（1广东药学院中药学院 广东 广州 510006）
（2广东药学院生命科学与生物制药学院 广东省生物技术候选药物研究重点实验室 广东 广州 510006）
【摘要】 目的：以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记，对1种产自贵州安顺的华钩藤植物进行遗传分析与分子鉴定。方法：通过改良CTAB法提取样品总DNA，利用通用引物对rDNA ITS序列进行PCR扩增，经克隆、测序后，运用Clustal X、BioEdit和PAUP等软件进行序列分析和构建系统发育树。结果：测序得到样品的rDNA ITS区序列长度为719bp，序列分析结果显示其与Genbank中已有的华钩藤[Uncaria sinensi(Oliv.)Havil.] rDNA ITS区序列之间相似性达99.8%，并且在系统发育树中并排聚类成1支。结论：基于rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法，能够对华钩藤植物进行准确的分子鉴定，为钩藤属中药材的种类鉴定和种间分类提供分子生物学理论依据。
【关键词】 华钩藤；ITS序列；分子鉴定
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）08-0098-03
Molecular identification of one Guizhou
Uncaria sinensis(Oliv.)Havil.
Zhou Zixiong1, Du Guifeng2, Feng Bingfang2 XIie Gunting2, Zhu Shuang2*
(1.School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou510006,China；2. Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidates, School of Biosciences and Biopharmaceutics, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou510006,China)
【Abstract】Objective:To characterize the phylogenetic relationship of one Guizhou Uncaria sinensis(Oliv.)Havil,molecular identification and genetic analysis were carried out using the rDNA ITS sequence as molecular marker. Methods:Molecular identification and genetic analysis were carried out with the rDNA ITS sequence as molecular marker.Total DNA was extracted with modified CTAB Method:and there by rDNA ITS regions were amplified with primers ITS4/ITS5, sequenced and phylogenetic analysed with Clustal X, BioEdit and PAUP. Results:The entire rDNA ITS sequence of Uncaria was 719bp.Sequence analysis showed that the rDNA ITS sequence was closely related to Uncaria sinensis(Oliv. ) Havil available in GenBank and the similarity reached 99.8%. Conclusion Based on molecular biology Methods:of rDNA ITS region analysis, molecular identification is useful inaccurate classification on Uncaria sinensis(Oliv.)Havil.,which provides molecular evidence of taxonomy and identification of different species in genus Uncaria.
【Keywords】 Uncaria sinensis；ITS Sequence；Molecular identification
钩藤为茜草科钩藤属植物，别名又叫大钩丁、双钩藤，主产于广西、贵州、湖南、广东等地[1]。2010年版《中国药典》规定钩藤药材来源为茜草科植物钩藤Uncaria rhynchophylla(Miq.) Jack.、大叶钩藤Uncariamacrophylla Wall.、华钩藤Uncaria sinensis(Oliv.)Havil.、毛钩藤Uncaria hirsute havil.和无柄果钩藤Uncaria sessilifructus Roxb.5种[2]。钩藤的主要有效成分是生物碱，其中以钩藤碱与异钩藤碱为主，具有降血压、镇静、抗血小板聚集和抗血栓形成的作用[3]，不同种钩藤的药效成分有明显的差别[4]。贵州具有丰富的钩藤中草药资源，但是随着需求量的增加，钩藤资源也面临着减少、甚至枯竭的危险。目前基于植物分子系统学调查钩藤资源和种类鉴定等方面的基础工作很少[5-7]，不利于钩藤资源的保护。
本研究采用分子生物学技术，对1种产自贵州安顺的华钩藤植物，并且据形态特征初步鉴定为华钩藤的植物中药材的rDNA ITS区序列进行序列测定并构建其系统发育树，并与GenBank中已有茜草科钩藤属中药材rDNA ITS区序列进行比对分析，将该钩藤样品归类到种，从遗传本质上对该钩藤的分类和种间关系提供分子学依据。
1.材料、试剂与仪器
1.1 材料
实验用的华钩藤于2011年11月采集于贵州安顺，由广东药学院曾常青教授鉴定。该植物嫩枝较纤细，方柱形或有4棱角，无毛，茎枝呈方柱形，节上有时有全缘的托叶宿存，钩端渐尖向内卷，基部扁阔，表面黄绿色或黄棕色，折断面外层黄棕色，叶薄纸质，椭圆形。将采集到的新鲜叶片直接放入含有硅胶的密封袋中快速干燥，备用。
1.2 试剂与仪器
TaqDNA聚合酶、10×Taq缓冲液、dNTP、pMD18-T-Vecter[TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司]，PCR扩增引物合成(上海生工生物工程有限公司)，琼脂糖(BIOWEST)，Applied Biosystems PCR仪(2720 Thermal cycler PCR，美国ABI公司)，Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能公司)，JY600C电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)。
2.方法
2.1 钩藤样品总DNA提取
采用改良CTAB法[8]提取钩藤样品总DNA：在预冷的灭菌研钵中，将0.5g干叶片在液氮中研磨至粉末状。每1g样品加入65℃预热的CTAB裂解液[4%(质量分数)CTAB、100mmol·L-1、Tris-HCl、25mmol·L-1EDTA、1.4mol·L-1NaCl、2%(质量分数)β-巯基乙醇、1%(质量分数)PVP，pH8.0]5mL，充分混匀后按每1mL混合液分装到1.5mL离心管中，并于65℃温育2h，期间每隔15～20min颠倒振荡1次。上述混合液于4℃、12000 r·min-1离心5min，吸取上清液，用等体积的Tris饱和酚抽提2次，酚-三氯甲烷-异戊醇(体积比25：24：1)和三氯甲烷-异戊醇(体积比24：1)各抽提1次。重复以上操作直至两相分层处无明显杂质。然后于4℃、12000 r·min-1离心5 min，取上清液，加入NaAc(pH5.2)，使溶液终浓度达到0.3mol·L-1，再加入0.8倍体积的异丙醇，于-20℃沉淀1h，吸出DNA至1.5mL离心管中，分别加入70%(体积分数)冷乙醇1mL洗涤2次，无水乙醇洗涤1次，风干后溶于50μL无菌1×TE缓冲液中，-20℃保存，备用。
2.2 PCR扩增
选择扩增植物rDNA ITS序列的通用引物[9-10]ITS5(5'GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGG3')和ITS4(5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3')对样品总DNA进行rDNA ITS序列的扩增。在20μL的PCR反应体系中含有10×PCR buffer (2.5 mmol·L-1，含MgCl2)2μL，dNTP(10mmol·L-1)0.4μL，引物量为10pmol，rTaq(5U·μL-1)0.25μL，加入约50ng的模板DNA，其余体积以无菌超纯水补足。
PCR扩增反应过程为：95℃预变性3 min，94℃变性1min，52℃退火50s，72℃延伸50s，循环35次，最后在72℃延伸10min。
2.3 PCR产物纯化、连接和转化
样品rDNA ITS序列的PCR扩增产物(大约720bp)在紫外灯下从1%(质量分数)的琼脂凝胶进行割胶并采用DNA凝胶回收试剂盒回收。纯化后与pMD18-T-Vecter连接，连接产物转化Escherichia coli DH5-α感受态细胞，并进行氨苄青霉素抗性和蓝白斑筛选。
2.4 测序及序列分析
挑取重组单克隆摇菌后送华大基因科技股份有限公司测序，序列与GenBank中已有的ITS区序列进行比较分析。其中序列之间的比较分析通过Clustal X(版本1.8)比对和BioEdit计算。应用PAUP软件(版本4.0 b10)，使用最大简约法计算及构建系统进化树，用Bootstrap值检验系统树上各节点的置信水平，使用TREEVIEW进行查看。
3.结果与讨论
3.1 钩藤样品总DNA提取
取钩藤样品总DNA 2μL，用SYBR Green I 染色10min后进行1%(质量分数，下同)琼脂糖凝胶电泳，Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统记录结果，见图1。钩藤样品的总DNA条带清晰较明亮，说明改良CTAB法提取的钩藤总DNA完整性好，可进行后续实验。
1.钩藤样品总DNA；2.Marker (DL2000)
图1 钩藤样品总DNA的琼脂糖凝胶电泳图
Figure 1 Sepharose gel electrophoresis results of total DNA
3.2 钩藤样品rDNA ITS区PCR扩增
将钩藤样品总DNA模板分别按1、10、100、1000、10000倍数稀释后，进行rDNA ITS序列的PCR扩增。由PCR浓度梯度扩增的结果可知，模板浓度在稀释倍数为1～10时，rDNA ITS序列能被高效扩增。在模板最佳浓度(将钩藤样品总DNA模板稀释10倍)下，钩藤样品rDNA ITS序列PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果见图2。由图可知，在模板最佳浓度下，钩藤样品rDNA ITS序列PCR扩增产物主带清晰，无非特异性条带，大小约为720bp。由此可知，在模板最佳浓度下，钩藤碱等抑制物对PCR扩增的影响较小，ITS序列片段能得到有效扩增。
1.Marker (DL2000)；2.钩藤样品
图2 模板最佳浓度条件下PCR扩增结果
Figure 2 PCR results of the optimal template concentratio
3.3 ITS区序列分析
挑取3个单克隆测序，获得钩藤样品rDNA ITS序列的长度为719bp。把获得的rDNA ITS序列与GenBank中已有的rDNA ITS序列进行比较分析，得到与之亲缘关系相近的序列。通过对序列之间进行Clustal X比对和BioEdit计算，发现该样品与国际基因数据库GenBank 中已有的华钩藤(Uncaria sinensis，FJ980386)的相似性为99.8%，因此从分子系统发育的角度可将该钩藤植物归类为华钩藤Uncaria sinensis。
3.4 分子系统发育分析
将钩藤样品rDNA ITS序列与GenBank中已有的rDNA ITS序列进行比较分析，得到与之亲缘关系相近的钩藤属其他种的序列和与之亲缘关系相近属的序列。采用最大简约法 (MP)分析，并以Nauclea subdita (AJ346876)和 Nauclea xanthoxylon (AJ346877)为外群建立一棵钩藤样品的最大简约树（图3）。
图3 贵州安顺钩藤样品的最大简约树
Fig. 3 MP phylogenetic tree based on ITS sequences of the sample
从图3可以看出，贵州安顺钩藤样品与GenBank中已有的华钩藤(U.sinensis FJ980386)聚类成为一枝，支持强度高达95％；又依次与钩藤属的其他三个种，分别是钩藤(U.rhynchophylla AJ346900)、毛钩藤(U.hirsute havil. GU937110)和无柄果钩藤(U.sessilifructus Roxb. GU937111)聚类成一枝。另外，从遗传分析的角度，该钩藤样品跟GenBank中已有的华钩藤(U.sinensis FJ980386)亲缘关系最近，并且它们序列之间的相似性高达99.8%。这从分子水平上支持了据形态特征把该钩藤属中药材鉴定为华钩藤（U.sinensis (Oliv.) Havil.)的初步结论。本研究丰富了钩藤属中药材的种类鉴定和种间分类的理论依据，也有利于钩藤属植物资源的开发和有效利用。
【参考文献】
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基金项目：国家自然科学基金资助项目（21207021）；广东省中山市科技局资助项目（20101H017）
论文作者:周子雄1,周林2,杜贵锋2,冯兵芳2,谢君婷2,朱
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第8期供稿
论文发表时间:2015/7/2
标签：序列论文; 样品论文; 植物论文; 贵州论文; 鉴定论文; 分子论文; 安顺论文; 《医药前沿》2015年第8期供稿论文;