刘超[1]2017年在《青蒿琥酯对大鼠重症急性胰腺炎模型的治疗作用及机制研究》文中认为目的:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是指多种病因引起的胰酶激活,继以胰腺局部炎症反应为主要特征,病情较重者可发生全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),并可伴有器官功能障碍的疾病。临床表现以急性上腹痛、恶心、呕吐、发热和血胰酶增高等为特点。急性胰腺炎依据严重程度分为轻症急性胰腺炎(mild acute pancreatitis,MAP)、中重症急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis,MSAP)和重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)。临床病理分类把急性胰腺炎分为间质水肿型和坏死型两种。AP每年的发病率为13/10~45/10万[1]。虽经标准规范的诊断和治疗其病死率仍高达20.8%~36%,位居院内死亡原因第五位[2,3]。胆道疾病、酒精、胰管阻塞等均是急性胰腺炎发生的主要危险因素,遗传及药物也可能发挥一定作用。吸烟也可能增加AP的发病风险[4]。此外,2型糖尿病使胰腺炎发病风险升高1.86~2.89倍[5,6]。关于急性胰腺炎的发病机制目前并不完全清楚。但近年来的研究显示,重症急性胰腺炎的病理生理过程特征为过度的炎症反应。胰蛋白酶的提前激活并引起胰腺组织的自我消化以及随之而来的局部或者系统性炎症反应的发生发展一直被广泛接受。该疾病的进程可以分为叁个阶段:胰腺局部炎症反应、全身炎症反应以及多器官功能障碍。在早期阶段,炎症通常发生在胰腺局部,临床表现为轻度急性胰腺炎。通常发病一周内好转,无其它局部或全身并发症。然而,如果恶化,将会引发广泛炎症反应,该阶段称为炎症反应综合征。最后一个阶段表现为免疫系统的全面下调,从而导致机体对于肠道细菌易位所致感染更加敏感。因此,从理论上说仅仅抑制胰酶的分泌和活性的药物如生长抑素和乌司他丁并不能取得满意的治疗效果。大量的循证医学研究结果也支持上述结论。在ACG(The American College of Gastro enterology)和IAP/APA(International Association of Pancreatology/American Pancreatic Association)的胰腺炎治疗指南中有相同的治疗推荐,非手术治疗包括禁食和胃肠减压、纠正体液失衡和微循环障碍、抑制胰腺分泌及抗胰酶疗法、镇痛、解痉等相应的对症处理[9-12],但并未有特效药物的推荐。因此随着对胰腺炎的发病机制的深入认识,研究新的治疗药物对提高重症急性胰腺炎的救治率具有重要意义。青蒿琥酯(artesunate,AS)是世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐治疗疟疾的首选药物。我课题组长期致力于青蒿琥酯临床新适应症的研究,前期实验表明AS不仅对细菌脓毒症模型动物具有较好的治疗作用,而且对雨蛙素(caerulein,CR)联合脂多糖/内毒素(lipopolysaccharide/endotoxin,LPS)腹腔注射建立的急性胰腺炎小鼠模型也具有很好的治疗作用[13,14]。急性胰腺炎动物模型是研究该疾病病理生理机制和治疗药物的基础。由胆酸盐所诱发的急性胰腺炎模型是已被广泛认可的建立重症急性胰腺炎的代表性方法[15,16]。大鼠胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠后,能够即刻观察到围绕在主胰管附近的胰腺组织出现出血性坏死,6~12 h后则出现大量的腹水、胰腺组织出血性坏死等现象,该表现与临床病人的表现非常相似。在此模型上进行胰腺炎治疗药物的评判是胰腺炎治疗药物研究的基础和必需工作。因此,本研究首先采用改良型微量注射泵经胰胆管逆行匀速推注牛磺胆酸钠以复制大鼠重症急性胰腺炎模型并对该模型进行评价,在此基础上进行青蒿琥酯治疗重症急性胰腺炎药物的评价,并研究可能的作用机制,为寻找有效治疗胰腺炎的药物并拓宽AS的临床新适应症提供实验依据。方法:一、大鼠重症急性胰腺炎模型的建立与评价1.大鼠重症急性胰腺炎模型的建立:采用微量注射泵胰胆管逆行注射不同剂量的牛磺胆酸钠,观察大鼠7天存活情况;根据大鼠生存率,筛选可导致30%~60%以及70%~90%生存率的重症急性胰腺炎模型建立方法。2.模型的评价:在建模完成后不同时相点取材,通过大体观察、HE染色观察胰腺组织病理变化,检测血清淀粉酶(amylase,AMS)、胰腺组织脂肪酶(lipase,LP)及胰腺组织IL-1β、IL-6和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平的变化。二、青蒿琥酯对大鼠重症急性胰腺炎模型的治疗作用1.量效关系(给药剂量)的研究:动物建模完成后,给予不同剂量的AS,每天2次,连续给药3天,观察大鼠7天存活情况。2.时效关系(给药时间窗)的研究:动物建模完成后,在不同时相点给予第1次剂量的AS,每天2次,连续给药3天,观察大鼠7天存活情况。3.给药次数的确定:动物建模完成后,按照每天1、2、3次的给药方法,连续给药3天,观察大鼠7天存活情况。4.青蒿琥酯对大鼠重症急性胰腺炎模型的治疗作用:动物建模完成后,分别于相应时相点检测血清淀粉酶、胰腺组织脂肪酶及胰腺组织IL-1β、IL-6和C反应蛋白水平的变化。叁、青蒿琥酯对重症急性胰腺炎治疗作用机制的初步研究1.胰腺腺泡细胞系AR42J细胞1.1.不同浓度AS对AR42J细胞活性的影响:细胞贴壁培养过夜后采用不同浓度AS刺激该细胞24 h,而后加入MTS孵育2~4 h,酶标仪检测其OD值变化,确认AS干预该细胞适宜浓度范围。1.2.雨蛙素联合内毒素刺激大鼠AR42J细胞建立细胞模型:采用淀粉酶活力检测试剂盒检测其上清AMS活力变化,确定雨蛙素联合内毒素刺激细胞模型浓度及收样时间。WB法检测细胞总蛋白中炎症信号转导通路TLR4、MyD88和自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表达情况,以此确认药物干预方案及标本收取时相点。1.3.青蒿琥酯对雨蛙素联合内毒素刺激AR42J细胞上清AMS活力的影响:采用淀粉酶活力检测试剂盒检测其上清AMS活力变化。1.4.青蒿琥酯对AR42J细胞模型炎症及自噬相关关键分子的影响:WB法检测细胞总蛋白中TLR4信号转导通路中重要分子及自噬相关关键分子的表达情况。2.单核/吞噬细胞系RAW 264.7细胞2.1.胰蛋白酶联合内毒素刺激RAW 264.7细胞模型的建立:细胞贴壁培养过夜后加药刺激4 h,而后收集上清,采用ELISA法检测细胞上清中TNF-α的释放水平以选择细胞模型建立方法。2.2.青蒿琥酯对RAW 264.7细胞释放TNF-α的影响:ELISA法检测细胞上清中TNF-α的释放水平。2.3.青蒿琥酯对RAW 264.7细胞模型炎症及自噬相关关键分子的影响:WB法检测细胞总蛋白中TLR4信号转导通路中重要分子及自噬相关关键分子的表达情况;免疫荧光检测LC3Ⅱ蛋白的表达情况。结果:一、成功建立大鼠重症急性胰腺炎模型1.采用不同浓度的牛磺胆酸钠(2.0%、3.5%、5.0%、8.0%)成功建立不同生存率的大鼠急性胰腺炎模型,其7天生存率分别为100%、74.1%、55.6%、22.2%。选择3.5%牛磺胆酸钠、0.2 ml/min胰胆管逆行注射速度的方法建立75%左右生存率的SAP模型,选择5%牛磺胆酸钠、0.2 ml/min胰胆管逆行注射速度的方法建立35%左右生存率的SAP模型。2.重症急性胰腺炎大鼠腹腔及胰腺组织发生显着改变建模完成后2 h即出现腹水现象,6 h达到高峰,24 h该现象基本消失;胰腺组织于2 h即开始出现明显水肿现象,24 h开始出现明显坏死及胰腺硬化,并且与肝脏以及其它相邻器官广泛粘连,72 h后胰腺情况逐渐好转,整个过程符合急性胰腺炎病程变化规律。HE染色结果可知,随着时间的推移,模型组早期2 h即开始出现胰腺腺体结构紊乱,到12 h时,可见腺小叶之间距离显着增大,结构不齐;24 h后腺泡出现明显水肿及破裂,轮廓不清楚,细胞核固缩严重,同时伴有严重的炎症细胞浸润,血管周围以及腺体间隙有大量的红细胞渗出,72 h后胰腺逐渐恢复好转,炎症细胞逐渐减少,整个过程呈现出了典型的急性胰腺炎的病理变化。3.重症急性胰腺炎大鼠体内血清及胰腺组织酶学指标发生显着变化模型组淀粉酶活力在2 h就已开始上升,12 h达到较高水平,24 h后出现下降,直至72 h后降至正常水平范围。模型组脂肪酶从2 h便开始升高,12 h时急剧上升至较高水平,24 h达峰值,72 h后下降至正常水平范围。4.重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织炎症相关因子发生显着变化模型处理组在初期2 h内IL-6水平已经显着升高,6 h达峰,之后随着时间延长而逐渐降低,7天后IL-6水平恢复至正常水平范围;相比而言,IL-1β在2 h开始上升到较高水平,6 h达峰,12 h后已经降至正常水平范围,相比IL-6更早开始下降至正常水平。另外,CRP在建模初期2 h即显着升高达峰值,到4 h水平降低,并在整个病程中一直保持较高的水平。二、青蒿琥酯对大鼠重症急性胰腺炎模型的治疗作用1.量效关系的研究:实验终点时假手术组生存率为100%,模型组为41.7%;青蒿琥酯治疗组分别选择0.083、0.25、0.75、2.25 mg/kg;大鼠经3天给药7天观察发现,除极低剂量组未见改善作用外,其它各AS给药组大鼠状态均优于模型组,且随着AS剂量的增加,其大鼠生存率逐渐提高,状态逐渐好转。实验终点时青蒿琥酯各剂量组由低到高的生存率分别为33.3%、66.7%、83.3%、83.3%。2.时效关系(给药时间窗)的研究:实验终点时假手术组生存率为100%,模型组为52.4%;青蒿琥酯治疗组分别选择0 h、4 h、8 h、12 h进行第一次给药,给药剂量为0.75 mg/kg,首剂加倍;在给药3天后观察发现,各青蒿琥酯给药组大鼠状态均优于模型组,且12 h内随着第1次给药时相点的延长,其大鼠生存率逐渐提升,状态逐渐好转。实验终点时青蒿琥酯各时相点给药组由低到高的生存率分别60.9%、73.9%、78.3%、85.7%。3.有效时间窗内给药方案的优化实验终点时假手术组生存率为100%,模型组为38.5%,青蒿琥酯治疗组分别选择0 h、2 h、12 h、24 h、36 h进行第1次给药,而后每天2次,给药剂量为1.5 mg/kg,首剂不加倍;经3天给药后发现,除36 h给药组未见显着改善作用外,其它各AS给药组大鼠状态均优于模型组。实验终点时青蒿琥酯各时相点给药组的生存率分别为84.6%、85.7%、76.9%、69.2%、42.9%。4.有效给药次数的确定:实验终点时假手术组生存率为100%,模型组为22.5%,青蒿琥酯治疗组选择1.5 mg/kg,每天1次、2次、3次给药,给药3天观察7天。实验终点时各青蒿琥酯给药组的生存率分别为每天1次给药组为35.0%、每天2次给药组为45.0%、每天3次给药组为40.0%。5.青蒿琥酯显着降低了大鼠重症急性胰腺炎模型胰酶及炎症相关因子的上升青蒿琥酯能够显着降低SAP大鼠血清淀粉酶以及胰腺组织脂肪酶活力的上升,且其效果均不亚于阳性药物乌司他丁。青蒿琥酯还能够显着降低大鼠SAP模型胰腺组织CRP、IL-1β以及IL-6水平的上升。叁、青蒿琥酯对重症急性胰腺炎治疗作用机制的初步研究1.青蒿琥酯对胰蛋白酶联合LPS刺激大鼠胰腺腺泡细胞系AR42J细胞作用及其机制研究(1)细胞的处理:采用0.5 n M的雨蛙素联合0.9μg/ml的LPS刺激AR42J细胞,结果显示,Medium组淀粉酶活力处于较低水平;而单独的雨蛙素0.5 nM组以及单独的LPS 0.9μg/ml组淀粉酶活力水平均较Medium组显着增加;当两者联合刺激时,该细胞淀粉酶活力水平进一步增加,且均显着高于各单独刺激组,两者协同效应非常显着。(2)单独的AS处理组中,随AS浓度增加,其对AR42J细胞分泌的淀粉酶活力抑制作用逐渐增强,呈剂量依赖性;青蒿琥酯亦能剂量依赖性降低由雨蛙素联合LPS刺激AR42J细胞所引起的淀粉酶活力的上升。(3)WB结果表明,青蒿琥酯对单独的雨蛙素以及单独的LPS刺激AR42J细胞所引起的TLR4、Beclin-1、MyD88、LC3Ⅱ蛋白表达量的上升均具有显着的抑制作用;青蒿琥酯亦能够显着降低由雨蛙素联合LPS刺激AR42J细胞TLR4信号转导通路中重要分子TLR4、MyD88及自噬相关关键分子Beclin-1、LC3Ⅱ的表达。2.青蒿琥酯对胰蛋白酶联合LPS刺激小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞作用及其机制研究(1)细胞的处理:采用10μg/ml的胰蛋白酶联合3 ng/ml的LPS刺激RAW 264.7细胞,结果显示,Medium组TNF-α释放水平较低;而单独的胰蛋白酶10μg/ml组以及单独的LPS 3 ng/ml组TNF-α释放水平均较Medium组显着增加;当两者联合刺激时,该细胞分泌TNF-α的水平进一步增加,且均显着高于各单独刺激组,两者协同效应非常显着。(2)单独的青蒿琥酯几乎不会影响正常RAW 264.7细胞分泌TNF-α;青蒿琥酯对单独的胰蛋白酶以及单独的LPS刺激RAW 264.7细胞所引起的TNF-α水平的上升具有显著抑制作用,且随着青蒿琥酯浓度增加而增强;青蒿琥酯亦能剂量依赖性降低由胰蛋白酶联合LPS刺激RAW 264.7细胞所引起的TNF-α水平的上升。(3)WB结果表明,单独的青蒿琥酯能够略微降低正常的RAW 264.7细胞TLR4、MyD88、LC3Ⅱ蛋白的表达,升高Beclin-1蛋白的表达;青蒿琥酯对单独的胰蛋白酶以及单独的LPS刺激RAW 264.7细胞所引起的TLR4、Beclin-1、MyD88、LC3Ⅱ表达量的上升均具有显着的抑制作用;青蒿琥酯亦能够显着降低由胰蛋白酶联合LPS刺激RAW 264.7细胞所引起的TLR4、Beclin-1、MyD88、LC3Ⅱ表达量的上升。同样,免疫荧光结果亦显示了相同的趋势。结论:1.成功建立大鼠重症急性胰腺炎模型,该模型建立方法具有稳定性好,可靠、简便、成功率高、病变均一性好、操作迅速的特点,利于大批量进行操作;2.青蒿琥酯可显着增加大鼠重症急性胰腺炎模型7天存活率,显着降低重症急性胰腺炎胰淀粉酶、胰脂肪酶活力以及炎症相关因子的释放;3.青蒿琥酯可抑制雨蛙素和LPS诱导的胰腺腺泡细胞分泌的淀粉酶活力以及胰蛋白酶和LPS诱导的单核/吞噬细胞分泌TNF-α。其对重症急性胰腺炎模型的保护作用机制可能与抑制TLR4信号通路以及自噬有关。
王鹏[2]2016年在《芍药苷对重症急性胰腺炎肾损伤的保护作用及其机制探讨》文中研究指明目的：观察芍药苷对大鼠重症急性胰腺炎的量效关系,应用其最佳剂量观察对重症急性胰腺炎所致大鼠急性肾损伤的保护作用,并对其可能的机制进行探讨。方法：第一部分：SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠40只,采用随机数表法分为5组,分别为假手术对照组、重症急性胰腺炎组、芍药苷干预组(下设3个剂量讨论组)。每组有8只大鼠。芍药苷组有分为50mg/kg组(P1)、100mg/kg组(P2)、150mg/kg组(P3),牛黄胆酸钠(5%)成功建立重症急性胰腺炎模型后30分钟股静脉给予各剂量芍药苷。重症急性胰腺炎组仅建模,对照组仅开腹翻动大鼠十二指肠和胰腺组织。各组在12小时时间点麻醉后下腔静脉取血用于血清胰腺炎水平(淀粉酶AMY、脂肪酶LIPA)、肝功能(ALT、AST)以及肾功能(BUN、Cr)的检测。取大鼠胰头组织固定于4%的多聚甲醛中,进行HE染色,观察胰腺组织病理改变。第二部分：SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠72只,随机分为3大组(据随机数表法,每组24只)：对照组、重症急性胰腺炎肾损伤组及芍药苷干预组(采用100mg/kg最佳剂量),每组又分为3h、6h、12h亚组,每亚组有8只大鼠。空白对照组手术仅在麻醉后开腹翻动胰腺及十二指肠,然后关腹；重症急性胰腺炎肾损伤组采用牛黄胆酸钠(5%)大鼠胆胰管逆行注射构建模型；芍药苷干预组在构建重症急性胰腺炎肾损伤模型后30分钟大鼠股静脉注射100mg/kg芍药苷进行干预。各组大鼠均在模型构建后3、6、12小时麻醉后下腔静脉取血,ELISA法检测血清中炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α水平及肾功能改变(Cr及RUN)。大鼠肾脏组织取下后固定于4%的多聚甲醛中后包埋,切片进行HE染色观察各组肾脏组织病理学改变。第叁部分：对芍药苷保护重症急性胰腺炎大鼠肾功能的可能的机制进行探讨。通过NO试剂盒检测大鼠肾脏组织中NO水平的改变。免疫组织化学染色法观察大鼠肾脏组织中NF-κ Bp65的表达情况,并通过western blot研究其上游MAPKs信号通路中磷酸化p38的活化情况,讨论p38MAPKs信号通路是否参与炎性通路NF-κB的激活。采用TUNEL试剂盒辅助以Caspase-3的表达情况检测大鼠肾组织的细胞凋亡情况。对芍药苷保护肾功能的药理学机制进行讨论。结果：第一部分：探讨芍药苷对大鼠重症急性胰腺炎保护作用的最佳剂量,通过牛黄胆酸钠构建大鼠重症急性胰腺炎模型,芍药苷干预组对大鼠重症急性胰腺炎模型的最佳剂量的探讨示,50mg/kg组与重症急性胰腺炎组相比较能够降低血清AMY和LIPA水平,其对大鼠的肝功能的影响较小,HE染色观察胰腺组织病理的改变及胰腺病理学评分示胰腺组织病理有所改善但改善不明显,胰腺病理评分下降程度低。100mg/kg芍药苷干预组能够降低重症急性胰腺炎大鼠模型的血清AMY及LIPA,血清AST、ALT较对照组改变较轻,100mg/kg组较50mg/kg组降低血清淀粉酶,脂肪酶水平更为明显,对于大鼠肝肾功能的改变如ALT,AST较对照组及50mg/kg组并无明显区别。胰腺组织的HE染色示100mg/kg组能够降低胰腺组织病理评分。150mg/kg芍药苷干预组能够降低重症急性胰腺炎大鼠的血清AMY及LIPA,胰腺组织的HE染色能够降低胰腺组织病理评分,但反应肝功能的血清AST、ALT较对照组明显升高,示150mg/kg组对大鼠机体的肝功能影响较大。综上所述,100mg/kg是芍药苷干预大鼠重症急性胰腺炎最佳剂量。第二部分：观察芍药苷对大鼠重症急性胰腺炎所致的急性肾损伤的保护作用在第二部分采用3、6、12小时时间节点观察对照组、重症急性胰腺炎组及最佳剂量芍药苷干预组对其肾功能的保护作用。结果示芍药苷对重症急性胰腺炎所致的肾损伤具有保护作用,能够降低大鼠急性炎症反应,ELISA测定的干预组炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α水平均较重症急性胰腺炎组下降,统计学具有意义。肾脏组织的HE切片及肾组织病理评分示干预组能够降低其病理评分。综上,芍药苷能够对重症急性胰腺炎所致的急性肾损伤具有保护作用。第叁部分：探讨芍药苷对重症急性胰腺炎所致的急性肾损伤的可能的机制。NO试剂盒测定肾脏组织中NO的含量,芍药苷干预组与重症急性胰腺炎组相比能够降低肾脏组织中NO水平,NO水平反映了机体中缺氧状态。肾脏组织中反映炎性状态的NF-κB水平示芍药苷干预组能够降低NF-κB水平,western blot示芍药苷组的MAPK-p38的磷酸化水平低于重症急性胰腺炎组。TUNEL和肾脏组织中Caspase-3水平结果示芍药苷干预组能够减轻肾细胞的凋亡。结论：芍药苷能够对重症急性胰腺炎所致的急性肾损伤具有一定的保护作用,量效关系是100mg/kg对于大鼠来说是最佳芍药苷保护剂量,其保护重症急性胰腺炎所致的急性肾损伤可能与抑制炎性组织中NO的释放,减少肾脏组织的急性缺血有关联。通过免疫组化、western blot及TUNEL试剂盒,芍药苷对肾脏的保护作用可能与抑制MAPK信号通路中p38信号通路的磷酸化,进而抑制核因子K B水平,减少肾脏组织细胞的凋亡相关。
崔洪章[3]2017年在《PBEF在重症胰腺炎肺损伤发病机制中的作用及清胰汤干预的实验研究》文中指出急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床上一种常见的急性腹部疾病,约有15~20%的患者发展成为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)。SAP的病情发展迅速,并发症多,因而在临床上死亡率一直居高不下。在SAP发展的早期阶段,肺部是首先受到损伤的胰外器官,造成急性肺损伤(acute lung injury,ALI),ALI的进一步发展可以导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),ARDS是SAP早期死亡的重要原因。SAP导致ALI的发病机制有多方面的因素,涉及到内毒素、肠屏障、微循坏、炎性介质和细胞因子连锁反应等多个相关的环节。机体过度失控的炎症反应以及促炎介质的大量释放可能是在ALI的发生中起关键性作用的因素,这一点国内外专家和学者已经形成共识。前B细胞克隆增强因子(pre-B-cell colony-enhancing factor,PBEF)是一种肽类激素,作为具有促进B前体细胞成熟功能的细胞因子于1994年首次被发现。PBEF的主要生理学功能为调控B细胞的细胞增殖、分化、凋亡等。2005年,美国学者叶水清教授等对ALI动物模型和病人的PBEF基因多态性进行了研究,发现PBEF在ALI诊断中具有生物标志作用,也提示其在急性肺部疾病的基因诊断中具有潜在的应用价值。研究表明,PBEF参与了脓毒症患者和机械通气所致的急性肺损伤。在对一些疾病的研究中还发现,PBEF可以延缓中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMN)凋亡,PMN的凋亡延迟会导致炎症因子释放增多,加重炎症反应。有学者在对急性胰腺炎的研究发现,患者血液中的PBEF表达量与疾病发展程度呈正相关。多年的临床观察和实验研究已经证实,中药清胰汤通过通里攻下、清热解毒、活血化瘀、疏肝理气等机制能够有效治疗急性胰腺炎,并在临床上得到了广泛的应用。其组方中的大黄和芒硝为是典型的通里攻下药,也是《伤寒论》经典名方——大承气汤的主要组成部分,具有峻下热结、软坚润燥、破痞除满等功效。大黄的主要活性成分——大黄素(emodin)已被证实具有多种药理学功能。近年来的研究发现,清胰汤可以减轻sap导致的炎症反应、改善sap导致的器官损伤等等,对于防止sap的进一步发展发挥重要作用。虽然对于清胰汤在sap中的作用已经有较多报道,但是对于清胰汤在sap中的作用机制仍不十分清楚。本课题主要探讨清胰汤及大黄的主要活性成分大黄素是否通过抑制pbef、促进pmn细胞凋亡而对sap发挥治疗作用,以期从新的角度探讨急性胰腺炎肺损伤的发病机制。并进一步探究清胰汤治疗sapali的作用机理,为临床上中西医结合治疗重症急性胰腺炎肺损伤提供进一步的实验依据。本研究制备了sap-ali大鼠模型,检测了对照组、sap模型组、药物处理组大鼠血清淀粉酶的含量,并对肺、胰组织进行he染色及tunel染色观察组织病理特征以及细胞凋亡情况,检测肺、胰组织的湿/干重比来评估组织水肿情况,综合探究清胰汤对sap大鼠的治疗作用;通过免疫组化方法观察肺、胰组织中pbef蛋白的表达情况,通过real-timepcr和westernblot实验观察外周血pmn中pbef的基因和蛋白的表达情况;并对外周血pmn细胞进行凋亡检测以及凋亡相关蛋白的表达情况,探究清胰汤对肺和胰腺组织中pbef的表达及pmn细胞凋亡的影响。在体外细胞实验中,利用lps刺激外周血pmn细胞模拟体外炎性环境,并用大黄素干预后检测细胞凋亡和凋亡相关蛋白的表达情况。第一部分:清胰汤对重症急性胰腺炎大鼠急性肺损伤治疗作用的观察目的:观察清胰汤对模型的治疗作用,探讨清胰汤对sap大鼠肺胰组织损伤、组织水肿以及肺胰细胞凋亡的影响。方法:采用向胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠溶液的方法制备大鼠sap模型,用碘-淀粉比色法检测血清淀粉酶水平,用he染色观察肺和胰腺的病理学变化;用tunel法检测肺和胰腺组织中细胞凋亡情况,测量肺、胰组织湿/干重比来评估组织水肿程度。结果:sap大鼠血清淀粉酶水平明显升高,清胰汤能够有效降低淀粉酶水平;he染色结果显示,清胰汤可以改善sap造成的肺和胰组织出血、炎性细胞浸润等情况;湿/干重比检测结果显示,sap模型大鼠的肺、胰组织水肿严重,在经过清胰汤处理之后得到明显改善;tunel检测显示,与sap模型组相比清胰汤处理组大鼠肺、胰细胞凋亡比例明显减轻。结论:清胰汤能够降低sap大鼠血清淀粉酶的水平,能够缓解sap造成的肺、胰组织水肿、细胞坏死等病理学表现,抑制肺、胰细胞凋亡。第二部分:清胰汤对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤作用机理探讨目的:探讨清胰汤对sap大鼠模型肺和胰腺组织pbef的表达、pmn细胞凋亡的影响及清胰汤治疗sap的分子机制。方法:采用免疫组化检测各组大鼠肺、胰组织中pbef的表达;从大鼠外周血中分离pmn细胞,用real-timepcr法检测pbefmrna水平的表达情况;用westernblot法检测pbef蛋白水平的表达情况;应用annexinv-fitc/pi法对pmn细胞进行染色,并通过流式细胞术检测pmn细胞的凋亡比例;用westernblot检测凋亡相关蛋白fas、fasl、bax、cleavedcaspase-3、bcl-xl的表达。结果:免疫组化结果显示,在sap大鼠的肺、胰组织中pbef表达量增加,在经过清胰汤处理之后,pbef表达量下降;real-timepcr和westernblot结果显示,在pmn细胞中,清胰汤能够下调pbef的表达;流式细胞术检测pmn凋亡结果显示,sap大鼠的pmn细胞凋亡比例显着低于对照组,经过清胰汤处理之后该比例有明显提高;对其他凋亡相关的蛋白westernblot结果显示,清胰汤上调fas、fasl、bax、cleavedcaspase-3的表达,下调bcl-xl的表达。结论:清胰汤能够下调sap大鼠肺和胰腺组织pbef的表达,促进sap大鼠的pmn细胞凋亡并影响凋亡相关蛋白的表达。清胰汤可能是通过下调pbef表达来促进pmn细胞凋亡,进而对sap起到治疗作用。第叁部分:体外实验研究大黄素对pmn细胞的促凋亡作用目的:通过体外实验进一步验证大黄素能够促进pmn细胞凋亡,探讨大黄素促进pmn凋亡的相关机理。方法:分离正常大鼠外周血中的pmn细胞并用lps诱导细胞模拟体外炎性环境,给予相应的药物处理;运用流式细胞技术,采用annexinv-fitc/pi双染法检测pmn细胞的凋亡比例;用westernblot检测凋亡相关蛋白fas、fasl、bax、cleavedcaspase-3、Bcl-xL的表达。结果:凋亡检测结果显示,LPS能够显着抑制PMN细胞凋亡,而大黄素能够拮抗这一作用;Western blot得出了与体内实验一致的结果,即大黄素上调了促凋亡基因Fas、FasL、Bax、cleaved caspase-3的表达,下调了抗凋亡基因Bcl-xL的表达。结论:1.大黄素能够促进PMN细胞凋亡;2.大黄素可能通过影响PMN细胞凋亡的死亡受体途径和线粒体途径中相关蛋白的表达促进细胞凋亡;3.通过诱导PMN细胞凋亡,大黄素具有治疗其他炎症反应的潜能。
彭晶[4]2014年在《通腑汤治疗重症急性胰腺炎的临床疗效与观察》文中研究指明急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床工作中常见的急腹症,其发病多有明显的诱发因素,病历特点为：症状重,体征明显,病情急,进展快。急性胰腺炎可以分为急性水肿性胰腺炎和急性出血坏死性胰腺炎。而其中急性出血坏死性胰腺炎又称为重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis, SAP),它是指急性胰腺炎伴有脏器功能障碍,或出现坏死、脓肿,或假性囊肿等局部并发症,或同时伴有两种情形的,而且还要求APACHE II评分在8分或8分以上,Balthazar的CT分级在Ⅱ级或Ⅱ级以上,其发病率在近年来有所下降。但因重症急性胰腺炎起病急,病情多变,发展迅速,在疾病发展早期即可能出现全身炎症反应综合征(SIRS)和多脏器功能衰竭(MOF),所以治疗困难,预后差。早期对于重症急性胰腺炎的治疗,多采用手术治疗,但目前临床上对于重症急性胰腺炎的治疗,多采用保守治疗,即非手术疗法,而且通常选用的保守治疗是中西医结合治疗。通腑汤是北京中医药大学附属东直门医院普外科的经验方,功能通腑泄热,解毒理气。通腑汤灌肠法,常用于治疗腹痛、腹胀的患者,因其能够促进胃肠功能活动、抗炎、泄热,故在临床上应用广泛。目的：观察西医常规治疗加通腑汤灌肠治疗与单用西医常规治疗在重症急性胰腺炎治疗疗效方面的差异,探讨其可能的作用机制,以便于临床的推广。资料与方法：选取自1995年01月至2013年12月在北京中医药大学附属东直门医院普外科住院治疗的重症急性胰腺炎患者60例,随机分为观察组和对照组,每组30例,进行回顾性研究分析。观察组患者采用西医常规治疗加通腑汤灌肠,而对照组患者采用西医常规治疗加生理盐水灌肠。结果：在西医常规治疗基础上加用通腑汤灌肠治疗的观察组患者,临床症状及体征恢复早,且与对照组相比差异有统计学意义,P<0.05；观察组患者胰酶指标、血常规、血凝及生化指标与对照组相比能快恢复至正常范围,且P<0.05,差异有统计学意义；观察组与对照组相比,总有效率高且并发症发生率低,但在总有效率方面差异无统计学意义(P>0.05),而在并发症发生率方面差异有统计学意义(P<0.05)。结论：在西医常规治疗基础上加用通腑汤灌肠治疗的30例患者能够较快缓解重症急性胰腺炎的临床症状、体征,恢复胃肠道功能,控制病情进一步进展,减少死亡率。SAP患者以实证为主,多数表现为阳明腑实证,通腑汤功能通腑泄热,将其通过灌肠方式直接作用于肠道,通过肠粘膜吸收作用,发挥各中药各自及联合功效,疗效显着。且中药较西药副作用小,可多途径给药,价格低廉,疗效可靠,具有很强的实用性及临床应用前景,值得推广应用。
阎紫菲[5]2014年在《青蒿琥酯对急性胰腺炎动物模型的治疗作用及机制研究》文中研究说明研究背景：急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床常见病，发病率高。由于急性胰腺炎发病急，病情发展快而复杂，可从最初的胰腺组织的局部病变迅速发展成为全身炎症反应综合征(systematic inflammatory response syndrome, SIRS)、脓毒症、脓毒症休克乃至多器官功能衰竭，甚至死亡，治疗非常棘手，虽然临床采用综合疗法进行治疗，但效果并不满意，总体死亡率仍然高达5％～13.6％，因此研究新的有效药物具有重要意义。目的：急性胰腺炎是由各种原因引起的全身炎症反应综合征，脓毒症是由感染因素导致的SIRS，又称SIRS亚型。鉴于SIRS贯穿急性胰腺炎的病理生理过程，早期阶段的SIRS如果得不到有效控制，晚期将出现脓毒症、脓毒症休克，发生多器官功能衰竭的风险将大为增加，病死率也将增加4～5倍。因此，急性胰腺炎的本质是SIRS和脓毒症。青蒿琥酯(artesunate，AS)为有效的抗疟药物。前期我们课题组发现，青蒿琥酯可显着提高脓毒症模型动物的存活率，显着降低模型小鼠体内血清内毒素、血清TNF-α、IL-6等炎症细胞因子的水平。鉴于急性胰腺炎的本质是SIRS和脓毒症，而青蒿琥酯具有良好的治疗SIRS和脓毒症作用，我们开展了青蒿琥酯治疗AP的研究：在建立雨蛙素联合脂多糖致AP小鼠模型的基础上，进行青蒿琥酯对急性胰腺炎模型小鼠的治疗作用研究。研究方法：1.青蒿琥酯对急性胰腺炎模型小鼠的治疗作用⑴急性胰腺炎模型小鼠的制模方法采用雨蛙素联合脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致小鼠急性胰腺炎模型：用剂量为100μg/kg的雨蛙素对小鼠进行腹腔注射，连续6次给药，每次需间隔1小时，在最后一次注射雨蛙素后立即腹腔注射剂量为10mg/kg的LPS，完成造模。⑵青蒿琥酯对急性胰腺炎模型小鼠的治疗作用将60只昆明种小鼠随机分为正常组、模型组和AS治疗组，每组12只，其中治疗组为3个浓度(AS5.0mg/kg，AS2.5mg/kg，AS1.5mg/kg)的AS组。正常组小鼠给予生理盐水；模型组小鼠在造模后，平行给予生理盐水；治疗组在造模完成后0小时和4小时肌肉注射不同浓度的青蒿琥酯。在造模完成后18小时，所有组别的小鼠采取眼眶取血，脱臼处死小鼠，留取胰腺组织，并进行以下工作：①胰腺和周围组织的大体形态学观察；②胰腺组织病理学评分：取胰腺头部进行HE染色，镜下观察其组织形态学，并采用双盲法按Rongione法对胰腺组织病理学评分；③计算胰腺系数：胰腺系数=胰腺湿重(毫克)/小鼠体重(克)；④组织、血清生化指标检测：用试剂盒测定胰腺组织中胰蛋白酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量，以及血清淀粉酶(amylase，AMS)活力。采用软件SPSS16.0对所测得的数据进行统计学分析。2.青蒿琥酯对重症急性胰腺炎模型(SAP)大鼠的治疗作用⑴重症急性胰腺炎模型大鼠模型的制作方法采用逆行性胆胰管注射3.5%牛黄胆酸钠方法建立SAP大鼠模型。⑵青蒿琥酯对重症急性胰腺炎大鼠模型的治疗作用。将48只SD大鼠随机分为正常组、假手术组、SAP模型组，AS治疗组(5.00mg/kg,3.5mg/kg,1.75mg/kg,0.7mg/kg)和乌司他丁(US)组，每组6只。除正常组以外，各组采用逆行性胆胰管注射牛黄胆酸钠方法制作SAP大鼠模型后，4个AS组在0小时和4小时给予不同剂量的青蒿琥酯治疗，连续叁天给药，每次间隔24小时。US组造模后平行给予乌司他丁制剂10000U/kg。正常组不给予任何操作，假手术组造模后平行给予生理盐水。第叁天给药结束后，采用腹主动脉取血，同时摘取胰腺组织做病理学检查、生存曲线及各项生化指标检测，主要包括胰腺系数、组织脂肪酶活力和SOD活力、组织MDA含量，血清AMS活力等。3.青蒿琥酯对急性胰腺炎治疗作用的分子机制研究⑴大鼠胰腺腺泡细胞分离和培养采用胶原酶消化法分离SD大鼠原代胰腺腺泡细胞，将细胞分为正常组、脂多糖组、AS干预脂多糖组、AS组。脂多糖终浓度为1μg/mL，AS干预组先加入终浓度为10μg/mL的AS，2h后加入脂多糖孵育。加入脂多糖6h后进行指标检测.⑵各项指标检测①应用半定量RT-PCR和ELISA法分别检测AS处理对LPS诱导的大鼠胰腺腺泡细胞TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表达及蛋白释放的影响。②应用半定量RT-PCR技术检测大鼠胰腺腺泡细胞经青蒿琥酯或LPS处理前后，其TLR2、TLR4和p65mRNA表达的变化情况。主要结果：1.青蒿琥酯对重症急性胰腺炎大鼠模型的治疗作用⑴胰腺组织观察：不同剂量AS组小鼠和大鼠胰腺组较模型组血管充血情况减轻、出血点明显减少，颜色接近正常组，胰腺系数较模型组有显着降低。⑵胰腺组织的病理学评分：①AS组的胰腺组织较模型组在坏死、出血和炎性浸润方面较模型组小鼠和大鼠有不同程度的减轻。②Rongione法病理学评分结果：治疗组与模型组相比，胰腺损伤的组织病理学评分均降低，有显着性差异(P<0.05)，各AS组间有一定的量-效关系趋势，但各组间无显着差异(P>0.05)。⑶组织、血清生化指标检测：①组织脂肪酶、蛋白酶和SOD活力、MDA含量测定：与正常组比较，模型组小鼠组织胰脂肪酶、胰蛋白酶活力和MDA含量有显着增加(P<0.01)，AS组与模型组比较，其各项指标都有降低(P<0.05)，各AS组间有一定的量-效关系趋势，但各组间无显着差异(P>0.05)。同时与模型组比较，AS组的SOD活力有明显升高。②模型组的AMS活力较正常组明显升高，而AS各组较模型组有明显降低。2.青蒿琥酯对重症急性胰腺炎大鼠模型治疗作用的机制研究。⑴青蒿琥酯能够抑制由LPS诱导的促炎性因子IL-1β和IL-6的分泌。⑵青蒿琥酯对LPS诱导产生的急性胰腺炎大鼠胰腺细胞的TLR2、TLR4和p65的表达产生抑制作用。结论：1.青蒿琥酯能明显改善急性胰腺炎模型小鼠胰腺组织的病变情况，可显着降低其血清淀粉酶、胰腺组织脂肪酶和蛋白酶的活力，增加组织的SOD活力以及降低组织MDA含量。2.青蒿琥酯能明显改善重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺组织的病变情况，可显着降低其血清淀粉酶、胰腺组织脂肪酶的活力，增加组织的SOD活力以及降低组织MDA含量。3.青蒿琥酯治疗急性胰腺炎的作用机制与抑制LPS诱导的TLR2、TLR4和NF-κB表达，从而减少前炎症细胞因子IL-1β及IL-6的释放有关。
刘立涛[6]2016年在《血管舒缓素对重症急性胰腺炎合并缺血再灌注损伤大鼠胰腺微循环影响的研究》文中研究指明目的:重症急性胰腺炎(SAP)是临床中较为凶险的急症,致死率较高。多种因素造成对胰腺组织的打击,诱发多种炎症介质的瀑布样级联反应和细胞因子应激紊乱,导致全身炎性反应综合征(SIRS),随之打破与之拮抗的代偿性反应综合症(CARS)的平衡,并直接引起多器官功能衰竭(MODS)。胰腺炎发病的共同通路是胰腺缺血再灌注损伤(IRI),尤其是在从急性水肿型胰腺炎(AP)即轻型胰腺炎,向重症急性胰腺炎演变过程中起到至关重要的作用,具体表现为胰腺微血流降低、微血管通透性增加、血液流变学的变化及胰腺组织炎细胞的浸润等。预防和改善SAP合并IRI,对减轻胰腺组织坏死,阻止SIRS及MODS有重要意义。血管舒缓素(PK)作为一种活化因子,由18种氨基酸和4种糖所组成,其在人体内逐渐降解激肽原释放出大量激肽,激肽又对微血管和毛细血管起作用,促使二者扩张,同时扩大了血管网之间的交汇,对微血管的通透性有明显改善作用,并增加血流量;同时可以抑制血管紧张素之间的转化,减轻小血管收缩作用;通过改善凝血时间及抑制钙离子,引起毛细血管内皮细胞PGI2的生成减少,减少血小板的聚集,尚可以使纤溶酶原激活成纤溶酶,降低纤维蛋白含量,预防微血管血栓形成;并能调控机体的炎症反应过程。本实验以雄性Wistar大鼠为研究对象,采用5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注入结合脾动脉30分钟夹闭的方法,建立SAP合并IRI模型;并通过经大鼠尾静脉泵入PK的方法进行药物干预。应用CHEMIX-800全自动生化分析仪测定大鼠血清AMY/LIP;以ELISA法测定大鼠血清TNF-a/IL-1β表达水平;大鼠血浆内毒素水平以鲎试剂基质偶氮显色法检测;并通过胰腺组织肉眼观察及使用光学显微镜进行胰腺病理评分;从四个方面检测PK对SAP合并IRI大鼠病情的影响。胰腺微循环血流以Preflux4001双通道激光多普勒血流仪进行测定;胰腺微血管通透性通过伊文氏蓝方法进行测定;血液流变学改变以血液流变仪进行测定;以流式细胞仪测定粘附因子CD18、CD54的水平;从以上四个方面探讨PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微循环影响的作用机制。方法:1实验动物雄性Wistar大鼠,3-4月龄,体重300-350g,清洁级,北京隆安实验动物养殖中心提供,自由饮水及进食。2动物分组实验第一部分:60只大鼠随机分为两大组,每大组30只。每大组大鼠再随机分为3小组,每组10只,分别为假手术组、SAP合并IRI组,SAP合并IRI且PK干预组,所有大鼠均造模并给药后12小时处死进行检测。第一组大鼠造模12小时后开腹,经腹主动脉采血5毫升,平均分为两等份,一份检测血清AMY/LIP;另一份检测大鼠血清炎症介质TNF-a/IL-1β表达水平。第二组大鼠于造模12h后开腹,肉眼观察胰腺组织大体变化;再经腹主动脉采血5毫升,检测血浆内毒素水平;最后处死大鼠,取100毫克胰腺组织,浸泡于10%福尔马林,取出后包埋蜡块,切成4um薄片,附于玻片并HE染色,进行胰腺病理学评分。实验第二、叁、四、五部分:每一个实验部分大鼠各30只,随机各分为叁组,每组大鼠10只,分别为假手术组、SAP合并IRI组,SAP合并IRI且PK干预组,所有大鼠均造模并给药后12小时处死,分别检测大鼠胰腺微循环血流;胰腺微血管通透性;血液流变学;白细胞粘附因子CD18、血管内皮细胞粘附因子CD54表达水平。3实验模型的建立3.1 SAP合并IRI模型建立:采用改进的Aho等的SAP造模方法,首先腹腔内注射3%戊巴比妥钠30mg/kg,麻醉成功后将大鼠固定于手术板,剪去腹部毛发,常规消毒铺巾。取上腹正中切口3cm逐层入腹,首先确认十二指肠位置,片状胰腺组织在其内侧,打开十二指肠前壁并找到胰胆管。小号动脉夹夹住肝十二指肠韧带肝门侧以阻断胆管,于胰胆管开口处以24G针头予以穿刺,针头进入胰胆管0.5cm后缝扎针头予以固定,将针头连接微量输液泵,经胰胆管逆行注入5%牛磺胆酸钠,剂量0.1ml/kg,速度0.2ml/min。大约5-10min后胰腺组织充血水肿,压迫穿刺点后缝合十二指肠前壁。参考Fujimoto等的IRI造模方法,SAP模型建立后,动脉夹立即夹闭脾动脉30min再松开,胰腺组织局部缺血,腹腔脏器复位后临时关腹。大鼠造模前12小时禁食、4小时禁水,模型建立后立即背部皮下注入生理盐水5毫升,允许自由饮水并注意保暖。3.2 SAP合并IRI且PK干预组模型建立:SAP合并IRI大鼠模型建立后,将大鼠四肢固定于木质托盘上,40-45度温水浸泡尾静脉半分钟,使其血管充血,擦干备用。选择5号注射针头,以30度角距尾尖2厘米进针,平行向前,见回血时立即参考药物使用说明书给药。PK按2U/只,溶于NS 5ml,尾静脉持续泵入注药,连续12小时。3.3假手术组模型建立:以SAP模型建立的方法操作,不同的是逆行胰胆管注入同等剂量的生理盐水,且物理翻动胰腺组织,动作重复3次,余条件相同。实验动物均符合医学伦理学管理标准。4 PK对SAP合并IRI大鼠病情变化指标影响的检测4.1 PK对SAP合并IRI大鼠血清AMY/LIP的检测大鼠血清AMY/LIP检测采用全自动生化检:第一组大鼠造模后12h开腹,经腹主动脉采血5毫升,平均分为两等份,取一份血液标本置入密封的采血管中静置1小时,离心10分钟(3000r/min),血清AMY/LIP以CHEMIX-800全自动生化分析仪进行测定。4.2 PK对SAP合并IRI大鼠血清炎症介质TNF-a/IL-1β表达的检测大鼠血清炎症介质TNF-a/IL-1β表达通过ELISA法检测:取第一组大鼠另一份血液标本,置入密封采血管后静置1小时,离心10分钟(3000r/min),取血清放入-20℃冰箱中保存,待行ELISA检测,TNF-a/IL-1β水平检测方法严格按试剂盒操作说明书的要求进行。4.3 PK对SAP合并IRI大鼠血浆内毒素水平的检测大鼠血浆内毒素以鲎试剂基质偶氮显色法进行检测:第二组大鼠造模后12小时常规开腹,首先观察胰腺大体变化,后经腹主动脉采血5毫升,按照鲎试剂盒说明书要求,首先对试验器材进行去热源处理,留取标准血样并配置试剂,吸管吸取血清0.1毫升,与0.05毫升鲎试剂均匀混合,放置于37℃水浴箱3分钟,之后取出,并加入0.5毫升亚硝酸钠混匀,随后再加入0.5毫升氨基磺酸氨,最后加入0.5毫升奈乙二胺均匀混合,随后波长545纳米以723分光光度计进行比色读数。计算公式:A=As-(Ab-Abb),求得吸光度A值后,查对内毒素标准曲线并求得内毒素的含量。4.4 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺病理评分的评估大鼠胰腺病理评分采用光学显微镜法:第二组大鼠抽血检测血清内毒素前,首先观察胰腺组织大体变化;后取100毫克胰腺组织,浸泡于10%福尔马林,取出后包埋成蜡块并切成4微米薄片,附于玻片HE染色,在光学显微镜下观察,参考Grewal的方法并加以改进,从四个方面即水肿、出血、坏死、炎性浸润等评分,每项指标分别为0、1、2、3、4五个分值,最后汇总并计算总分。5 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微循环血流影响的检测:各组大鼠于造模给药后12h常规开腹,用Preflux 4001双通道激光多普勒血流仪测定胰腺微循环血流各项指标,探头口径0.25mm,波长780nm。探头轻轻接触胰腺组织表面,首先分别测定胰头、胰尾处血流,之后选取胰头-胰尾测量连线中点的胰体处进行测定,避开血肿组织及胰腺大血管,取算术平均值为最终结果。具体检测指标包括胰腺微血管血流量、血流速度,微动脉、微静脉管径,毛细血管管径、密度、灌注等指标。6 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微血管通透性影响的检测:采用改进的Keiji等方法进行检测,各组大鼠检测胰腺微循环血流之后,从股静脉注入1%伊文氏兰,剂量2ml/kg,胰腺组织30分钟后取出,称湿重后,取150毫克组织置入5毫升试管,按照0.03/mg加入甲酰胺。24h后取浸出液1毫升,通过分光光度计检测伊文氏兰的浓度,伊文氏兰的漏出量依次计算;剩余胰腺组织剪碎,置于160度的电热干燥箱内,24小时后予以称重,以湿/干重之比计算150mg胰腺组织干重;微血管通透性最后以伊文氏兰漏出量/胰腺组织干重(ug/g)表示。7 PK对SAP合并IRI大鼠血液流变学影响的检测:采用BV-100血流变仪检测大鼠血液流变学。各组大鼠模型建立后12小时常规开腹,经腹主动脉采血5毫升置入不凝管,均匀摇晃,置BV-100血流变测试仪送检。检测指标包括全血高、中、低切边率下、血浆粘度、全血还原粘度;红细胞聚集指数、血沉及血沉方程K值;红细胞变形指数及红细胞刚性指数;红细胞压积,纤维蛋白原。8 PK对SAP合并IRI大鼠白细胞粘附因子CD18、血管内皮细胞粘附因子CD54表达水平影响的检测:粘附因子CD18、CD54检测采用流式细胞仪法。各组大鼠模型建立后12小时常规开腹,经腹主动脉采血5毫升,EDTA抗凝,取100微升离心10分钟,1500r/min;取3支管标记A、B、C。A管加入20ul CD45-per CP、20ul CD18-FITC,B管加入20ul CD45-per CP、20ul CD54-PE,C管加入20ul CD45-per CP、20ul同型对照Ig G抗体,室温避光孵育40min;3支管分别加入1毫升溶血素,混匀放置10分钟,避光常温,离心5分钟800r/min;为清除未结合的抗体,去上清液再PBS洗两次,再离心5分钟800r/min两次,加入多聚甲醛1g/L固定后上机检测;流式细胞仪荧光检测变异系数首先调整,一般稳定在2%左右,再调整光电倍增管电压、灵敏度、阈值及颜色补偿,此时流式细胞仪处于最佳工作状态,488纳米氩离子激光为光源,FITC受激发后出现绿色的荧光;启动Elite分析软件,分别测定中性粒细胞前向散射光及侧向散射光,并测定其MFI。9统计方法:统计采用SAS8.0软件包:大鼠血清AMY/LIP、炎症介质TNF-a/IL-1β、内毒素及胰腺微循环血流、胰腺微血管通透性、血液流变学、白细胞-血管内皮细胞粘附因子CD18、CD54表达结果以“x±s”表示,组间显着性差异比较采用方差分析,P<0.05为有统计学差异;病理评分为等级资料,组间显着性差异比较采用Chi square test,P<0.05为有统计学差异。结果:1 PK对SAP合并IRI大鼠病情指标影响的检测结果1.1 PK对SAP并IRI大鼠血清AMY/LIP影响的检测结果:1.1.1与假手术组比较,SAP合并IRI模型组造模后12h,大鼠血清AMY/LIP出现明显升高,AMY由123.38±30.25 u/L迅速上升至2536.47±269.43 u/L,LIP由81.47±12.25u/L迅速上升至746.36±85.32u/L,二者升高均具有显着性差异,P<0.01。1.1.2与SAP合并IRI模型组比较,SAP合并IRI且PK干预组造模后12小时,大鼠血清AMY/LIP明显降低,AMY由2536.47±269.43 u/L下降至1867.45±139.86 u/L,LIP由746.36±85.32u/L下降至568.27±108.43 u/L,二者降低均具有显着性差异,P<0.05。1.2 PK对SAP合并IRI大鼠血清炎症介质TNF-a/IL-1β表达影响的检测结果:1.2.1与假手术组比较,SAP合并IRI模型组造模后12h,大鼠血浆TNF-a和IL-1β表达出现明显升高,TNF-a由3.91±0.41 pmol/L迅速上升至18.63±3.52pmol/L,组间差异P<0.01;IL-1β由108.32±26.65 pg/ml上升至269.86±45.87 pg/ml,组间差异P<0.01,二者升高均有显着性意义。1.2.2与SAP合并IRI组模型组比较,SAP合并IRI且PK干预组造模后12h,大鼠血浆TNF-a和IL-1β表达水平出现一定程度的降低,TNF-a由18.63±3.52pmol/L降至15.67±3.09pmol/L,组间差异P>0.05;IL-1β由269.86±45.87 pg/ml降至245.76±35.13 pg/ml,组间差异P>0.05,二者降低均无显着性意义。1.3 PK对SAP合并IRI大鼠血清内毒素表达影响的检测结果:1.3.1与假手术组比较,SAP合并IRI模型组造模后12h,大鼠血浆内毒素出现明显升高,由23.38±3.25 EU/L迅速上升至146.67±20.43 EU/L,升高有显着性差异,P<0.01。1.3.2与SAP合并IRI组模型组比较,SAP合并IRI且PK干预组造模后12h,大鼠血浆内毒素出现明显降低,由146.67±20.43 EU/L降至127.56±22.48 EU/L,降低无显着性差异,P>0.05。1.4 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺组织病理改变影响的检测结果:1.4.1大鼠胰腺组织改变肉眼观察:假手术组大鼠胰腺质地良好,无明显水肿,胃肠道扩张不明显,腹腔内无明显腹水。SAP合并IRI组胰腺充血、水肿明显,伴有片状出血、局灶样坏死及皂化斑,并出现血性腹水。SAP合并IRI且PK干预组胰腺组织仍有充血、水肿、片状出血、局灶样坏死,皂化斑,血性腹水等,但均有所缓解,尤其是片状出血,局灶样坏死。1.4.2光学显微镜下大鼠胰腺病理评分:假手术组大鼠胰腺组织水肿,但无明显出血坏死,间质亦无明显炎细胞浸润。SAP合并IRI组则胰腺明显水肿,伴有明显的片状出血、坏死及大量炎细胞浸润。SAP合并IRI且PK干预组大鼠胰腺仍有水肿及片状出血、坏死及炎细胞浸润等表现,但均出现一定程度的改善。2 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微循环影响的检测结果:2.1 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微血管血流量及血流速度影响的检测结果:2.1.1与空白对照组比较,SAP并IRI组造模后12小时,胰腺微循环血流量由355.72±26.07下降至263.31±20.95,胰腺微循环血流速度由101.91±11.81下降至76.63±14.79,血流量组间差异P<0.01,血流速度组间差异P<0.05,组间比较有显着性差异。2.1.2与SAP并IRI组比较,PK处理组胰腺微循环血流量由263.31±20.95上升至307.37±30.23,胰腺微循环血流速度由76.63±14.79上升至88.42±13.32,组间差异P<0.05。2.2.PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微动脉及微静脉管径影响的检测结果:2.2.1与空白对照组比较,SAP并IRI组造模后12h,胰腺微动脉管径由17.72±4.07 um下降至8.31±3.05 um,组间差异P<0.01;胰腺微静脉管径由24.91±3.81um下降至23.63±3.79um,组间差异P>0.05。2.2.2与SAP并IRI组比较,PK处理组造模后12h后,胰腺微动脉管径由8.31±3.05um上升至12.46±4.33um,组间差异P<0.05;胰腺微静脉管径由23.63±3.79um上升至24.67±4.12um,组间差异P>0.05。2.3.PK对SAP合并IRI大鼠胰腺毛细血管管径、密度、灌注影响的检测结果:2.3.1与空白对照组比较,SAP并IRI组造模后12h,胰腺毛细血管管径出现变细,由5.72±1.07 um下降至3.11±1.15um;毛细血管密度降低,由426.91±23.81下降至297.63±14.79;二者比较有显着性差异,P<0.01;毛细血管灌注形式由稳定变为间歇不规则。2.3.2与SAP并IRI组比较,PK处理组造模后12h后,胰腺毛细血管管径出现增粗,由3.11±1.15um上升至4.13.±1.21um;毛细血管密度增加,由297.63±14.79上升至355.16±27.65;二者比较有显着性差异,P<0.05,;毛细血管灌注形式虽略有好转,仍为间歇不稳定。3.PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微血管通透性影响的检测结果:3.1与假手术组比较,SAP合并IRI模型组造模后12小时后,胰腺微血管通透性明显增强,由92.47±14.64 ug/g急速上升至986.42±138.72ug/g,组间差异P<0.01,有显着性意义。3.2与SAP合并IRI模型组比较,PK处理组胰腺微血管通透性明显降低,由986.42±138.72ug/g下降至705.23±96.63ug/g,组间差异P<0.05,有显着性意义。4 PK对SAP合并IRI大鼠血液流变学影响的检测结果4.1 PK对SAP合并IRI大鼠血液粘度影响的检测结果:4.1.1与假手术组比较,SAP合并IRI组大鼠造模12小时血液低、中、高切边率下全血粘度,血浆粘度,低、高切边率下全血还原粘度均明显上升,分别由6.45±0.47上升至9.67±0.38,3.64±0.34上升至4.75±0.48,3.17±0.31上升至4.29±0.38,1.06±0.08上升至1.65±0.13,5.47±0.42上升至8.79±0.61,3.17±0.31上升至4.29±0.38,组间比较有显着性差异,P<0.05。4.1.2与SAP合并IRI组比较,PK处理组造模12小时血液低、中、高切边率下全血粘度,血浆粘度,低、高切边率下全血还原粘度全面下降,分别由9.67±0.38下降至7.75±0.51,由4.75±0.48下降至4.12±0.41,由4.29±0.38下降至3.68±0.29,由1.65±0.13下降至1.32±0.10,由8.79±0.61下降至7.25±0.51,由4.29±0.38下降至3.68±0.29,组间差异均P<0.05,组间差异有显着性意义。4.2 PK对SAP合并IRI大鼠红细胞聚集性影响的检测结果:4.2.1与假手术组比较,SAP合并IRI组大鼠造模12小时红细胞聚集指数、血沉、血沉方程K值上升,分别由2.13±0.15上升至2.41±0.11,3.98±1.15上升至6.21±1.94,9.42±1.44上升至16.48±3.38,组间差异均P<0.05,组间差异有显着性意义。4.2.2与SAP合并IRI组比较,PK处理组造模12小时红细胞聚集指数、血沉、血沉方程K值下降,分别由2.41±0.11下降至2.23±0.14,由6.21±1.94下降至4.82±1.36,由16.48±3.38下降至12.23±2.63,组间差异均P<0.05,组间差异有显着性意义。4.3 PK对SAP合并IRI大鼠红细胞变形性影响的检测结果:4.3.1与假手术组比较,SAP合并IRI组大鼠造模12小时红细胞变形指数、红细胞刚性指数上升,分别由0.78±0.15上升至1.98±0.34,2.21±0.15上升至4.78±0.24,组间比较有显着性差异,P<0.05。4.3.2与SAP合并IRI组比较,PK处理组造模12小时,红细胞变形指数、红细胞刚性指数下降,分别由1.98±0.34下降至1.28±0.22,由4.78±0.24下降至4.02±0.16,组间比较有显着性差异,P<0.05。4.4 PK对SAP合并IRI大鼠红细胞压积及纤维蛋白原影响的检测结果:4.4.1与假手术组比较,SAP并IRI组大鼠造模12小时红细胞压积及纤维蛋白原上升,分别由38.13±4.15上升至52.45±3.23,3.16±0.25上升至6.46±1.34,组间比较有显着性差异,P<0.05。4.4.2与SAP并IRI组比较,PK处理组造模12小时,红细胞压积及纤维蛋白原下降,分别由52.45±3.23下降至42.27±3.54,由6.46±1.34下降至4.82±1.08,组间比较有显着性差异,P<0.05。5、PK对SAP合并IRI大鼠血清CD18、CD54影响的检测结果5.1与假手术组比较,SAP合并IRI模型组造模后12小时后,大鼠血清CD18、CD54分别由7.67±1.23上升至29.67±5.23,9.35±2.47上升至31.15±9.36,组间差异P<0.01,有显着性意义。5.2与SAP合并IRI模型组比较,PK处理组血清CD18、CD54分别由29.67±5.23下降至20.67±4.29,31.15±9.36下降至24.19±6.26,组间差异P<0.05,有显着性意义。结论:1逆行经胰胆管泵入5%牛磺胆酸钠制备SAP大鼠动物模型,方法稳定可靠,可操作性强,胰腺病理变化典型。2在SAP大鼠模型建立基础之上,阻断脾动脉30 min再开放的方法制备IRI大鼠模型,稳定性高,全身情况影响小,血清酶学改变及胰腺病理改变符合实验要求。3 SAP合并IRI大鼠血清AMY/LIP明显升高,使用PK干预后血清AMY/LIP明显降低,表明PK可以降低SAP合并IRI大鼠血清酶学水平。4 SAP合并IRI大鼠血清TNF-a及IL-lβ的水平明显升高,使用PK干预后血清TNF-a及IL-lβ的水平有所降低,但降低水平无统计学意义,表明PK不能减轻SAP合并IRI大鼠血浆炎症介质水平。5 SAP合并IRI大鼠血清内毒素水平明显升高,PK干预后血清内毒素水平虽然略有降低,但降低无统计学差异,说明PK不能减轻SAP合并IRI大鼠血浆内毒素水平。6 SAP合并IRI大鼠胰腺组织水肿、出血、坏死、炎细胞浸润均较重,使用PK干预后,大鼠肉眼及显微镜下胰腺组织病理均得到改善,表明PK是缓解SAP合并IRI大鼠胰腺炎症的有效手段。7 PK可以明显改善SAP合并IRI大鼠胰腺微循环血流量及血流速度;扩张微动脉;扩张胰腺毛细血管管径,升高其分布密度,使其灌注状态趋于稳定,起到改善胰腺微循环的作用。8 PK可以明显改善SAP合并IRI大鼠胰腺微血管通透性,从而起到减少胰腺间质及周围组织的渗出的作用。9 PK可以明显改善SAP合并IRI大鼠全血高、中、低切边率下、血浆粘度、全血还原粘度;红细胞聚集指数、血沉及血沉方程K值;红细胞变形指数及刚性指数;红细胞压积,纤维蛋白原,从而起到减少改善胰腺微循环血流,预防胰腺微循环血栓的作用。10 PK可以明显改善SAP合并IRI大鼠白细胞粘附因子CD18、血管内皮细胞粘附因子CD54表达水平,从而起到减少白细胞与血管内皮细胞粘附的作用,进而减轻了SAP大鼠胰腺组织坏死,对缓解局部及全身炎症反应综合征都有裨益。
赵书奇[7]2017年在《清下活血方对重症急性胰腺炎大鼠肠粘膜屏障保护作用的机制研究》文中研究说明目的:通过建立重症急性胰腺炎(S A P)大鼠模型,研究S A P大鼠小肠上皮细胞促炎抗炎细胞因子I L-6、I L-1 0及粘蛋白M U C 2不同时间点的动态变化,并给予清下活血方制剂进行干预治疗,以探讨清下活血方对S A P大鼠肠粘膜屏障损伤的保护作用及相关机制,为临床治疗重症急性胰腺炎提供实验依据。材料与方法:(1)SD大鼠随机分成假手术组(空白组,n=12)、SAP组(模型组,n=24)、清下活血组(治疗组,n=2 4),每组分2 4 h、4 8 h、7 2 h叁个时间点。(2)空白组仅开腹,翻动胰腺、十二指肠肠曲等脏器后关腹。S A P组采用5%牛磺胆酸钠(0.1 m L/1 0 0 g)胰胆管逆行注射制备S A P大鼠模型。治疗组在造模2 h后予清下活血方溶液灌胃(1 m L/1 0 0 g),每1 2 h一次,连续给药。(3)叁组大鼠分别于术后2 4、4 8、7 2 h叁个时间点麻醉后进行取材,腹主动脉采集血液,分别摘取大鼠胰腺及小肠组织进行检测。检测各组大鼠血清淀粉酶水平,观察大鼠胰腺和肠粘膜的病理学变化,分别按照S c h m i d t标准及C h i u氏评分法评价胰腺及肠粘膜损伤程度,荧光定量法(R t-P C R)检测小肠上皮细胞中I L-6 m R N A、I L-1 0 m R N A的表达,免疫组化法检测小肠上皮细胞中M U C 2的表达。采用S P S S 1 7.0统计软件进行统计分析。结果:1.造模时可见胰腺组织明显肿胀充血,提示造模成功。2.模型组血清淀粉酶水平在2 4、4 8、7 2 h叁个时间点均明显高于空白组(P<0.0 1);治疗组叁个时间点血清淀粉酶的水平高于空白组(P<0.0 1),与模型组各时间点比较有所降低,比较有统计学差异(P<0.0 5)。3.模型组和治疗组的胰腺病理学评分在2 4、4 8、7 2 h均高于空白组(P<0.0 1),治疗组各时间点胰腺病理学评分低于模型组,比较有统计学差异(P<0.0 5)。4.模型组和治疗组在2 4、4 8、7 2 h叁个时间点小肠组织的病理评分均高于空白组(P﹤0.0 1);治疗组叁个时间点病理评分低于模型组,比较有统计学差异(P<0.0 5)。5.模型组各时间点I L-6 m R N A的水平较空白组明显增高(P<0.0 5),且增高程度与时间成正比,但无统计学意义;与模型组比较,治疗组各时间点I L-6 m R N A的水平低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.0 5)。与空白组比较,模型组各时间点I L-1 0 m R N A的水平显着增高(P<0.0 1),且增高程度与时间成反比(P<0.0 5);与模型组比较,治疗组各时间点I L-1 0 m R N A的水平显着增高(P<0.0 5或P<0.0 1),以4 8、7 2 h两时间点最为明显。6.与空白组比较,模型组各时间点的M U C 2染色评分明显降低(P<0.0 1);治疗组与模型组比较,各时间点M U C 2染色评分有所增高,具有统计学差异(P<0.0 5)。结论:1.清下活血方可降低S A P大鼠血清淀粉酶水平及胰腺组织形态学评分,对急性胰腺炎具有治疗作用。2.清下活血方可降低S A P大鼠小肠上皮细胞促炎性细胞因子I L-6水平,提高抗炎性细胞因子I L-1 0水平,重建促炎和抗炎细胞因子之间的平衡,减轻肠道组织损伤。3.清下活血方能有效保护S A P大鼠肠上皮细胞,增加M U C 2分泌量,从而修复肠粘膜层,对S A P引起的肠粘膜屏障损伤具有保护作用。
崔一尧[8]2003年在《不同给药途径对大鼠重症急性胰腺炎治疗作用的实验研究》文中提出目的：重症急性胰腺炎为外科较为常见的急腹症之一，迄今机理尚未完全阐明，临床上缺乏特效方法，能够阻止胰外脏器损伤的发生及逆转、抑制胰腺坏死的进一步发展和坏死并发感染。病死率仍在20％左右，随着人们对其发病机理的认识不断加深及临床病人治疗的状况，手术治疗变得相当谨慎，而以抑酶疗法等强调个体化的综合保守治疗日益受到重视，这种情况下，选择一个较好的给药途径，增强治疗效果，就显得很是必要。本实验应用抑酶药：思他宁；改善微循环药：丹参；抗感染药：环丙沙星溶液；经腹腔动脉给药与尾静脉给药的疗效对比，探讨不同时机经尾静脉或腹腔动脉给药对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠不同脏器损伤的治疗效果。以及它们各自的优越性与不足之处；希望为临床动脉灌注急性治疗胰腺炎提供理论依据。 方法：SD大鼠70只，随机分为：6组，组1：对照组(假手术组)10只；经腹腔动脉给药组分为二组，一为组2：急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)3h后给药组12只；一为组4：AHNP 12h后经腹腔动脉给药组12只；经尾静脉给药组分为二组，一为组3：AHNP 3h后给药组12只；一为组5：AHNP 12h后给药组12只；组6：AHNP组12只。用药组分别在造模后3h、12h给予丹参注射液2ml／kg·h~(-1)；0.4％盐酸环丙沙星溶液8ml／kg·h~(-1)；生长抑素(思他宁)35μg／kg·h~(-1)，持续灌注8h。24h后取材，采用基质显色法测门静脉血浆内毒素含量及放射免疫法测血清磷脂酶A_2(PLA_2)浓度；逆转录多聚酶链反应(TR-PCR)半定量检测肝、肺组织中肿瘤坏死因子-αmRNA(TNF-αmRNA)的表达变化，取部分肝、肺、胰腺组织作HE染色，常规病理学检查，计算胰腺坏死面积，评价各脏器的病理学变化与门静脉血浆内毒素、血清磷脂酶A_2及肝、肺组织TNF-αmRNA表达的关系，确切概率法比较各治疗组与AHNP组的死亡率。 结果：各组与对照组比较，所有观察指标均升高(P＜0.001)；与组6比较，组2与组3均可见肺组织中TNF-αmRNA的表达下降(P＜0.05)，组2、4门静脉血清PLA_2浓度及血浆内毒素含量降低(P＜0.05)，肝组织中TNF-αmRNA的表达减少(P＜0.05)，胰腺坏死面积减少(P＜0.05)，而组4肺组织中TNF-αmRNA的表达与组6差异无 南京医科大学硕士学位论文显着性o叩．05八 组3、5门静脉血清巴A；浓度及血浆内毒素含量下降不明显（P＞0．05），肺组织中 州F－a mRNA的表达减少（P＜0．05），胰腺坏死面积减少不明显0叩．05厂 而肝组织中 州F－a mRNA 6勺表达与组6 无差异O叩．05八 各组间死亡率无显着性差异（确切概率法，p叩．0O，但腹腔动脉灌注组死亡率低于组6（确切概率法，p＜0．05） 结论：＊）．药物对重症急性胰腺炎大鼠的治疗作用与给药途径有关；不同的给药途径对各个脏器的影响不同；m．腹腔动脉灌注可减少 “P大鼠胰腺坏死面积，减低”1静脉血队A；的活性，使肝组织中 州F－a mRNA 的表达量明显下降，有助于肝脏功能的维持；（3）．早期应用尚可降低肺组织中 wF－amRNA的表达；N厂外周静脉给药对肺脏有保护作用；O厂总体上经腹腔动脉给药可降低实验大鼠 24 h病死率。
阿布力克木·阿布力孜(Ablikim, Abliz)[9]2016年在《NADPH氧化酶抑制剂apocynin对重症急性胰腺炎大鼠肠粘膜屏障损伤的作用及其机制探讨》文中研究表明第一部分：NADPH氧化酶抑制剂apocynin对重症急性胰腺炎大鼠保护作用的剂量探讨目的：探讨NADPH氧化酶抑制剂apocynin治疗重症急性胰腺炎(SAP)大鼠最佳的用药剂量并为SAP合并肠道损伤提供安全有效的药物剂量。方法：50只雄性wista大鼠,随机分为5组(N=10)：假手术(SO)组,重症急性胰腺炎(SAP)组,apocynin低剂量预处理组(APO 25mg/kg), apocynin中剂量预处理组(APO 50mg/kg),apocynin高剂量预处理组(APO 100mg/kg)。将5%牛磺胆酸钠溶液(0.1ml/100g)逆行注射于胆胰管,制备重症急性胰腺炎大鼠模型。预处理组大鼠造模前30min通过股静脉穿刺方式,给予不同浓度(25、50、100mg/kg)的apocynin溶液。模型制备后12h剖杀大鼠,分别取腹水、血液及胰头组织,检测各组大鼠血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)和腹水量,同时观察胰腺组织病理学改变。结果：SAP组血清AMY、LIP、ALT、Cr以及腹水量和胰腺组织病理评分均较假手术(SO)组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。APO 25mg/kg组上述指标与SAP组无显着差别(P>0.05)。APO 50mg/kg、APO 100mg/kg两组血清AMY、LIP、腹水量、胰腺病理评分均较SAP组显着降低,差异有统计学意义(P<0.05)、APO 100mg/kg组与APO 50mg/kg组比较上述指标无统计学差异(P>0.05)。另外,APO 50mg/kg组血清ALT、Cr值较APO 100mg/kg组明显降低且差异有统计学意义(P<0.05)。结论：低剂量(25mg/kg) apocynin对重症急性胰腺炎的作用不明显,改善病情效果有限。中、高剂量(50、100mg/kg) apocynin均能降低血清AMY、LIP、腹水量、胰腺病理损伤及病理评分并能有效地减轻胰腺炎严重程度。然而高剂量(100mg/kg) apocynin虽能缓解急性胰腺炎严重程度,降低胰腺病理损伤,但肝肾毒性较大。由此可见,50mg/kg剂量是apocynin对大鼠重症急性胰腺炎作用的有效安全剂量。第二部分：NADPH氧化酶抑制剂apocynin对重症急性胰腺炎大鼠肠粘膜损伤的保护作用目的：探讨NADPH氧化酶抑制剂apocynin对重症急性胰腺炎大鼠肠粘膜损伤的保护作用。方法：雄性wistar大鼠60只,随机分为4组：假手术(SO)组(N=10),重症急性胰腺炎(SAP)组(N=30),apocynin预处理(APO)组(N=10)及apocynin药物对照(APO-CON)组(N=10)。其中SAP组又分为3h、6h、12h叁个时间点(N=10)。将5%牛磺胆酸钠溶液(0.1ml/100g)逆行注射于胆胰管,制备重症急性胰腺炎大鼠模型。APO组造模前30分钟通过股静脉给予50mg/kg剂量的apocynin溶液。各组大鼠造模后相应的时间点处死后取材,分别检测各组大鼠死亡率、血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIP)、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸以及血清促炎细胞因子和水平,测定大鼠回肠组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平,光镜和透射电镜下观察胰腺和回肠组织病理学改变及回肠黏膜上皮细胞超微结构。结果：SAP组大鼠血清AMY、LIP、DAO、D-乳酸、促炎细胞因子(TNF-α、 IL-1β、IL-6)、回肠组织MDA、胰腺及回肠组织病理学评分随着时间的推移逐渐升高,12小时达到高峰并均高于SO组和APO-CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。APO组大鼠上述指标与SAP12h组相比明显降低,但仍然高于SO组,差异有统计学意义(P<0.05)。SAP组大鼠回肠黏膜上皮细胞超微结构破坏明显,apocynin干预后明显得到改善。APO-CON组大上述指标同SO组,差异无统计学意义(P>0.05)。。结论：Apocynin通过降低胰腺及肠道功能学指标,减轻胰腺和肠粘膜的病理学损伤及超微结构改变程度,改善病情及降低大鼠死亡率,对SAP大鼠肠道损伤有明显地保护作用。第叁部分：NADPH氧化酶抑制剂apocynin对重症急性胰腺炎大鼠肠粘膜损伤保护作用的机制探讨目的：探讨apocynin对重症急性胰腺炎大鼠肠粘膜损伤保护作用的潜在机制,为重症急性胰腺炎胰外脏器损伤研究提供新的理论依据。方法：雄性wistar大鼠60只,随机分为4组：假手术(SO)组(N=10),重症急性胰腺炎(SAP)组(N=30), apocynin预处理(APO)组(N=10)及apocynin药物对照(APO-CON)组(N=10)。其中SAP组又分为3h、6h、12h叁个时间点(N=10)。将5%牛磺胆酸钠溶液(0.1ml/100g)逆行注射于胆胰管,制备重症急性胰腺炎大鼠模型。APO组造模前30分钟通过股静脉给予50mg/kg剂量的apocynin溶液。各组大鼠造模后相应的时间点处死和取材,通过免疫组化法和Westen Blot法检测肠组织NADPH氧化酶2(NOX2)、核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB) p65、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、caspase3及caspase9的表达水平,通过TUNEL法检测小肠粘膜上皮细胞凋亡程度。结果：SAP组大鼠肠粘膜组织NOX2、NF-κB、p38MAPK、caspase3和caspase9蛋白的表达以及肠粘膜上皮细胞凋亡率随着时间逐渐增高且均高于SO组,差异具有统计学意义(P<0.05)。APO组上述指标明显降低,与SAP12h组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。APO-CON组大上述指标同SO组,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：apocynin可以通过抑制重症急性胰腺炎大鼠肠组织NADPH氧化酶,减少NF-κB、p38MAPK蛋白表达,抑制肠粘膜氧化应激反应,下调caspase3及caspase9等凋亡信号通路,阻止NF-κB介导的炎症瀑布效应分子TNF-α、IL-6和IL-1p的释放,从而对胰腺炎肠道损伤发挥保护作用。
武春苗[10]2017年在《清下活血法对重症急性胰腺炎大鼠肝损伤保护作用的机制研究》文中提出目的:通过检测清下活血方对重症急性胰腺炎大鼠血清白介素-6、白介素-10、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、血清淀粉酶表达水平及肝脏组织核转录因子-κB表达的影响,探讨清下活血法对重症急性胰腺炎大鼠模型肝损伤保护作用的机制。材料与方法:60只SD大鼠,雌雄各半,体重180-220g,随机分为叁组:假手术组(n=12)、模型组(n=24)、治疗组(n=24);采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液(0.1mL/100g)制作重症急性胰腺炎大鼠模型;假手术组与急性胰腺炎组大鼠灌喂生理盐水,并每隔12h灌入,治疗组大鼠灌胃清下活血方颗粒剂(1mL/100g),并每隔12h灌入,正常饮食;各组在取材前12h停止给药以及喂食,在首次灌胃后24h、48h、72h分3批处死;观察各组大鼠胰腺及肝脏组织的大体形态变化;取部分肝脏及胰腺组织于10%甲醛溶液中固定,HE染色观察肝脏及胰腺组织病理改变并进行评分;腹主动脉采血提取血清,测得血清ALT、AST、AMY;ELISA检测各组大鼠血清IL-6、IL-10;免疫组化染色法检测肝组织NF-κB的表达。以上检测结果均采用SPSS19.0软件进行统计学分析。结果:1.假手术组胰腺与肝脏病理组织基本正常,治疗组大鼠胰腺与肝脏组织病理损伤在各时间段均较模型组损伤程度要轻。2.模型组与治疗组AMY、ALT、AST浓度在同时间段均明显高于假手术组;治疗组与模型组同时间段相比,AMY、ALT、AST浓度均明显降低(P﹤0.05)。模型组与治疗组血清IL-6在同时间段上均明显高于假手术组,治疗组较模型组降低(P﹤0.05)。模型组与治疗组血清IL-10在同时间段大都明显高于假手术组,治疗组较模型组升高(P﹤0.05)。3.假手术组肝脏组织各时间段均可见少量NF-κB表达,治疗组与模型组同时间段相比,NF-κB的表达均降低(P﹤0.05)。结论:1.清下活血中药可能通过调整抗炎促炎细胞因子的平衡对重症急性胰腺炎起到治疗作用。2.清下活血中药可能通过抑制NF-κB的表达,从而减轻肝细胞损伤,对肝细胞组织起到保护作用。
参考文献：
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[7]. 清下活血方对重症急性胰腺炎大鼠肠粘膜屏障保护作用的机制研究[D]. 赵书奇. 辽宁中医药大学. 2017
[8]. 不同给药途径对大鼠重症急性胰腺炎治疗作用的实验研究[D]. 崔一尧. 南京医科大学. 2003
[9]. NADPH氧化酶抑制剂apocynin对重症急性胰腺炎大鼠肠粘膜屏障损伤的作用及其机制探讨[D]. 阿布力克木·阿布力孜(Ablikim, Abliz). 武汉大学. 2016
[10]. 清下活血法对重症急性胰腺炎大鼠肝损伤保护作用的机制研究[D]. 武春苗. 辽宁中医药大学. 2017