+小鼠进行tamoxifen诱导,使hCD59在子代小鼠的胆管上皮细胞中表达。免疫荧光染色表明hCD59仅在AlbCre+ihCD59+小鼠的肝细胞和胆管上皮细胞中表达；在Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠的肝细胞表达;在sox9CreERT+ihCD59+小鼠的胆管上皮细胞表达。3.获得星形胶质细胞特异表达hCD59的转基因小鼠通过对mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的脑冰冻切片进行GFAP和hCD59的免疫荧光共染色,我们发现hCD59只特异的表达在小鼠神经胶质细胞中。叁、ILY/ihCD59介导的靶细胞清除方法在生理和病理条件下的应用(一)ILY的制备及活力测定和药理学特性测定1.ILY的产出、纯化及活性检测：ILY在大肠杆菌中大量表达后,通过His亲和柱纯化,获得纯度高、不含内毒素且具有活性的ILY。用热灭活ILY和高于实验剂量二十倍的ILY对ihCD59小鼠进行一次或多次注射,均未发现高剂量ILY对小鼠血常规指标和各个器官组织结构功能有任何影响。另外,发现在体外100ug/ml到1600ug/ml的外源胆固醇对ILY介导的细胞裂解无影响,为在高脂环境下应用ILY清除靶细胞奠定了基础。(二)在生理状态下ILY对靶细胞的清除1.生理状态下ILY对免疫系统靶细胞的清除1)ILY在体外成功杀伤了LckCre+ihCD59+小鼠的脾脏细胞中hCD59阳性的T细胞,而没有影响B细胞。2)对小鼠进行一次ILY尾静脉注射可以分别有效清除LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠外周血中的T细胞和单核细胞。ILY还可以分别清除CD11cCre+ihCD59+小鼠脾脏中的树突状细胞和LckCre+ihCD59+小鼠脾脏中的T细胞。并且,ILY在体内对hCD59阳性细胞的杀伤作用存在ILY剂量依赖性。提高注射的ILY浓度可以一定程度的增加靶细胞被清除的效果。3)检测了各种免疫细胞被单次ILY注射杀伤后的恢复再生情况。结果显示,LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠的外周血T细胞和单核细胞在ILY注射0.1小时后就可以被清除达90%,注射后24小时恢复到正常水平。同时发现单核细胞被清除后,Ly6C-细胞恢复的速度比Ly6C+细胞慢。LckCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠脾细胞中的T细胞和树突状细胞在ILY注射后24h也可恢复到正常水平。而对小鼠进行多次ILY注射可以将靶细胞水平长时间维持在较低的水平。4)ILY注射有效清除了L yzCre+ihCD59+小鼠肝脏局部F4/80阳性枯否细胞和巨噬细胞。BrdU标记显示经ILY杀伤后枯否细胞明显发生增殖。我们对C57BL/6小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠进行GFP标记的单核细胞移植。在正常状态下,移植后的C57BL/6小鼠肝脏中并不存在GFP阳性细胞。而经过ILY注射的LyZCre+ihCD59+小鼠中,1.5%的枯否细胞表现为GFP阳性。说明在枯否细胞被急性清除状态下,单核细胞参与了肝脏枯否细胞的再生。这一实验也说明ihCD59模型是研究免疫细胞分化和再生的有效工具。2.生理状态下ILY对实质器官中细胞的清除及细胞再生的影响1)ILY对肝细胞和胆管上皮细胞的清除：在对AlbCre+ihCD59+小鼠(肝细胞和胆管上皮细胞均表达hCD59)、Ad-AlbCre+ihCD59小鼠(肝细胞表达hCD59)和经tamoxifen诱导过的Sox9CreERT+ihhCD59+小鼠(胆管上皮细胞表达hCD59)进行ILY注射后,我们通过免疫染色发现ILY注射可以引发AlbCre+ihCD59+小鼠体内显着的肝组织损伤和胆管损伤。同时,肝损伤的程度呈现ILY浓度依赖性。在Ad-AlbCre+ihCD59小鼠中,ILY注射仅会引发肝细胞损伤。对经过tamoxife诱导的sox9CreERT+ihCD59+小鼠进行ILY注射会引起小鼠胆管损伤。2)肝细胞和胆管细胞的清除后再生：研究还发现ILY在AlbCre+ihCD59+小鼠引起肝细胞和胆管上皮细胞损伤40小时后,可以检测到肝脏有明显的肝细胞和心管上皮细胞的增殖。但是在Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠中特异清除肝细胞40小时后仅能检测到肝细胞增殖；而在Sox9CreERT+ihCD59+小鼠特异清除胆管上皮细胞后则可以检测到肝细胞和胆管上皮细胞均有增殖。同时,我们还对AlbCre+ihCD59+小鼠进行多次ILY注射。发现慢性肝细胞和胆管上皮细胞损伤引发了肝脏纤维化,在纤维化部位还检测到了肝脏祖细胞。但是只损伤肝细胞或者胆管上皮细胞则不会引起纤维化和肝脏祖细胞产生。(叁)ILY/ihCD59介导的靶细胞清除在多种疾病模型中的应用1.清除T细胞、B细胞和髓系细胞对急性肝损伤的影响1)利用α-Galcer诱导的肝损伤模型：我们发现在CD11icCre+ihCD59+小鼠中用ILY清除树突细胞可以显着缓解α-Galcer诱导的NKT细胞引发的急性肝损伤。2)利用Con A诱导的肝损伤模型：我们发现在LcCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠中,ILY介导的T细胞和单核细胞清除都可以缓解甚至阻止ConA诱导的急性肝损伤。但是在CD19Cre+ihCD59+小鼠中清除B细胞则没有对ConA诱导的急性肝损伤产生影响。2.清除T细胞、B细胞和髓系细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响采用EAE来验证ihCD59模型是否适用于研究慢性免疫性疾病中各免疫细胞的功能。实验结果显示,用ILY在LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠中分别清除T细胞和单核细胞可以显着抑制小鼠髓鞘受损程度,缓解EAE的发生,而在在CD19Cre+ihCD59+、鼠中清除B细胞则对疾病发生没有明显作用。3.清除星形胶质细胞对中枢神经系统损伤后修复的影响1)利用脑损伤模型,我们发现在mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的脑损伤部位局部注射ILY可以清除损伤活化的星形胶质细胞,而尾静脉注射ILY对星形胶质细胞的清除效果有限。2)利用脊髓损伤模型,我们发现在,nGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的脊髓损伤局部施加ILY处理也起到了消除反应性星形胶质细胞的作用。星形胶质细胞被清除的小鼠存在体重下降和活动能力恢复缓慢的现象。结论1.ihCD59/ILY介导的细胞清除方法可以特异、快速地清除体内靶细胞本研究成功建立了Cre条件性表达hCD59的转基因小鼠(ihCD59小鼠),通过与不同品系的细胞特异性Cre转基因小鼠杂交,使hCD59特异表达在子代小鼠的靶细胞中。对子代小鼠进行ILY注射可以实现对靶细胞的体内清除。肝脏细胞和胆管上皮细胞清除模型实验显示,ILY可以特异的在短时间内分别清除肝细胞和胆管细胞,而没有引起任何非目标效应。更重要的是,研究发现LYIihCD59介导的细胞清除存在ILY剂量依赖性。2. ihCD59/ILY介导的细胞清除方法可以被用于研究不同细胞在生理和疾病状态下的功能ILY单次注射和多次注射可以引起短期的和长期的靶细胞清除,成为研究细胞再生以及细胞在急性疾病模型(如急性肝损伤和中枢神经系统局部创伤)或慢性病理过程(如EAE)中功能的有力手段。3.ILY具有很大的使用剂量范围我们的实验表明比清除细胞的剂量高十到二十倍剂量的ILY对小鼠都是安全有效的,不会引起任何非靶细胞杀伤效应,对实验生物体也不存在毒副作用。创新性和意义本研究成功利用ILY和hCD59之间特异的相互作用,结合Cre重组技术实现了可诱导性的对多种细胞进行体内清除。与现存的其他细胞清除模型相比,ILY/ihCD59介导的细胞清除具有以下优点：1.ILY介导的细胞杀伤更加迅速：ILY可以通过与hCD59特异结合,在数秒内对细胞膜穿孔进而裂解细胞,实现对靶细胞的清除。2. ILY/ihCD59介导的细胞清除特异性更强：ILY只会结合hCD59,杀伤表达hCD59的细胞,而不会结合除人类之外其它生物的hCD59分子。因此,即使大量提高ILY的使用剂量也不会对其他非hCD59表达细胞产生影响。3.ILY具有很宽的药理学安全窗口：基于ILY裂解细胞的特异性高,比有效清除靶细胞的剂量高十到二十倍剂量的ILY对实验动物都是安全的,不会引起任何非靶细胞杀伤效应,对实验生物体本身不具有任何毒副作用。4.ILY介导的体内细胞杀伤具有明显的浓度依赖性：不同剂量的ILY可以引起不同程度的hCD59阳性靶细胞杀伤,这使ILY/ihCD59介导的细胞清除方法可以被用于需要不同程度清除细胞的研究。5.ILY的处理实施方便：在实验中,通过尾静脉注射、腹腔注射、皮下注射和局部作用等方法对实验动物进行ILY给药,都可以发挥很好的细胞杀伤作用。ILY的给药方式取决于靶细胞存在部位及状态,选择灵活。研究局限性ILY作为一个小分子蛋白质,在生物体内的扩散有限,在一定程度上受到体内屏障系统的限制。我们的研究结果显示ILY可以更有效的杀伤绝大部分外周血中的细胞,清除部分实质器官中的细胞,而对胸腺,骨髓和和中枢神经系统细胞杀伤效果有限。目的动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是脂质代谢异常诱导的血管壁的慢性炎症,是多种心血管疾病(如,冠脉综合征和脑中风)的病理基础,严重危害人类的健康。已知多种免疫细胞,特别是巨噬细胞在AS斑块的发生和进展中发挥重要作用。在动脉粥样硬化的早期,血液中的脂质成分通过受损的内皮细胞进入血管壁,进而诱发血液中的单核细胞迁入血管壁,活化成为为巨噬细胞,吞噬和清除脂质,以减少斑块的形成。随着病程的进展,如果脂质过多,过度荷脂的巨噬细胞会变成泡沫细胞,释放大量的炎性细胞因子和生长因子,促进斑块的发展和不稳定性斑块的形成,因此,抑制泡沫巨噬细胞的形成对减少斑块的大小和改进斑块的稳定性有重要价值。新近研究提示细胞自稳或死亡的新形式-自噬(utophagy)调控巨噬细胞的功能、影响斑块的不稳定性。自噬是真核生物进化中高度保守的对细胞内物质进行降解再利用的过程。细胞内的可溶性分子(异常折迭的蛋白和脂质)和受损老化的细胞器都可以被包裹进入囊泡,这种囊泡被称为自噬体。自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体,利用溶酶体中的水解酶将自噬体包裹的物质分解,帮助细胞达到生存产物的合成、降解以循环利用间的平衡。已知自噬参入动脉粥样硬化斑块的发生和发展,特别是发现基础的的巨噬细胞的自噬可抑制动脉粥样硬化的发生和发展,巨噬细胞可通过脂自噬促进脂滴的降解,促进胆固醇外排,从而抑制泡沫巨噬细胞的形成,抑制动脉粥样硬化的发生和发展。故自噬已经成为抗动脉粥样硬化药物研发的新靶点并已有相关药物进入临床。因此寻找能通过调控自噬水平的制剂,有可能成为新的抗动脉粥样硬化的药物。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)是磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)的抑制剂,由于它在饥饿时能通过抑制III型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(Class ⅢP13K)的活性而抑制自噬,故在体外常作为自噬的抑制剂被广泛使用。但有研究显示,在营养丰富的条件下,3-MA的长时间作用,也可以抑制I型磷脂酰肌醇叁磷酸(Class IPI3 K)促进细胞发生自噬。研究结果表明,3-MA在体内通过抑制自噬减轻了大鼠实验性自身免疫神经炎的发病及控制肠道病毒71的感染和疾病发生。3-MA对高脂诱导的动脉粥样硬化有何影响?是通过抑制自噬还是促进自噬发挥作用,尚不清楚。故本选用3-MA和另一种自噬抑制剂LY294002对动脉粥样硬化进行了干预,具体的研究的目的是：一、研究小鼠体内3-MA应用对高脂诱导的动脉粥样硬化的影响；二、探索3-MA影响动脉粥样硬化形成和发展的可能机制(抑制自噬或促进自噬或有其他作用)方法一、研究3-MA在动脉粥样硬化中的作用(一)动脉粥样硬化斑块的诱导和3-MA干预1.第一次干预治疗实验：将18只8周龄ApoE-/-小鼠随机分成叁组,每组6只小鼠：1)3-MA干预组(30mg/kg, Sigma,依据文献[31])；同时以另一种自噬的抑制剂LY294002作为干预对照组(0.3mg/kg, Sigma,依据文献[32])；PBS对照组小鼠。2)通过腹腔注射对小鼠进行相应的干预治疗,每周两次,共进行8周。3)最后一次注射结束后一周对小鼠进行解剖,收集心脏和主动脉。2.第二次干预治疗实验：根据第一次干预治疗的结果将18只8周龄ApoE-/-小鼠随机分为两组：3-MA治疗组(10只)和PBS对照组(8只),按照第一次治疗的方式重复实验。(二)检测3-MA对动脉粥样硬化斑块形成和发展的影响1.收集所有小鼠的主动脉,将主动脉的内壁充分暴露后进行油红O染色,分析阳性染色的主动脉斑块占主动脉总面积的比例。2.取小鼠主动脉根部制作成厚度为7um的连续冰冻切片,通过H&E染色和油红O染色分析主动脉根部斑块的大小和脂质成分比例。3.通过对主动脉根部冰冻切片进行CD3、Moma-2、smc免疫组化染色和天狼星红染色检测斑块中的炎性细胞浸润情况和斑块组成。4.通过TUNEL染色检测斑块中的凋亡细胞。5.通过公式计算小鼠的斑块易损因子。二、研究3-MA抑制动脉粥样硬化形成和发展的可能机制(一)检测3-MA在高脂环境对自噬的影响1.在体外,为了模拟体内动脉粥样硬化发生的过程,我们的对小鼠腹腔分离的巨噬细胞添加ox-LDL刺激。在添加ox-LDL刺激的同时,我们将细胞分为叁个实验组：ox-LDL单独刺激组,3-MA预处理30分钟后添加ox-LDL刺激组,雷帕霉素(Rap)预处理30分钟后添加ox-LDL联合刺激组。在各组添加刺激后的24、48和72小时分别收集细胞,提取细胞蛋白进行Western blot检测自噬标记蛋白LC3和p62的表达水平。2.对小鼠主动脉根部的冰冻切片进行LC3免疫荧光染色,检测斑块中的自噬水平。(二)检测3-MA对巨噬细胞泡沫化和存活的影响1.用小鼠主动脉根部的冰冻切片进行脂滴和LC3免疫荧光共染,分析斑块中脂质成分和自噬体分布的关系。2.在体外,将小鼠腹腔巨噬细胞分成两个实验组：ox-LDL单独刺激组,3-MA预处理30分钟后添加ox-LDL刺激组。在各组添加刺激后的24、48和72小时分别对各组细胞进行油红O染色,统计油红O染色为阳性的泡沫细胞占总细胞数量的比例。3.在体外,将小鼠腹腔巨噬细胞分成两个实验组：ox-LDL单独刺激组,3-MA预处理30分钟后添加ox-LDL刺激组、Rap预处理30分钟后添加ox-LDL刺激组。用CCK-8检测各组添加刺激后的24、48和72小时的细胞存活率。(叁)检测3-MA对斑块局部细胞因子的影响提取小鼠主动脉的总RNA,逆转录成cDNA后进行real-time PCR,检测主要炎性和抑炎性细胞因子的表达情况,包括IL-17、IFN-yγ、IL-6、 TGF-(3、IL-10、IL-35的亚基IL-12αr和Ebi3及其相关亚基IL-1213和p28。还检测了Treg细胞的标志Foxp3的表达。结果一、研究3-MA抑制动脉粥样硬化斑块的形成并促进了斑块的稳定性,但另一个自噬抑制剂LY294002无作用(一)3-MA抑制了动脉粥样硬化的形成1.由于3-MA的水溶性差,常规体外实验采用DMSO溶解。为了克服DMSO的毒副作用,本研究采用PBS加热溶解3-MA的方法,制备了低浓度水溶性3-MA,实验证明这种水溶性3-MA不仅不损伤肝肾功能,还降低了小鼠血清中的AST水平。2.通过主动脉大体的油红O染色,我们发现3-MA处理组小鼠主动脉中的动脉粥样硬化斑块显着少于PBS对照组小鼠,但LY294002处理组小鼠与对照组比较无明显差异。3.对主动脉根部冰冻切片进行H&E染色表明,与PBS对照组小鼠对比,3-MA处理组小鼠主动脉根部的动脉粥样硬化斑块面积明显减小。但LY294002处理组小鼠与对照组无明显差异。4.对主动脉根部冰冻切片进行油红O染色显示,3-MA处理组小鼠主动脉根部斑块中脂质成分明显低于对照组,但LY294002作用不明显。(二)3-MA对动脉粥样硬化斑块稳定性具有促进作用1.通过对主动脉根部进行相应的免疫组化染色我们发现,3-MA对T细胞浸润没有显着影响,但是明显降低了巨噬细胞在斑块中的比例,对斑块中平滑肌细胞的比例也有一定程度的减少。天狼猩红染色显示3-MA处理组小鼠斑块局部的胶原成分高于PBS对照组。TUNEL染色显示3-MA处理显着减少了小鼠斑块中的凋亡细胞数量和坏死核心面积。2.通过计算和统计发现3-MA处理组小鼠的斑块易损因子明显低于PBS对照组小鼠。但LY294002对斑块稳定性影响不大。二、研究3-MA抑制动脉粥样硬化形成和发展的可能机制(一)体外3-MA长时间处理促进ox-LDL诱导的巨噬细胞自噬、减少泡沫胞形成并降低巨噬细胞活力体外实验结果显示用ox-LDL诱导腹腔巨噬细胞泡沫化的同时用3-MA长时间处理(24、48和72小时)会显着增加自噬标志分子LC3的表达,同时作为自噬底物的p62分子会明显降低,说明3-MA3-MA长时间处理可促进ox-LDL诱导的巨噬细胞自噬。同时,发现3-MA可抑制ox-LDL诱导的泡沫巨噬细胞的形成和减低泡沫巨噬细胞的活力。说明在高脂环境下,3-MA可通过促进自噬,促进减少泡沫巨噬细胞形成和促进自噬介导的细胞死亡。(二)3-MA干预显着降低了脂滴成分小鼠体内实验显示斑块局部脂滴减少,残留的自噬阳性的巨噬细胞减少。采用免疫荧光染色检测小鼠主动脉斑块中脂滴和LC3阳性自噬体的水平,发现3-MA处理组小鼠斑块中自噬体少于PBS对照组小鼠。但是3-MA处理显着降低了小鼠斑块中的脂滴成分。同时我们发现脂滴主要积累在LC3染色阴性的区域,而自噬体较多的LC3阳性区域的脂滴明显减少。提示我么自噬有助于脂质的代谢排出。但是用Western blot检测LC3在小鼠主动脉中的表达,发现3-MA处理组小鼠主动脉壁中的LC3在蛋白水平要低于PBS对照小鼠,同时I型P13K通路在3-MA处理组也低于PBS对照组。结合体外实验,提示3-MA干预可能通过促进自噬有助于脂质代谢,并且最终引起巨噬细胞的自噬性死亡和清除。(叁)3-MA干预促进了炎症抑制性因子表达Real-time PCR显示3-MA促进了小鼠主动脉血管壁中的抑炎性细胞因子IL-10、 TGF-β口IL-35的表达,而对促炎性细胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平没有明显的影响。考虑到调节性T细胞是主要的免疫负调控性细胞,我们也检测了调节性T细胞的标志分子Foxp3的表达水平,发现3-MA处理组小鼠的Foxp3在转录水平明显高于对照组小鼠,提示3-MA具有改善斑块局部抗炎微环境的作用。结论一、3-MA对动脉粥样硬化有显着地抑制作用本研究证实3-MA显着减小了高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉大体和根部的斑块面积,并且显着减少了斑块中的脂质成分。二、3-MA促进了动脉粥样硬化斑块的稳定性3-MA有效增加了动脉粥样硬化斑块纤维帽区域的平滑肌细胞,并且减少了斑块中浸润的巨噬细胞和坏死细胞。3-MA处理组小鼠的斑块易损系数明显低于对照小鼠。以上现象均表明3-MA显着促进了动脉粥样硬化斑块的稳定性。叁、3-MA通过增强自噬水平,抑制巨噬细胞泡沫化并促进其死亡在高脂环境中,3-MA长时间处理促进了自噬的发生,从而有利于斑块区域泡沫化细胞中的脂质外排。3-MA还会影响高脂环境中巨噬细胞的存活率,在有效抑制细胞凋亡的状态下,可能诱导巨噬细胞的自噬性死亡,从而导致斑块中巨噬细胞的数量减少。四、3-MA可以促进斑块局部抗炎性细胞因子的表达3-MA在体内可以提高抗炎性细胞因子的水平,包括IL-10、TGF-β和IL-35,同时对Foxp3的表达水平也有促进,有助于维持斑块局部的抗炎微环境。创新性和意义1.本实验第一次在小鼠动脉粥样硬化模型中研究了3-MA长期作用对动脉粥样硬化的影响。2.本实验确定了低浓度溶解于PBS中的3-MA对实验动物不存在毒副作用,反而对高脂喂养的小鼠具有保护作用,使3-MA及其衍生物成为研发治疗动脉粥样硬化药物的新靶点。研究局限性1.本实验选用的LY294002并没有对动脉粥样硬化疾病的发展起到显着作用,有可能是因为选用的体内治疗浓度不合适本次实验。应选用不同浓度的LY294002和3-MA确定它们在体内对动脉粥样硬化的作用。2.鉴于自噬在动脉粥样硬化发生早期和后期的活化水平和对细胞的影响可能不同,应该分阶段研究3-MA在动脉粥样硬化早期和后期的功能是否
王新洲[8]2016年在《基于纳米尺度的木材胶合界面性能及改性机制研究》文中指出复合材料界面在多相体系中起着载荷传递和应力分散等作用,其结构性能对复合材料的整体强度、韧性以及耐久性存在重要影响。如何高效、精确、系统地评价界面结构与性能已成为界面研究的重点和难点。本文以针叶材南方松和阔叶材竹柳为研究对象,首次将具有高空间分辨率的纳米红外分析技术(AFM-IR)、纳米动态力学分析技术(Nano-DMA)和高温纳米压痕技术应用至木材科学研究领域,对木材胶合界面的物理结构、化学、力学等基本性质进行系统研究,旨在解释发生在纳米级水平的胶合现象,同时探讨界面老化、增强改性机制,为木材的有效利用、产品性能升级提供科学依据。首先,基于纳米尺度水平对胶合界面结构、化学和力学特性进行研究,揭示木材胶合界面的形成机理。研究表明,本论文中胶层树脂在南方松木材细胞壁中平均渗透深度达到1.3μm,渗透扩散至细胞壁S2层,与纤维素和半纤维素发生化学交联反应,形成稳定的木材-树脂交互界面;树脂在细胞壁层形成纳米/亚微米级“指接”结构,与木材细胞壁形成机械互锁,进而产生界面胶接力;树脂渗透进入细胞壁层,显着提高木材细胞壁的弹性模量Er、硬度H和抗蠕变能力;在酚醛树脂胶合界面区域,南方松细胞壁的Er和H分别增加了7.2%和26.1%,竹柳细胞壁的Er和H增加了17.01%和25.4%。界面区域木材细胞壁的瞬时弹性模量增加,粘弹性模量以及粘性系数减小;Nano-DMA有效获取了胶合界面重要动态力学性能参数,木材细胞壁具有较高的储能模量和耗散模量,表现出粘弹性,而树脂的储能模量和耗散模量较低,表现出脆性;经树脂渗透后,界面区域细胞壁的储能模量增加显着,但耗散模量变化不明显,且有下降趋势。然后,采用纳米压痕等技术研究温度、水热环境对木材胶合界面性能的影响,探讨胶合界面老化机制。研究表明,温度对胶合界面各相材料的微观力学性能产生不同程度的影响;加热温度低于100oC时,材料内部水分子减少,水分子的“塑化”作用减弱,纯细胞壁和树脂的弹性模量和硬度均增加,纯南方松木材和竹柳木材细胞壁的弹性模量分别增加了12.2%和16.9%。温度高于100oC时,细胞壁中少量碳水化合物降解,木质素含量增加,引起纯细胞壁弹性模量和硬度增加,树脂力学性能稳定,而胶合界面区域细胞壁的弹性模量和硬度值增加最为显着;温度环境使得木材细胞壁和树脂发生不同程度的尺寸收缩;高温测试后细胞壁的干缩率为1.91%和2.46%,而树脂的收缩率仅为0.39%和0.31%;正是由于温度作用下界面区域各相材料的力学性能和尺寸变化不协调,使得胶合界面传递、分散应力的能力下降,对胶合性能产生不利影响,高温处理后胶合试件的剪切强度显着下降。在水热处理过程中,木材中抽提物和少量碳水化合物溶出,少量酚醛树脂和脲醛树脂分子链段断裂,发生降解;水热处理后,木材细胞壁层结构疏松、胞间层间隙增加,树脂表面出现明显裂纹;而水热处理对胶合界面区域细胞壁结构影响较小,但界面区域细胞壁和树脂间由于内应力产生裂纹;水热处理对纯细胞壁和树脂的静态力学性能影响较大,南方松细胞壁的Er和硬H分别下降了7.2%和9.5%;竹柳细胞壁的Er和H值下降了12.7%和10.3%,胶合界面区域细胞壁力学性能变化不明显;经过水热处理后,胶粘剂树脂的动态力学性能变化最为显着,储能模量和损耗模量均显着下降,脆性增强;而界面区域细胞壁的力学性能基本保持不变;界面区域各相材料之间的干缩、湿胀性不一致以及界面区域各相材料的力学性能变化不协调,导致胶合试件的宏观剪切强度显着降低。基于以上研究结果,选用无机纳米材料蒙脱土改性胶合界面,同时评价改性效果和探索改性机理。研究表明,纳米蒙脱土不仅能以物理形态均匀分布于树脂体系中,还与树脂体系中聚合物发生反应,形成弹性网络结构,对树脂具有增强、增韧作用;改性树脂的静态弹性模量、硬度以及动态储能模量和损耗模量均显着增加,有利于保持胶合界面各相材料之间力学性能的协调性,使得界面应力更均匀,减小了应力集中现象;改性树脂具有优良的热稳定性和阻水性,可以提高胶合界面的耐水热性能,进而改善了木质复合材料的耐久性。
李静[9]2017年在《鼠衣原体肺部感染中NK细胞对CD4~+T细胞亚群和肺巨噬细胞极化的免疫调节作用》文中进行了进一步梳理第一部分鼠衣原体肺部感染中NK细胞对CD4+T细胞亚群的调节作用研究目的衣原体(Chlamydia)是一种严格细胞内寄生的原核细胞型微生物,可引起多种人类疾病。沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,C.trachomatis)是最常见的性传播性疾病的病原体,并可引起新生儿衣原体肺炎。肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,C.pneuwoniae)是继肺炎链球尚、流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎的第叁位主要病原体,在儿童、成人尤其是老人中引起急性非典型性肺炎。尽管多种广谱抗生素可用于治疗衣原体感染,但由于个体间不同的临床表现,药物耐药性等因素的存在影响了对衣原体病及时的诊断和有效治疗。目前尚无有效疫苗上市用于衣原体疾病的预防。因此,深入研究宿主抗衣原体感染中的免疫应答及免疫调控机制是探索新型防治策略的基石,对于进一步控制衣原体感染是必要的。衣原体感染后,宿主的固有免疫和适应性免疫共同参与抗感染免疫应答。衣原体感染可激活固有免疫细胞包括DC(树突状细胞,dendritic cell),巨噬细胞(macrophage,MΦ)和NK细胞(自然杀伤细胞,nature killer cell)等。这些细胞不仅能增强固有免疫应答也可以进一步影响适应性免疫应答。机体的抗衣原体适应性免疫以细胞免疫为主。CD4+T细胞在衣原体感染中具有重要作用,其中,以分泌IFN-γ为特征的CD4+T(Th1)细胞免疫应答在机体清除衣原体感染中发挥至关重要的保护性作用。Th17细胞通过产生IL-17和IL-22等细胞因子协同促进Th1细胞应答在机体清除衣原体感染中发挥重要作用。研究发现人和小鼠衣原体感染局部组织中Tregs应答增强且与组织病理损伤有关。NK细胞是固有免疫细胞的重要成员,在机体抵御病原体感染中起重要作用。除杀伤作用外,NK细胞的免疫调节作用近年来受到学者重视。越来越多的证据表明,在感染性疾病和炎症性疾病中NK细胞可调节T细胞应答。目前,尽管已有研究表明NK细胞在抗衣原体感染中起保护作用,但是有关NK细胞的免疫调节机制报道不多,尤其缺乏NK细胞对不同CD4+T细胞亚群免疫调控作用的研究。本研究采用BALB/c小鼠衣原体呼吸道感染模型,较系统的研究了 NK细胞对重要CD4+T细胞亚群的免疫调节作用。采用anti-asialo-GM1抗体特异性清除体内NK细胞。检测NK细胞去除对小鼠肺部衣原体清除能力、组织病理损伤的影响。利用ELISA、细胞内细胞因子染色以及荧光定量PCR等技术检测NK细胞对感染局部(肺组织)、免疫器官(脾脏和纵膈淋巴结)的不同CD4+T细胞亚群Th1、Th1 7以及Tregs的免疫调节作用,并进一步分析评估NK细胞对维持CD4+T细胞亚群免疫平衡的作用。研究方法1 NK细胞去除对小鼠衣原体肺部感染疾病的影响1.1鼠衣原体(C.muridaruw)的培养与纯化:培养Hep-2细胞,感染鼠衣原体,观察包涵体形成。玻璃珠方法收集感染细胞后,超声破碎释放衣原体,离心去除细胞碎片。超速离心纯化衣原体EB,-80℃保存1.2鼠肺部感染模型的建立:小鼠(6-8周龄,雌性BALB/c小鼠)麻醉后鼻吸入感染C.miridriarum(1 × 103IFU),建立C.muridarum肺部感染模型。1.3 NK细胞体内去除方法:小鼠于衣原体感染前一天,感染后一天尾静脉注射NK细胞封闭抗体(anti-asialo-GM1抗体),对照组注射同型对照抗体,之后间隔72h注射一次,直到实验结束。流式细胞术检测肺中NK细胞清除效率。正常对照组采用非感染的野生型小鼠。1.4小鼠疾病评估:小鼠经鼻吸入感染衣原体后,每隔24h记录体重;感染后不同时间(0、3、6、12和22天)取小鼠右肺中叶进行HE染色(hematoxylin-eosin staining),观察并评估肺组织病理损伤;取左肺制备肺匀浆,检测包涵体形成单位(IFU),观察肺中衣原体生长情况。2 NK细胞对T细胞亚群应答的调控作用2.1NK细胞对Th1、Th17和Tregs细胞分泌细胞因子的影响:小鼠于感染后6天和12天麻醉后处死,取肺(右肺上叶和下叶)、脾和纵膈淋巴结制备单个核细胞;心脏取血,获得血清。采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠肺、脾和纵膈淋巴结细胞培养上清(IFN-γ、IL-17A、IL-22和IL-10)和血清中(IFN-γ、IL-17A和IL-22)细胞因子分泌。2.2NK细胞对Th1、Th17和Tregs细胞群的影响:小鼠于感染后6天和12天麻醉后处死,制备小鼠肺、脾和纵膈淋巴结单个核细胞,细胞内因子染色,流式细胞术检测(CD3+CD4+IFN-γ+T)Th1、(CD3+CD4+IL-17+T)Th17 细胞和(CD4+CD25+Foxp3+T)Tregs 的比例和绝对数。3 NK细胞对Th1/Treg和Th17/Treg应答平衡的影响3.1 NK细胞对T细胞亚群转录因子表达的影响:取衣原体感染后6天和12天小鼠的脾和肺单个核细胞,提取总RNA,实时定量PCR检测Th1(T-bet)、Th2(GATA3)、Th17(RORγT)和Treg(Foxp3)细胞分化发育特异性转录因子的mRNA表达水平。3.2 NK细胞对感染局部T细胞分化相关细胞因子的影响:取衣原体感染后6天和12天小鼠的肺和纵膈淋巴结单个核细胞培养上清,采用ELISA方法检测IL-12、TGF-β和IL-6的表达变化。3.3 NK细胞对Th1/Treg和Th17/Treg比值的影响:根据以上流式数据和细胞计数结果,分析小鼠肺、脾和纵膈淋巴结中Th1、Th17和Tregs的绝对数,计算Th1/Treg 和 Th17/Treg 比值。研究结果1 NK细胞去除小鼠衣原体肺部感染加重1.1 Anti-asialo-GM1抗体可特异性去除NK细胞:于衣原体感染后第四天处死小鼠,检测小鼠肺中NK细胞比例。结果显示,注射anti-asialo-GM1抗体的小鼠肺中NK细胞数量和比例都显着降低,清除率为90%左右。1.2 NK细胞去除导致小鼠肺部感染加重:通过比较衣原体肺部感染后同型对照鼠和NK细胞去除鼠疾病变化发现,NK细胞去除鼠体重下降明显且恢复减慢(0-22天),肺部载菌量增加(感染后3、6、12和22天),HE染色结果显示,肺中支气管和血管周围有大量炎细胞浸润,组织病理损伤更重(感染后6天和12 天)。2衣原体肺部感染中,NK细胞增强Th1和Th17应答,抑制Tregs应答2.1 NK细胞促进IFN--γ、IL-17和IL-22表达:IFN-γ主要由Th1细胞分泌,而Th17细胞以产生IL-17和IL-22等细胞因子为特征。我们使用ELISA方法检测衣原体感染后6天和12天小鼠肺、脾和纵膈淋巴结细胞以及血清中IFN-γ、IL-17和IL-22的表达。结果显示,NK细胞去除后,以上器官中IFN-γ、IL-17和IL-22的表达水平均显着下降,血清中的浓度也明显降低。2.2 NK细胞去除导致Th1和Th17细胞的比例和绝对数降低:Th1细胞免疫应答在机体清除衣原体感染中发挥关键作用,Th17细胞协同促进Th1细胞应答。采用细胞内细胞因子染色,流式细胞术检测(CD3+CD4+IFN-γ+T)Th1和(CD3+CD4+IL-17+T)Th17细胞的比例和绝对数。分析NK细胞去除对Th1和Th17的影响。结果显示,与同型对照组相比,NK细胞去除组小鼠肺、脾和纵膈淋巴结中Th1、Th17细胞的比例和绝对数均明显降低,衣原体感染后6天和12天结果一致。说明NK细胞促进感染局部(肺)以及免疫器官(脾和纵膈淋巴结)屮Th1、Th17细胞的免疫应答。2.3 NK细胞去除导致Tregs的比例和绝对数明显升高:观察小鼠肺部感染过程中NK细胞去除对Tregs应答的影响。细胞内细胞因子染色,流式细胞术分析(CD4+CD25+Foxp3+T)Tregs的比例和绝对数。结果显示,与同型对照组相比,NK细胞去除组小鼠肺、脾和纵膈淋巴结中Tregs的比例和绝对数显着增加,尤其在衣原体感染早期(6天)肺中Tregs的升高比较显着。证明,在衣原体肺部感染中,NK细胞对Tregs应答具有抑制作用,尤其在感染早期(6天)较为明显。3衣原体肺部感染中,NK细胞可维持Th1/Treg和Th17/Treg应答平衡3.1NK细胞促进Th1和Th17细胞分化,抑制Tregs分化:实时定量PCR检测小鼠脾和肺细胞中T细胞亚群特异性转录因子的表达。结果表明,NK细胞去除诱导脾和肺细胞中转录因子T-bet(Th1)和RORyT(Th17)表达降低,Foxp3(Tregs)和 GATA3(Th2)表达增加。3.2 NK细胞去除导致维持T细胞亚群分化的细胞因子环境改变:采用ELISA方法,检测感染局部肺和纵膈淋巴结细胞培养上清中维持T细胞亚群分化的细胞因子表达变化。结果显示,衣原体感染中,NK细胞去除鼠肺和淋巴结细胞中维持Th1和Th17细胞分化的IL-12p40和IL-6分泌降低,而诱导Tregs分化的TGF-β表达水平增加。说明,NK细胞去除导致细胞因子环境改变促进了 Tregs的分化,而不利于Th1和Th17细胞分化。3.3 NK细胞去除诱导Th1/Treg和Th17/Treg应答失衡:分析T细胞亚群的绝对数并计算Th1/Treg和Th17/Treg比值。结果发现,在衣原体肺部感染后第6天,NK细胞去除导致小鼠肺、脾和纵膈淋巴结中Th1/Treg和Th17/Treg比值均降低,机体免疫应答倾向于Treg方向。在感染后12天,尽管同型对照组Th1/Treg和Th17/Treg的比值很低,NK细胞去除组的比值仍然显着低于对照组。说明,衣原体肺部感染中,NK细胞通过调控Th1/Treg和Th17/Treg应答平衡,发挥其免疫保护性作用。研究结论与意义1.NK细胞在BALB/c小鼠抵御衣原体肺部感染中发挥重要保护作用,有助于清除衣原体感染,减轻肺组织病理损伤,加快疾病恢复。2.NK细胞可显着抑制衣原体感染局部(肺脏)和外周淋巴器官(脾和纵膈淋巴结)中的Tregs应答,有利于增强保护性免疫反应。3.NK细胞通过促进Th1和Th17应答,抑制Tregs应答,从而维持Th1/Treg和Th17/Treg免疫平衡,增强机体清除肺部衣原体感染的能力,减轻组织病理损伤。本研究系统的揭示了在衣原体肺部感染中NK细胞对重要CD4+T细胞亚群的免疫调节作用,尤其是首次发现NK细胞对Tregs应答具有明显抑制作用。NK细胞通过维持Th1/Treg和Th17/Treg免疫平衡(促进Th1和Th17应答,抑制Tregs应答),在机体抵御衣原体肺部感染中发挥重要的保护作用。本研究为NK细胞免疫调节机制的研究提供了新见解。第二部分鼠衣原体肺部感染中NK细胞对肺巨噬细胞极化的调节作用研究目的巨噬细胞是重要的固有免疫细胞,在维持免疫稳态和抵御病原体感染中起重要作用。巨噬细胞具有极强的可塑性,极化状态是其发挥不同功能的关键,巨噬细胞至少存在两种不同的极化状态,分为M1和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞(又称为经典活化的巨噬细胞)可被IFN-γ、PAMPs、TNF-α等活化,产生前炎症细胞因子,高表达iNOS,可直接杀伤病原体。M2型巨噬细胞(又称为替代性活化巨噬细胞),由Th2型细胞因子例如IL-4、DAMPs和TGF-β等诱导激活,高表达精氨酸酶-1,YM-1,CD206,参与寄生虫的清除,免疫调节以及促进组织重建。与Th1/Th2极化相似,巨噬细胞M1与M2表型之间的转换同样由特异性转录因子控制。现已知,C/EBP-α、PU.1、NF-κB(P65/P50)、Stat1、IRF5和HIFα等分子参与调控M1型巨噬细胞激活;而Stat3、Stat6、IRF4和SOCS1等胞内信号分子则参与了对巨噬细胞M2型极化的调控。巨噬细胞的极化机制复杂,一直是最近研究的焦点。研究表明,巨噬细胞参与机体抵御与清除病原体感染,其不同极化状态在控制衣原体感染中的作用已有一定的了解:M1型巨噬细胞可限制衣原体在细胞内增殖,并通过分泌细胞因了增强固有免疫和适应性免疫应答,利于机体快速清除感染;衣原体可在M2型巨噬细胞中正常增殖,并转移感染机体其他器官。因此,诱导适度的M1型巨噬细胞应答有利于机体对衣原体感染的清除。NK细胞可根据细胞因子微环境以及与其他免疫细胞相互作用控制其对巨噬细胞的细胞毒性或正向免疫调节作用,在不同病原体感染中发挥不同的作用。在衣原体肺部感染中,NK细胞是否可调节巨噬细胞,尤其是肺局部巨噬细胞目前尚未见报道。MicroRNAs(miRNAs)是一类介导基因转录后沉默调控基因表达的内源性非编码RNA,已发现多种miRNAs可调控巨噬细胞极化中关键分子的转录,参与巨噬细胞极化的调控。在衣原体感染中,miRNAs是否参与NK细胞诱导的巨噬细胞极化过程尚不清楚。本研究拟探讨在衣原体肺部感染中NK细胞对肺巨噬细胞极化的调节作用及可能机制。采用BALB/c小鼠呼吸道感染模型,注射anti-asialo-GM1抗体特异性清除体内NK细胞。检测各组小鼠肺巨噬细胞极化状态,并进一步分析肺巨噬细胞中相关miRNAs及其靶分子的表达变化。研究方法1.巨噬细胞的纯化与流式分析1.1肺巨噬细胞纯化:BALB/c小鼠鼻吸入感染衣原体,实验分组同第一部分。于感染后第6天处死小鼠,取肺组织用胶原酶XI(10mg/ml)消化,percoll密度梯度离心,制备单个核细胞。采用anti-F4/80磁珠抗体,分离纯化肺巨噬细胞。1.2肺巨噬细胞纯度分析:取5×105个纯化的肺巨噬细胞,采用表面染色,流式细胞术检测分析F4/80+CD11 b+细胞的比例。2.NK细胞对巨噬细胞极化的影响2.1 NK细胞对肺巨噬细胞极化细胞因子表达的影响:磁珠分离纯化同型对照组和NK细胞去除组小鼠肺巨噬细胞(感染后第6天),提取总RNA,实时定量PCR检测TNF-α、IL-6(M1型细胞因子)和IL-10(M2型细胞因子)的mRNA表达。2.2 NK细胞对肺巨噬细胞极化标志分子的影响:取纯化的小鼠肺巨噬细胞,实时定量PCR检测M1型巨噬细胞标志物(iNOS、IRF5)和M2型巨噬细胞标志物(Arg-1、IRF4)mRNA表达;取小鼠左肺下叶,提取肺组织总蛋白,western blot方法检测iNOS、Arg-1、IRF5和IRF4蛋白表达;根据mRNA和蛋白相对表达水平计算iNOS/Arg-1和IRF5/IRF4比值。2.3 NK细胞对肺中M1和M2细胞比例的影响:取小鼠肺组织,制备单个核细胞,细胞内染色后,流式细胞术分析M1(CD45+F4/80+iNOS+)和M2(CD45+F4/80+CD206+)型巨噬细胞的比例。3.NK细胞调节肺巨噬细胞极化机制3.1 NK细胞影响肺巨噬细胞中miR-155和miR-223的表达:实验分组同上,于衣原体感染后第6天处死小鼠,制备肺单个核细胞,磁珠分离纯化肺巨噬细胞,提取小RNA,使用miR-155和miR-223特异性反转录引物将RNA反转录成cDNA,采用实时定量PCR方法检测miR-155和miR-223的表达。3.2 NK细胞对miR-155和miR-223相关靶分子表达的影响:提取肺巨噬细胞总RNA,实时定量PCR检测miR-155的靶分子SOCS1和miR-223的靶分子pknoxl的mRNA表达。研究结果1.衣原体肺部感染中,NK细胞促进肺局部M1,抑制M2型巨噬细胞极化1.1肺巨噬细胞纯度:采用anti-F4/80磁珠分离纯化肺巨噬细胞,流式细胞术分析巨噬细胞纯度。结果显示,磁珠分选后,F4/80+CD11b+巨噬细胞比例为96%以上。1.2衣原体肺部感染中,NK细胞促进肺巨噬细胞产生M1型极化细胞因子,抑制M2型细胞因子的产生:衣原体肺部感染后第六天,实时定量 PCR检测肺巨噬细胞中TNF-α、IL-6(M1型细胞因子)和IL-10(M2型细胞因子)mRNA表达。结果显示,NK细胞去除导致肺巨噬细胞中TNF-α,IL-6表达显着降低,而IL-1 0表达明显升高。1.3衣原体肺部感染中,NK细胞去除导致iNOS/Arg-1和IRF5/IRF4比值降低:采用实时定量PCR和western blot方法检测肺巨噬细胞或肺组织中iNOS、Arg-1、IRF5和IRF4mRNA、蛋白表达。结果显示,衣原体肺部感染中,NK细胞去除导致iNOS和IRF5表达略降低,而Arg-1和IRF4表达显着升高,mRNA、蛋白水平结果一致;分别使用mRNA相对表达和蛋白相对灰度值计算iNOS/Arg-1和IRF5/IRF4比值,结果显示,NK细胞去除导致iNOS/Arg-1和IRF5/IRF4比值显着降低,mRNA与蛋白水平结果一致。1.4衣原体肺部感染中,NK细胞缺失导致肺中M1型巨噬细胞减少,M2型巨噬细胞增加:采用流式细胞术,分析小鼠肺中M1和M2型巨噬细胞比例。结果显示,衣原体肺部感染后第6天,与同型对照组相比NK细胞去除组小鼠肺中M1型细胞(CD45+F4/80+iNOS+)的比例明显降低,而M2型巨噬细胞(CD45+F4/80+CD206+)比例显着增高。证明,在衣原体肺部感染中,NK细胞可通过调节肺巨噬细胞极化(促进M1型极化,抑制M2型极化),发挥免疫保护作用。2.衣原体肺部感染中,miR-155和miR-223参与NK细胞诱导的肺巨噬细胞极化2.1 NK细胞去除鼠肺巨噬细胞中miR-155表达降低,miR-223表达升高:实时定量PCR检测衣原体感染后同型对照组和NK细胞去除组小鼠肺巨噬细胞中miRNAs表达。结果显示,衣原体肺部感染后,NK细胞去除导致小鼠肺巨噬细胞中miR-155表达显着降低,而miR-223表达显着升高,miR-155的表达变化与肺中M1型巨噬细胞比例变化一致,而miR-223的表达变化与M2型巨噬细胞一致。证明,在衣原体肺部感染模型中miR-155和miR-223参与了了肺巨噬细胞极化过程。2.2NK细胞去除鼠肺巨噬细胞中SOCS1表达升高,pknox1表达降低:实时定量PCR检测以上两组小鼠肺巨噬细胞中,miR-155的靶分了 SOCS1和miR-223靶分子pknox1的表达。结果显示,衣原体肺部感染中,NK细胞去除导致SOCS1表达升高,而pknox1表达降低。证明,在衣原体肺部感染模型中,miR-155和miR-223可分别抑制其相应靶分子SOCS1和pknox1的转录,调节肺巨噬细胞极化。以上研究为阐明衣原体感染中NK细胞调控肺巨噬细胞极化的作用及其分子机制提供了实验依据。研究结论与意义1.在衣原体肺部感染中,NK细胞对肺巨噬细胞的极化具有调控作用,促进肺M1型巨噬细胞极化,抑制M2型巨噬细胞极化,发挥其免疫保护作用。2.NK细胞去除导致衣原体感染鼠的肺巨噬细胞中miR-155表达降低(其靶分子SOSC1升高)而miR-223表达升高(其靶分子pknox1降低)。说明,miR-155、miR-223及其靶分子参与了 NK细胞诱导的肺巨噬细胞极化过程。本研究首次揭示了衣原体肺部感染中NK细胞对肺巨噬细胞极化的正向免疫调节作用及可能机制,并发现miR-155、miR-223及其靶分子SOCS1和pknox1参与了肺巨噬细胞极化的调控。为阐明NK细胞和肺巨噬细胞相互间的免疫调节作用提供了新
却天石[10]2016年在《ZEB2通过miR-637靶向Akt1及HMGA1促进胶质瘤细胞生长、侵袭及迁移的分子机制》文中进行了进一步梳理研究背景与目的胶质瘤是中枢神经系统的第一大肿瘤,多年以来的治疗手段都是以扩大切除加合理的放化疗为主。虽然近年来治疗手段不断进步,但是疗效的改善仍旧十分有限。文献报道术后应用替莫唑胺联合放疗的方法,与单独放疗相比患者的中位生存期仅从12.1个月提高到14.6个月,两年生存率从10.4%提高到26.5%。而近几年出现的新型靶向治疗药物,如靶向血管内皮生长因子(VEGF)药物贝伐单抗、抗整合素抑制剂Cilengitide等,对患者的总体预后也无改善。胶质瘤的难治性很重要的一个原因是其恶性程度高,呈现出浸润性生长并与周围脑组织分界不清。肿瘤的高度恶性表现为胶质瘤生长快,浸润性生长主要是胶质瘤细胞具有高侵袭性,能向周边脑组织浸润,从导致手术不能完全切除进而复发。因此,研究胶质瘤的高增殖、高侵袭性是一个重要的方向。E盒结合锌指蛋白2 (Zinc finger E-box Binding homeobox 2,简称ZEB2,又名Smad-Interacting Protein 1,即SIP1)属于锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白家族的成员,包含两个可以与5'-CACCT序列结合的锌指结构簇。故而ZEB2可以通过与5'-CACCT序列结合,从而作为转录因子与下游靶基因的启动子作用,发挥转录抑制功能。许多研究表明ZEB2在肿瘤的发生发展过程中发挥了核心的作用,ZEB2不但可以通过调控Cyclin D1、Rb等基因从而加速肿瘤细胞的增殖,同时也能影响上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)相关蛋白进而增强肿瘤的侵袭和转移能力。但是,ZEB2在胶质瘤中的报道较少,并且在肿瘤中对于ZEB2所参与的信号通路和详细分子机制的研究也较少。2010年Xia等的研究发现,ZEB2在胶质瘤细胞中表达上调,抑制其表达后可以显着抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移。并且,上调的ZEB2可以抑制E-Cadherin表达以及促进Fibronectin和Vimentin的表达。而宋烨等在Xia的结果基础上,采用荧光定量PCR、Western blot和免疫组化的方法证明了ZEB2在胶质瘤组织中的表达较正常脑组织明显上调,且与胶质瘤的恶性程度呈正相关。随后,他们通过瞬时沉默ZEB2在胶质瘤细胞株U25 1、U87的表达而后进行了细胞功能实验。结果表明,干扰胶质瘤细胞中的ZEB2表达后,细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力显着下降,细胞周期G1期向S期转化障碍,以及早期凋亡及晚期凋亡的比例明显增多。进一步的Western blot结果也证实了上述结论。微小INA (microRNA,简称miRNA)是一类内源性非编码RNA,其生物学的主要作用是调控基因转录,而且以负性调控为主。近年来,许多研究发现微小分子非编码RNA(miRNAs)的表达改变与多种癌症的发生和发展密切相关,其中包括胶质瘤。许多miRNA通过靶向调控下游关键分子抑制其转录,从而对肿瘤的增殖、侵袭、迁移以及放化疗抵抗发挥抑制作用。越来越多地实验结果表明,miRNA作为癌症的候选标记物和治疗靶点具有潜在的价值。许多文献报道了ZEB2与部分miRNAs的作用密切相关。同时,ZEB2作为转录因子可以通过结合miRNAs上游启动子区域从而促进或抑制其转录。基于此,我们对干扰ZEB2表达的U251细胞进行了CombiMatrix人类miRNAs芯片检测。在检测到的80多个差异表达miRNAs中,我们采用荧光定量PCR对其中表达差异最明显且上调的miR-637进行了验证。结果显示,干扰ZEB2的表达后,miR-637的表达显着上调。同时,通过NCBI数据库获取miR-637上游启动子区域序列以及将ZEB2结合的启动子5'-CACCT区域与miR-637上游的启动子区域进行比对,我们推测ZEB2作为转录因子可能通过直接结合miR-637的启动子区域进而抑制其转录表达。本文的主要内容是着重探讨了ZEB2在胶质瘤中是否能够通过靶向调控miR-637进而介导了细胞的增殖、侵袭和迁移,而miR-637又是如何进一步对胶质瘤细胞的功能进行调节,以及调控的具体分子机制。这为我们理解胶质瘤的快速增殖和高度侵袭提供了一定的理论基础,也为寻找胶质瘤潜在的治疗靶基因提供了一定的帮助。研究内容与方法1.ZEB2在胶质瘤细胞中功能和机制的进一步研究(1)设计并构建4个稳定干扰ZEB2慢病毒载体并进行细胞转染,运用荧光定量PCR和Western blot检测转染效率,选取干扰效率最高的片段进行后续实验；(2)运用噻唑蓝比色(MTT)实验、Edu实验检测ZEB2对胶质瘤细胞增殖功能的影响,运用平板克隆实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞克隆形成的能力；(3)运用划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验检测稳定干扰ZEB2可以抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移；(4)采用裸鼠皮下成瘤实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞的增殖；(5) Western Blot检测干扰ZEB2后细胞中增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；2.ZEB2通过抑制miR-637转录进而促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移(1)采用miRNAs芯片检测干扰ZEB2表达的U251细胞中表达变化的miRNA,并用荧光定量PCR验证和寻找最有意义的miRNA进行后续研究；生物信息学分析ZEB2可以结合miR-637的启动子区域序列：(2)双荧光素酶报告基因检测ZEB2与miR-637启动子的结合并能抑制其转录；凝胶电泳迁移率实验检测体外条件下ZEB2是否能直接结合miR-637启动子区域；利用染色质免疫共沉淀技术在体内条件下进一步验证ZEB2与miR-637启动子区域的结合；(3)设计并构建miR-637稳定过表达慢病毒载体并用荧光定量PCR进行验证；(4)MTT实验、Edu实验、平板克隆实验和裸鼠皮下成瘤检测miR-637对胶质瘤细胞的增殖能力影响；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637对胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力的影响；(5)MTT实验、Edu实验验证ZEB2通过直接调控miR-637进而促进胶质瘤细胞的增殖；划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证ZEB2通过直接调控miR-637进而促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移；3.MiR-637直接靶向调节Akt1及HMGA1进而影响胶质瘤细胞的功能(1)生物信息学预测Akt1和HMGA1可能为miR-637的直接靶基因,并采用荧光定量PCR和Western blot验证过表达miR-637可以下调Akt1和HMGA1的表达；(2)双荧光素酶报告基因验证miR-637可以靶向结合Akt1和HMGA1的3’-UTR区域进而抑制它们的表达；(3)Edu实验检测miR-637通过靶向Akt1进而抑制胶质瘤细胞的增殖；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637通过靶向Akt1进而抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移；(4)Edu实验检测HMGA1促进胶质瘤细胞的增殖；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证HMGA1促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移；(5)Edu实验检测miR-637通过靶向HMGA1进而抑制胶质瘤细胞的增殖；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637通过靶向HMGA1进而抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移；4.MiR-637靶向Akt1和HMGA1进而调节胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制(1) Western blot检测过表达miR-637后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；(2) Western blot检测瞬时干扰Akt1后以及在过表达miR-637细胞中过表达Akt1后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；(3) Western blot检测干扰HMGA1后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；(4) Western blot检测在过表达miR-637细胞中过表达HMGA1后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；5. ZEB2-miR-637-Aktl/HMGAl信号通路在临床组织标本中的表达和分析(1)荧光定量PCR检测45例胶质瘤样本和15例正常脑组织中ZEB2、miR-637、Aktl和HMGA1的mRNA表达水平；(2) Western blot检测7例胶质瘤组织和7例相对应的瘤旁正常脑组织中ZEB2、和HMGA1的蛋白表达水平；(3)免疫组化检钡ZEB2、Aktl和HMGA1在70例胶质瘤临床石蜡切片和20例正常脑组织石蜡切片中的蛋白表达水平和表达定位：并分析表达高低与临床病理资料之间的关系；(4)原位杂交检测miR-637在70例胶质瘤临床石蜡切片和20例正常脑组织石蜡切片中的表达水平和表达定位；并分析表达高低与临床病理资料之间的关系；(5)统计分析在胶质瘤临床样本中ZEB2与miR-637、miR-637与Akt1以及miR-637与HMGA1之间的表达相关性。结果1.ZEB2在胶质瘤中促进细胞的增殖、侵袭和迁移对4个ZEB2的干扰慢病毒载体进行筛选,结果显示U251中shZEB2的A片段干扰效率最高(19.4%),U87中C片段干扰效率最高(25.0%),故后续实验U251细胞采用A片段、U87采用C片段进行。随后运用噻唑蓝比色(MTT)实验、Edu实验和裸鼠皮下成瘤实验检测ZEB2对胶质瘤细胞增殖功能的影响,平板克隆实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞克隆形成的能力。MTT实验结果显示,与对照Mock组相比,shZEB2细胞组的存活能力随时间推移而减弱(P<0.001)；Edu实验显示干扰ZEB2表达后处于S期的细胞百分比显着降低(P均为0.001)；裸鼠皮下成瘤实验结果表明干扰U87细胞中ZEB2的表达后肿瘤体积和重量较对照组明显减小(P<0.001)；平板克隆实验结果表明干扰ZEB2表达后形成克隆数目明显减少(P均为0.001)。即ZEB2在胶质瘤中促进细胞的增殖和克隆形成能力。进一步运用划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验检测ZEB2对胶质瘤细胞的侵袭和迁移的作用。划痕实验结果表明,shZEB2细胞组的划痕间隙随时间延长而减小(P<0.001)：Transwell和Boyden实验结果显示,与对照组相比,U251和U87干扰组的穿膜细胞数显着减少(P=0.001和0.003,P=0.002和0.001)。即ZEB2可以促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。采用Western blot检测了下调胶质瘤细胞U251和U87中的ZEB2蛋白表达后,与细胞增殖、侵袭和迁移相关蛋白的变化情况。结果显示,干扰U251和U87中ZEB2的表达后,PI3K/Akt通路中的p-PI3K、Akt、p-Akt发生下调,与增殖相关的CCND1下调而p21上调,与侵袭和迁移相关的Vimenti、p-catenin、N-Cadherin下调。而其它蛋白女HMGA1、E2F1、PTEN、Bcl-2、NF-kappaB、Sox2等均有不同程度的上调和下调。2.ZEB2通过抑制miR-637转录进而促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移对干扰ZEB2表达的U251细胞进行了CombiMatrix人类miRNAs芯片检测一共发现到了80多个差异表达miRNAs,其中上调的niRNAs有40多个,下调基因miRNAs有30多个。在差异表达miRNAs中,选取其中表达差异最明显且上调的miR-637并采用荧光定量PCR验证。结果显示,干扰ZEB2的表达后,miR-637的表达显着上调(P=0.02和P=0.005)。随后的双荧光素酶报告基因结果表明,干扰ZEB2可以减少其与miR-637启动子的结合(P=0.002),上调ZEB2可以加强其与miR-637启动子的结合(P=0.004)。凝胶电泳迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)结果显示过表达ZEB2促进其与miR-637启动子的结合。染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)结果表明ZEB2作为转录因子可以直接结合miR-637启动子区域的0-300bp位点。构建稳定过表达miR-637慢病毒载体并转染细胞,荧光定量PCR验证表明miR-637在细胞中被稳定过表达超过400倍和350倍(P均小于0.001)。随后进行细胞功能实验。MTT结果显示较对照组相比,过表达miR-637的细胞存活能力随时间推移而减弱(P<0.001)；Edu实验结果表明过表达miR-637后U251和U87细胞较对照组的S期细胞明显减少(P<0.05)；平板克隆形成实验表明在胶质瘤细胞U251和U87中上调miR-637的表达可以显着抑制细胞克隆形成的能力(P<0.05)；皮下成瘤实验表明过表达组肿瘤的体积和重量较对照组明显较小(1.36±0.32g vs.2.06+0.45g,P<0.05),且Ki-67表达阳性率明显较对照组高(P=0.002); Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验结果均表明,过表达miR-637后抑制U251和U87的穿膜,而在过表达miR-637的细胞中加入miR-637抑制剂后穿膜细胞数显着回升(P均小于0.05)。以上结果说明miR-637在胶质瘤中促进细胞的增殖、侵袭和迁移。进一步在稳定过表达ZEB2 (ZEB2 OE)的细胞中瞬时转染miR-637 mimics后采用MTT、Edu、Transwell、Boyden和划痕实验来检测细胞功能的变化。MTT的实验结果显示与对照ZEB2 OE组相比,ZEB2 OE+miR-637 OE细胞组的存活能力随时间推移而减弱(P<0.001)；而Edu实验表明在ZEB2过表达的细胞中上调miR-637后,U251和U87处于S期细胞明显减少(P<0.05)；Transwell小室体外迁移实验和Boyden小室体外侵袭实验的结果说明在过表达ZEB2的U251和U87中过表达miR-637后,U251和U87的穿膜细胞数明显减少(P均小于0.05)。即说明miR-637对ZEB2促细胞增殖、侵袭和迁移的能力有拮抗作用3.MiR-637直接靶向调节Aktl及HMGA1进而影响胶质瘤细胞的功能在3个miRNA靶基因预测网站上对miR-637可能的靶基因进行了预测,同时结合miR-637的Western blot结果,选取了Akt1和HMGA1这两个可能的靶基因。荧光定量PCR和Western blot结果表明,在胶质瘤细胞U251和U87中过表达miR-637促进Akt 1和HMGA1的表达下调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,在存在靶基因3’-UTR区域的组中加入miR-637 mimics可以抑制载体荧光的表达,而加入inhibitors促进荧光强度上升。同时,突变靶基因的3’-UTR区域使得荧光强度不发生改变。即miR-637可以特异性结合靶基因Akt1和HMGA1的3’-UTR区域,通过抑制mRNA的表达从而对它们负性调控。随后采用Edu实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637可以通过影响Akt1进而调控胶质瘤细胞的功能。Edu实验表明过表达miR-637和瞬时干扰Akt1所产生的作用相同,均使得S期细胞较少；而在过表达miR-637的细胞中加入过表达Akt1质粒,可以逆转过表达miR-637引起的S期细胞减少(P<0.05)。而Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验显示,过表达miR-637和瞬时干扰Aktl所产生的作用相同,均使得穿膜细胞数减少；而在过表达miR-637的细胞中加入过表达Akt1质粒,可以逆转过表达miR-637引起的穿膜细胞数减少。以上结果表明,miR-637可以通过结合Akt1的3’-UTR区域抑制其表达,进而抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。采用细胞功能实验对HMGA1在胶质瘤中的功能进行了鉴定。Edu实验表明,干扰细胞HMGA1的表达后S期细胞数百分比显着降低(P< 0.001); Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验表明,沉默U251细胞的HMGA1表达可以使穿膜细胞数显着降低(P=0.004和0.007,P=0.004和P=0.011)。之后细胞功能实验验证miR-637可以通过影响HMGA1进而调控胶质瘤细胞的功能。Edu实验、均表明,在过表达miR-637的U251中加入过表达HMGA1质粒,可以逆转过表达miR-637引起的S期细胞减少,4.MiR-637靶向Aktl和HMGA1进而调节胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制首先对过表达miR-637的细胞采用Western blot检测下游增殖相关蛋白、EMT相关蛋白等指标。结果表明,对miR-637进行过表达后细胞中PI3K/Akt信号通路的关键蛋白Akt1、磷酸化Akt (p-Akt)和磷酸化PI3K (p-PI3K)显着下调,Wnt通路的关键蛋白P-catenin也显着下调。同时,Foxol上调,而磷酸化Foxol (p-Foxol)下调。而且,与EMT相关的N-Cadherin无变化,及细胞周期相关的Cyclin D1、Cyclin E1、p15下调,而p27/Kip、p21上调。此外,hTERT上调,NF-kappaB下调。随后在稳定过表达miR-637的U251和U87细胞中加入过表达Akt1的质粒载体以及相应的对照空白质粒,与NC细胞、Lv-miR-637细胞、瞬时干扰Akt1细胞(siAkt1)共同进行Western blot检测。结果发现,瞬时干扰Akt1的表达,使得p-Akt1、β-catenin、p-Foxol和Cyclin D1的表达显着下调,而Foxol的表达上调。并且,在稳定过表达miR-637的细胞中过表达Akt1,可以使p-Akt1、 β-catenin、p-Foxol和Cyclin D1的表达明显回复,Foxol的表达明显下降。其次,运用Western blot对瞬时干扰HMGA1的细胞进行了EMT、细胞周期相关蛋白及信号通路的检测。干扰HMGA1的表达后,HMGA1蛋白水平下降明显,Akt和p-Akt以及p-P13K蛋白有下调。同时,间充质标志物N-Cadherin、β-catenin、 Vimentin显着下调。而细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1下调,但p15、p16、 CDK6上调。此外,c-Myc和NF-kappaB基因也显着下调。随后在稳定过表达miR-637的细胞中加入过表达HMGA1的质粒载体,与LEV细胞、Lv-miR-637细胞共同进行Western blot检测。结果可知,在过表达miR-637的细胞中回复HMGA1的表达可以使得Cyclin D1、β-catenin、NF-kappaB和Vimentin的表达回升,而p15表达水平则下降。5. ZEB2-miR-637-Aktl/HMGAl信号通路在临床组织标本中的表达和分析荧光定量PCR检测45例新鲜胶质瘤组织标本和15例正常脑组织中ZEB2、miR-637、Akt1和HMGA1的mRNA表达水平。结果显示,与正常脑组织相比,胶质瘤组织样本中ZEB2、Akt1、HMGA1的mRNA表达水平均上调(P<0.001)而miR-637表达水平显着下调(P<0.001)。而Western blot检测了7例胶质瘤组织和与其相对应的7例肿瘤旁正常脑组织中ZEB2和HMGA1的蛋白表达,结果显示,较对应的瘤旁正常脑组织相比,胶质瘤组织中ZEB2和HMGA1的蛋白水平均明显较高。随后,运用免疫组化和原位杂交检测ZEB2、iR-637、Akt1和HMGA1在70例胶质瘤石蜡切片和20例正常脑组织石蜡切片中的表达定位和表达水平。结果显示,在正常脑组织中,ZEB2的表达主要位于细胞核,少部分见于胞浆；Akt1在细胞核和细胞浆均有表达；HMGA1主要位于细胞核中,细胞浆有表达但相对较少。同时,叁者在胶质瘤组织中均为细胞核和细胞浆同时表达,且表达量明显较正常脑组织高。而miR-637在正常脑组织中主要表达于细胞浆中,核内罕见,在胶质瘤组织中表达于细胞浆和细胞核,且胶质瘤组织中miR-637的表达显着下调。此外,统计分析发现性别、年龄(≤≥50和<50)、组织类型与ZEB2、miR-637、Akt1和HMGA1的表达均无明显关系,而与WHO分级存在显着相关性(ZEB2、Akt1、HMGA1为正相关,miR-637为负相关)。最后对ZEB2、miR-637、Akt1和HMGA1之间表达相关性进行了分析。结果表明,ZEB2和miR-637之间存在负相关关系(r=-0.358,P=0.002), miR-637与Aktl之间存在负相关关系(r=-0.345, P=0.003), miR-637与HMGA1之间存在负相关关系(r=-0.399,P=0.001)。结论ZEB2作为转录因子可以与miR-637上游启动子区域的位点结合并抑制其转录,进而减少miR-637与Akt1和HMGA1的3’-UTR区域靶向结合,从而分别通过上调CyclinD1和p-Foxo1并下调Foxo1.以及上调Cyclin D1并抑制p15来促进细胞周期的进展。同时,又分别通过上调p-Akt1、β-catenin以及上调β-catenin、 NF-kappaB和Vimentin的表达来促进细胞的侵袭和迁移。最后,ZEB2、Akt1和HMGA1在胶质瘤临床样本中高表达,且与WHO分级呈正相关；而miR-637在胶质瘤临床样本中低表达且与WHO分级呈负相关。同时,ZEB2与miR-637的表达以及miR-637与Akt1、HMGA1的表达相互之间均呈负相关。
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