1黑龙江中医药大学佳木斯学院154007
2黑龙江中医药大学附属第二医院150009
[摘要] 目的：观察不同质量浓度的当归多糖对人黑素瘤A375细胞黑素合成及抗氧化损伤的作用。方法：以终浓度为1.0mmol/L H2O2作用于人黑素瘤A375细胞，制备氧化损伤模型。并以当归多糖进行干预，采用MTT法测细胞活力，并测定黑素含量、TYR活性及氧化应激相关指标。结果：不同浓度的当归多糖处理后，其细胞活力、黑素含量、TYR活性、T-AOC和SOD活性均有所增加，MDA含量和 NOS活性逐渐降低，以10ug/mL和20ug/mL效果好。结论：当归多糖对人黑素瘤A375细胞的氧化应激损伤具有保护作用，可能从抗氧化应激角度对白癜风患者发挥一定的治疗作用。
[关键词]:当归多糖；人黑素瘤A375细胞；白癜风
1实验材料
1.1仪器
倒置显微镜（CKX41-A32PH，日本Olympus），全自动酶标仪（680，美国BIO-RAD），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司），超净工作台（SW-CJ-1F，苏州工业园区三兴净化科技有限公司），CO2培养箱（MCO-20AIC，日本三洋公司）
1.2试剂与药物
当归多糖（CY130421，陕西慈缘生物技术有限公司，纯度≥95%），T-AOC、SOD、MDA、NOS检测试剂盒（南京建成科技有限公司），MTT（美国sigma公司），DMEM培养基（GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青公司），H2O2等其他试剂均为国产分析纯。
1.3 细胞株：人黑素瘤A375细胞购自中科院上海生物细胞研究所
1.4方法
1.4.1细胞培养
将人黑素瘤细胞A375放入含10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的DMEM培养液中，并静置于37℃、5% CO2培养箱中常规培养，2天换液一次，取对数生长期的细胞用于实验。
1.4.2细胞氧化损伤模型的制备
取对数生长期的A375细胞用于实验，用0.25% 胰蛋白酶消化，收集细胞，以DMEM培养液调整细胞浓度,再置于CO2培养箱中继续培养，24 h后取出，分别加入终浓度为1.0mmol/L H2O2，为下一步实验做准备。
1.4.3分组及给药
分为6组：正常组、模型组和当归多糖不同浓度组。模型组给予终浓度为1.0mmol/L H2O2；当归多糖组先给予终浓度为1.0mmol/L H2O2，再分别加入终浓度为10、20、40、80ug/mL当归多糖；正常组给予相同体积的DMEM培养液。
1.4.4MTT法测细胞活力
将A375细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1.5×104个/ml,接种到96孔板内，每孔200ul,置于CO2培养箱中继续培养24 h后，弃掉培养液，各组给予相应的药物处理，继续培养48h，每孔再加入5g/L MTT20ul,继续培养4 h后，去掉培养液，每孔加入DMSO150 ul,缓慢震荡10min，放置酶标仪上在490nm处测吸光值，以A代表细胞活力。每组设8个复孔，测定3次，取其平均值。
1.4.5黑素含量
将细胞密度为1.5×104个/ml的A375细胞悬液接种到24孔板内，每孔1ml,置于CO2培养箱中继续培养24h后，弃掉培养液，各组分别给予相应的药物处理，各组溶液均为每孔1ml,继续培养48h，去掉培养液，用PBS缓冲液漂洗1次，再用0.25%胰酶消化，收集各孔细胞到离心管中，1500rpm离心3min，去掉上清液，向沉淀加入1mol/LNaOH 100 ul, 37℃放置1h，每孔再加入400 ul双蒸水将NaOH稀释为0.2mol/L，轻微震荡混匀后分别取200ul加入96孔板中，应用酶标仪在490nm处测A，A表示黑素含量。每组设4个复孔，测定3次，取其平均值。
1.4.6酪氨酸酶活性
将A375细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1.5×104个/ml,接种到96孔板内，每孔200ul,置于CO2培养箱中继续培养24h后，弃掉培养液，各组给予相应的药物处理，继续培养48h后，每孔需加入1%Trion X-100溶液100ul，于-80℃放置30min，室温缓慢溶解，每孔再加入0.2%左旋多巴溶液50ul，37℃放置1h，应用酶标仪在490nm处测A，A表示TYR活性。每组设4个复孔，测定3次，取平均值。
1.4.7氧化应激相关酶的测定
将细胞密度为1.5×104个/ml的A375细胞悬液接种到24孔板内，每孔1.5ml,置于CO2培养箱中继续培养24h后，弃掉培养液，各组分别给予相应的药物处理，各组溶液均为每孔1.5ml,继续培养48h，收集各孔培养液，用于T-AOC、SOD、MDA、NOS的测定，具体按试剂盒操作说明进行。
1.5 统计学处理
采用统计学分析软件SPSS17.0处理，所有数据均采用均数±标准差（±s）表示，应用t检验进行显著性分析。
2 结果
2.1当归多糖对A375细胞活力、黑素含量和TYR活性的影响
模型组经 H2O2处理后，细胞活力、黑素含量和TYR活性均明显比空白组降低，有显著性差异（P<0.01）。与模型组比较，受到氧化损伤的A375细胞给予不同浓度的当归多糖处理后，其细胞活力、黑素含量和TYR活性均有增加，以终浓度为10ug/mL 和20ug/mL 效果好，有统计学差异,见表1。
2.2当归多糖对A375细胞氧化应激相关酶的影响
模型组经 H2O2处理后，与空白组比较，T-AOC和SOD活性均明显降低，MDA含量和NOS活性明显增加，有显著性差异（P<0.01），说明造模成功。与模型组比较，受到氧化损伤的A375细胞给予不同浓度的当归多糖处理后，T-AOC和SOD活性均有所增加，MDA含量和 NOS活性逐渐降低，其中以终浓度为10ug/mL和20ug/mL效果好，有统计学差异。
3讨论
当归多糖具有抗氧化、提高机体免疫功能、抗肿瘤等药理活性[1]。本研究表明：不同浓度的当归多糖处理后，其细胞活力、黑素含量、TYR活性、T-AOC和SOD活性均有所增加，MDA含量和 NOS活性逐渐降低，其中以10ug/mL 和20ug/mL 效果好。说明当归多糖对人黑素瘤A375细胞的氧化应激损伤具有保护作用，进而增强细胞活力和TYR活性，促进黑素合成。因此，本课题组推测当归多糖可能从抗氧化应激角度对白癜风患者发挥一定的治疗作用，至于能否从其它途径发挥作用还需进一步研究。
参考文献:
1.温悦,傅正毅,赖艳.当归多糖的药理作用研究进展[J].中国医药导报,2012,9(30):27-29.
论文作者:段剑飞1，王景2，安丽凤1﹡，黄敬文1，鲁光宝1，刘海洲1,
论文发表刊物:《徐州医学院学报》2015年11月第35卷总第21期
论文发表时间:2016/4/28
标签：细胞论文; 多糖论文; 当归论文; 活性论文; 培养液论文; 浓度论文; 黑素论文; 《徐州医学院学报》2015年11月第35卷总第21期论文;