黄志惠 吴玉霞 马西虎 费飞
（新疆医科大学附属中医医院 830011）
[摘要] 目的：观察苦参碱对体外培养多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖和凋亡的影响，并对其机制进行探讨。方法：体外培养RPMI8226细胞，使用不同浓度的苦参碱作用24h、48h，采用MTI比色法检测细胞增殖的抑制作用，流式细胞仪测定细胞凋亡的影响。RT-PCR方法检测环氧合酶-2（COX-2）mRNA的表达水平;Western blotting方法检测COX-2蛋白的表达水平。结果：苦参碱抑制RPMI8226细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用呈明显的浓度和时间依赖性，苦参碱可引起RPMI8226细胞Cox-2 基因mRNA和蛋白表达减低。结论：苦参碱能有效抑制PMI8226细胞增殖，并诱导细胞凋亡，Cox-2基因表达减低可能是其机制之一。
[关键词] 苦参碱； 多发性骨髓瘤； 细胞增殖； 细胞凋亡；cox-2
Effects of matrine on the Proliferation and Apoptosis of myeloma Cells
Huang Zhi-hui ,Wu Yu-xia,Ma Xi-hu, Fei Fei
(Affiliate Traditional Chinese Medicine Hospital， Xingjiang Medical University ，Ulumuqi，830011，China)
[Abstract] Objective: To investigate the effects of matrine on the proliferation and apoptosis of RPMI8226 cells in vitro．Methods: RPMI8226 cells were cultured in vitro, using different concentrations of matrine.The effect of matrine in different concentration on the proliferation of RPMI8226 cells was detected by MTT assay;The effect of matrine on the apoptotic rate of RPMI8226 cells was detected by flow cytometry;cyclooxygenase -2 (COX-2) mRNA expression was detected by RT-PCR; the expression level of COX-2 protein was detected by Western blotting. Results: Matrine inhibits proliferation and induces apoptosis of RPMI8226 cells were obviously a time and concentration dependent, matrine can induce RPMI8226 cell Cox-2 gene mRNA and protein expression decreased. Conclusion: matrine can inhibit the proliferation of RPMI8226 cells, and induce cell apoptosis, the The downregulation of expression of Cox-2 gene might be one of the mechanisms.
[Key Words] matrine； myeloma； Cell proliferation； Cell apoptosis； Cox-2
多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞病，大多患者年龄>40岁，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞。其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链（M蛋白）过度生成，极少数患者可以是不产生M蛋白的未分泌型MM。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。由于正常免疫球蛋白的生成受抑，因此容易出现各种细菌性感染。由于多发性骨髓瘤好发于40岁以上的成年人，多数不能耐受标准剂量的化疗和完成骨髓移植，故患者的5年生存率极低，但发病率却越来越高，近年越来越引起人们的重视。目前，国外主要的治疗方法是硼替佐米、来那度胺等新药的应用和骨髓移植[1]。但因新药价格昂贵，多数患者无法应用。患者发病时一般年龄较大，体质较差，且不易找到合适供者，骨髓移植也无法广泛开展。因此，探讨新的方法和药物对防治多发性骨髓瘤、提高其生存率具有重要的意义。其中，如何发挥我国传统医学的优势，筛选具有抗肿瘤作用的天然药物用于开展多发性骨髓瘤的化学预防，已逐渐受到医学界的重视[2]。
近年来天然药物在抗骨髓瘤方面的研究广泛开展，有研究发现苦参等多种天然药物对多发性骨髓瘤有一定的抗瘤作用。本研究采用多发性骨髓瘤RPMI8226细胞作为细胞模型，观察苦参碱对RPMI8226细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用，旨在为多发性骨髓瘤的治疗提供新的理论和实验依据。
1 材料与方法
1．1 主要材料和试剂
人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226购自华中科技大学同济医学院血液病研究所；苦参碱由成都中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定苦参后，由药物化学教研室提取所得，其纯度为85．63％ ；二甲亚砜(DMSO)购自Sigma公司；RPMI 1640培养基、胰蛋白酶购自Gibco公司；四甲基噻唑氮蓝购自珠海丽宝公司；10％新生小牛血清购自杭州四季青公司；Annexin V—FITC试剂盒为美国C0uLTER产品。
1．2 方法
1．2．1 细胞培养RPMI8226细胞贴壁培养于RPMI 1640培养液(含10％ 新生牛血清)，置37℃、5％CO2的培养箱中培养。
1．2．2 MTT比色法取培养4～5 d的对数生长期细胞用V—T(含2．O g／L胰酶和O．5 mmol／LEDTA)消化后，配成4×108／L的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液50 L，培养24 h后弃培养液，分别加入苦参碱(终浓度分别为250、500、1000和1500 mg／L，每个浓度重复5孔，独立重复3次，以不加药物组为阴性对照组，以无细胞组为空白对照组)，分别于24 h、48 h后每孔加入MTT(5 g／mL)l0 L，培养4 h后每孔加入DMSO 100 uL终止反应，37℃振荡30min，使结晶溶解后，用酶标仪检测各孔570 nm波长的吸光度(A)值。肿瘤细胞生长抑制率(％)的计算：肿瘤细胞生长抑制率(％)=[(对照组A值一用药组A值)／对照组A值]×100％。
1．2．3 流式细胞术检测 将5×108／L RPMI8226细胞在培养瓶中培养3 d后弃培养液，分别加入苦参碱(终浓度分别为250、500、1000和1500 mg／L)，同时设不加药物的阴性对照组，分别于24 h、48 h后收集细胞，用冷PBS洗涤细胞(4℃下离心，500 g，5 min)，去除上清后按Annexin V—FITC试剂盒操作；用冷的连接缓冲液调整细胞数目为l05～106／mL，在此细胞悬液中加入Annexin V(一种磷脂结合蛋白质)和PI(碘化丙啶)，1 h内用流式细胞仪(COULTER，美国)检测细胞的凋亡。
1．2.4 RT - PCR 方法检测 COX - 2 mRNA
分别收集经苦参碱1500 mg／L作用后 48 h 的RPMI8226 的各组细胞及对照组细胞。用 Trizol 法提取各组总 RNA， 然后利用 RT - PCR 试剂盒进行逆转录反应生成 cDNA， 并取一定量 cDNA 加入目的基因引物片段进行 PCR 反应生成目的 DNA 基因复制产物， 从而半定量测定目的基因 mRNA 的表达，未反应 cDNA 保存于 － 20 ℃。本实验 PCR 体系总体积为 25 μl， 反应条件:94 ℃ 预变性 2 min;94 ℃ 变性30 s， 退火 30 s(内参 GAPDH 退火温度为 53 ℃，COX - 2 基因退火温度为55 ℃)， 72 ℃延伸1 min， 30个循环;72 ℃ 延伸 7 min。以COX - 2/GAPDH DNA 光密度比值作为各组实验资料;每组实验重复 3 次， 取均值。
1．2.5 Western blotting 法检测细胞COX - 2 蛋白的表达
分别收集经苦参碱1500 mg／L作用后 48 h 的RPMI8226 的各组细胞及对照组细胞后提取蛋白质， BCA 法(BCA 试剂盒购自碧云天公司)测定蛋白质含量。等量蛋白质采用十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺(SDS - PAGE)进行分离， 然后转至 PVDF膜上， 室温下摇动封闭 4 h 后加入鼠抗人 COX - 2抗体， 在 4 ℃过夜， 室温下洗膜后加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠 IgG 抗体， 室温孵育 1 h;洗去未结合的二抗， 加新鲜配置的显色液， 避光显色 20 min 后终止反应。COX - 2 蛋白条带的灰度值除以 β - actin 内参校正;每组实验重复 3 次， 取均值。
1．2．6 统计学分析采用SPSS 19．0进行数据处理，实验数据用x±S表示，组间差异采用t检验，P<0．05为差异有统计学意义。
2 结果
2．1 苦参碱对RPMI8226细胞的增殖抑制作用
结果表明，24 h后，250 mg／L的苦参碱对细胞无明显抑制作用(P>0．05)；浓度为500 mg／L、1000 mg／L、1500mg／L时，可对细胞增殖产生抑制作用，其差异具有统计学意义(P<0．05)；1500 mg／L的苦参碱对RPMI8226细胞的增殖抑制作用更为明显。48 h后，500 mg／L、1000 mg／L、1500mg／L的苦参碱作用于RPMI8226细胞与对照组比较差异有统计学意义(P<0．05)，且抑制作用随苦参碱浓度的递增而增强，表明苦参碱的作用可能具有剂量依赖性。500mg／L、1000 mg／L、1500mg／L的苦参碱作用于RPMI8226细胞不同时间的差异均具有统计学意义(P<0．05)。可见，苦参碱对RPMI8226细胞增殖抑制作用可能具有时间依赖性。具体结果见表1。
2．4 Western blotting 法检测细胞COX-2 蛋白的表达
苦参碱1500 mg／L与对照组作用48 h 后，COX - 2 蛋白与内参的比值为 (52.30±2.05)%和(85.57±1.86)%，P=0.003。
3 讨论
近年来多发性骨髓瘤的治疗取得了较大的进展， 沙立度胺、来那度胺和硼替佐米等新药的应用、大剂量化疗加造血干细胞移植等均可提高多发性骨髓瘤患者的缓解率及延长生存期， 但多发性骨髓瘤仍属不可治愈的疾病。因新药价格昂贵，多数患者无法应用。患者发病时一般年龄较大，体质较差，且不易找到合适供者，骨髓移植也无法广泛开展。因此，探讨新的方法和药物对防治多发性骨髓瘤、提高其生存率具有重要的意义。其中，如何发挥我国传统医学的优势，筛选具有抗肿瘤作用的天然药物用于开展多发性骨髓瘤的防治，已逐渐受到医学界的重视。
苦参是传统中药,在中药方剂中广泛应用于临床各科。在血液系统肿瘤的抗肿瘤方剂中也应用广泛。苦参碱是主要的药理成分。现代药理研究表明,苦参碱在抗病毒、抗炎、免疫调节、保肝、抗肿瘤、中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统等方面具有广泛的药理作用[3]。近年来苦参碱的抗肿瘤活性引起了学者的极大关注,已有研究表明苦参碱在体内外均具有抗肿瘤作用。
我们的实验通过不同浓度、不同作用时间的苦参碱作用于RPMI8226细胞，对苦参碱治疗多发性骨髓瘤的有效性和可能的机制做了探讨。
本体外实验研究证实，苦参碱可以有效抑制骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞增殖，且苦参碱的抑制作用有时间和剂量依赖性。在苦参碱（1500 mg/L）作用48小时时，RPMI8226细胞增殖达到最大抑制，凋亡率最高。后续实验以最佳浓度1500 mg/L对其可能机制进行探讨。
近年来的研究发现许多癌前病变和恶性肿瘤有COX-2 的过度表达， COX-2同时具有环氧化物酶和过氧化物酶两种酶的活性，在肿瘤细胞的恶性进程中对细胞周期、 细胞凋亡、 肿瘤血管形成以及肿瘤的浸润、转移等均存在一定的关联性。Marco、Cetin、包红雨等研究表明，在多发性骨髓瘤细胞中存在COX-2表达，且其表达水平可作为判断其预后的重要因素； [4,5,6]。Fujita研究表明抑制COX-2表达是沙利度胺有效治疗多发性骨髓瘤的机制之一[7]。
本研究通过苦参碱作用于RPMI8226细胞48小时，观察COX-2 mRNA和蛋白水平的变化，对苦参碱的作用机制做初步的探讨。实验结果表明，苦参碱可在mRNA和蛋白水平抑制COX-2表达，进而导致骨髓瘤细胞的增殖受抑和凋亡增加。
因中药本身具有抗癌作用或者可以通过调节机体免疫功能等协同化疗药物杀死肿瘤细胞， 且中药又具有来源广泛、 价格低廉、 毒副作用小等特点，后续我们可选用中西药联合作用，使单药的剂量减小， 在获得更好的治疗效果的同时减少毒副反应。
本研究结果表明，苦参碱在体外对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226细胞具有一定的抑制作用，表现为抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡。下调COX-2 RNA和蛋白水平表达，可能是其机制之一。
[参考文献]
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[2]王伟涛。 多发性骨髓瘤的中医药研究概述[J]。浙江中医药大学学报,2012,06:745-746。
[3]陈晓峡,向小庆,叶红。 苦参碱及氧化苦参碱抗肿瘤作用的研究进展[J]。中国实验方剂学杂志,2013,11:361-364。
[4] Marco Ladetto, Sonia Vallet, Andreas Trojan,et al.Cyclooxygenase-2 (COX-2) is frequently expressed in multiple myeloma and is an independent predictor of poor outcome.Ｂｌｏｏｄ,2005，15;105:4784-4791.
[5] Cetin M1, Buyukberber S, Demir M,et al. Overexpression of cyclooxygenase-2 in multiple myeloma: association with reduced survival. Am J Hematol, 2005，80(3):169-173.
[6]包红雨,朱明清,江淼等。 VEGF与COX-2在多发性骨髓瘤病人中的表达及意义[J]。 中国实验血液学杂志,2009,01:99-101。
[7]Fujita J, Mestre JR, Zeldis JB,et al. Thalidomide and Its Analogues Inhibit Lipopolysaccharide-mediated Induction of Cyclooxygenase-2.Clin Cancer Res， 2001,7(11):3349-3355.
论文作者:黄志惠 吴玉霞 马西虎,费飞
论文发表刊物:《医师在线》2015年10月第20期供稿
论文发表时间:2016/1/11
标签：细胞论文; 苦参碱论文; 作用论文; 抑制论文; 多发性骨髓瘤论文; 蛋白论文; 浓度论文; 《医师在线》2015年10月第20期供稿论文;