【摘要】目的 研究沉默Dicer酶的表达对人舌鳞癌细胞Tca-8113的细胞侵袭性的影响。方法 采用RNA干扰技术沉默Tca-8113中Dicer酶的表达后，应用细胞划痕实验，粘附实验，Transwell细胞迁移实验及细胞侵袭性实验检测细胞侵袭性的变化。结果Dicer酶表达下调后，Tca-8113细胞细胞侵袭性增加。结论 沉默Dicer酶的表达可促进Tca-8113细胞的侵袭能力。
关键词： 舌鳞癌；转移；Dicer酶；RNA干扰
The effects of Dicer gene silence on the invasion of human tongue squamous cell carcinoma cells Tca-8113
Jing YANG1
Qingyuan People's Hospital, Guangdong, Qingyuan 511500
【Abstract】Objective To study the effect of silencing Dicer by small interference RNA(siRNA) on the metastasis ability of Tca-8113 tongue squamous cell carcinoma cells. Methods Cell adhesion was measured by cell adhesion assay. Cell invasion and migration were measured by Transwell invasion and migration assay, respectively. Results Inhibition of Dicer markedly enhanced cell adhesion, invasion, migration and the angiogenic capacity. Conclusion The preliminary findings suggest that lower expression of Dicer may play an oncogenic role.
Key Words：tongue neoplasm, invasion , Dicer, RNA interference
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类大小约～22nt的保守非编码RNA，它通过促进RNA降解或者抑制翻译来调控靶基因的表达。Dicer是RNase III家族的关键成员，它在细胞质中将前体miRNAs加工为成熟的miRNAs。研究已表明[1]，miRNAs在多种肿瘤中的异常表达在肿瘤发生发展中起了关键的作用。而作为miRNAs的上游调控器，Dicer表达的变化可能会通过改变了miRNAs的表达谱而影响肿瘤的生物学行为。不同的肿瘤中miRNAs的表达谱改变不同，在人类的某些肿瘤中miRNAs的表达普遍降低，而这种降低在肿瘤的发展过程中是起主导作用，还是仅仅反映了肿瘤的未分化状态，还不是很清楚。已有学者通过体外干扰Dicer酶的表达后发现肿瘤细胞的生物学行为发生变化[2]，Dicer酶的转移也是导致恶性肿瘤进展和死亡的主要因素。目前尚无研究明确表明Dicer 酶的干扰对舌鳞癌细胞侵袭性的影响，我们前期已通过脂质体介导的siRNA体外靶向敲低人舌鳞癌细胞Tca-8113中Dicer酶的表达后发现细胞增殖加速[7]，此次实验进一步观察细胞的侵袭性的变化，以探讨Dicer酶干扰后，miRNAs加工受损对肿瘤发生发展中所起的作用。
1材料与方法
1.1细胞培养与转染
1.2 细胞黏附实验
将Matrigel按照1：5稀释后加入96孔板，每孔加入50ul Matrigel，于4℃过夜；按上述方式转染实验组及阴性对照组细胞24h，次日取出96孔板，吸净残余液体，每孔加入100ul含1%BSA的RPMI-1640培养液，37℃培养箱封闭1h；取出三组细胞，消化重悬于无血清培养基，调整细胞浓度，往96孔板中每孔加入2×104细胞，培养箱中孵育1h后弃去培养基，PBS冲去未粘附细胞，在每孔中分别加入10μlMTT和100μlRPMI-1640，孵育4小时后将上清吸净，在每孔中加入150μl的DMSO，摇床震荡约10分钟后，使用酶标仪在570nm处对各孔的吸光度进行测定，每组设3个复孔。
1.3 细胞划痕实验
于24孔板中常规转染实验组及阴性对照组细胞，待细胞汇合度达80%～90%时弃去培养基，换成无血清RPMI-1640培养基，抑制细胞分裂增殖；用无菌100ul枪头垂直于孔板划痕，PBS漂洗3次，去除划下的细胞，将其加入无血清培养基后放置在培养箱中，分别在放置后0小时、24小时和48小时对细胞划痕区的迁移情况进行观察和拍照，拍照时选择5个视野，计算迁移距离，取平均值。
1.4Transwell侵袭性实验
Transwell上室中加入1：3(Matrigel：RPMI-1640)稀释后的Matrigel 30 ul，在温度为37℃的环境下保持30分钟后聚合成凝胶。在下室中加入RPMI-1640培养液600ul。细胞无血清培养基后支撑单细胞悬液，在上室中加入1×105个细胞，进行24小时培养。将上室液体去除，使用湿棉签将膜上未穿过膜的细胞进行擦拭，倒置在显微镜下进行观察。随机选择5个观察视野，对每个视野的穿过微孔细胞数量进行记录，取平均值，每组设3个复孔。
1.5 细胞迁移实验
Transwell小室上室面无需Matrigel包被，其余操作同侵袭实验。
2结果
2.1细胞黏附能力改变
转染siRNA-Dicer的实验组细胞中有更多的细胞贴壁，而阴性对照组及未转染组细胞中则较少（图1）.细胞中570nm波长下的OD值与细胞数量成正比，提示实验组细胞在570nm中的OD值为1.277±0.109，较未转染组（0.905±0.079）和阴性对照组（0.990±0.026）显著增加（P=0.009；P=0.011），而对照组之间差异无统计学意义（P=0.152）（图2），表明抑制Dicer的表达后能提高细胞与细胞外基质的粘附能力。
2.2细胞划痕实验
实验组细胞48小时后的后向划痕速度较快，且宽度窄，对照组的爬行速度慢，缺损处修复慢；48小时后，实验组的迁移距离是273.42±18.95μm，未转染组是178.14±5.01μm，阴性对照组是175.76±5.81μm，与对照组相比，转染Dicer-siRNA组细胞迁移的能力更强，差异有统计学意义（P=0.000，P=0.000）（图3，图4），提示Dicer参与调控Tca-8113细胞的定向运动。
图3 各组细胞在不同时间点的迁移距离(A：实验组，B：阴性对照组，C：未转染组)
图4 48h后各组细胞迁移距离比较（*P<0.05）
2.3侵袭能力的改变
Transwell侵袭实验显示，三组细胞均能穿过人工基质Matrigel的滤膜，实验组，阴性对照组和未转染组穿膜细胞数分别为（167.20±6.38）个，（92.40±13.22）个，（ 91.60±11.61）个。与对照组比，实验组的穿膜细胞数明显增多（P=0.000，P=0.000），而阴性对照组与未转染组之间比较无统计学意义（P=0.922）(图5，6)，说明RNA干扰Dicer能使Tca-8113细胞侵袭能力增强。
图6 Dicer-siRNA转染对Tca-8113细胞侵袭能力的影响（*P<0.05）
2.4Transwell迁移实验
结果显示，实验组细胞的迁移能力（198.20±10.40）与阴性对照组细胞（133.60±12.30）和未转染组细胞（126.60±6.27）比较显著提高，差异具有统计学意义（P=0.000，P=0.000），对照组之间则无统计学意义（P=0.301）（图7，8），说明Dicer-siRNA转染使Tca-8113细胞的迁移能力增强。
图8 Dicer-siRNA转染对Tca-8113细胞迁移能力的影响（*P<0.05）
3讨论
MicroRNAs(miRNAs) 是一类长度约为22nt的内源性的非编码微小RNA，在调控生理和病理过程中的关键基因的表达具有重要的作用。已有大量研究表明，miRNAs在肿瘤中的多基因调控作用发生紊乱，尽管在特定的肿瘤中[3]，一些miRNAs表达上调，但是miRNAs的表达量总体下调似乎成了人类肿瘤中的普遍特性，在肿瘤表型转化中发挥着至关重要的作用[4]。Dicer酶是相对分子质量约200 000的RNaseIII家族成员。它是miRNA前体成熟所必需的。作为miRNAs的上游调控者，Dicer在肿瘤中的表达变化可部分地解释miRNAs的表达异常，许多研究表明，Dicer似乎扮演着一个抑癌基因的角色，敲低其表达可促进肿瘤细胞向更恶性转化，如Dicer在肺癌中表达下降，且与患者术后低生存率相关[5]；Dicer在乳腺癌中的表达下调可导致乳腺癌更恶性，细胞侵袭性更强等等。
在我们的前期研究中，我们已证实Dicer表达下调后可促进Tca-8113细胞的生长增殖能力，也就是说，Dicer被抑制后，miRNA加工受损促进了肿瘤细胞的生长及增值，这与miRNAs在大部分肿瘤中的表达普遍降低的研究相符[6] 。由于在肿瘤的生物学特征中，肿瘤恶性表型的关键在于肿瘤病灶的侵袭和转移，有研究表明[7]，肿瘤细胞侵袭转移的过程一般为细胞粘附于基底膜，进而细胞外基质降解，细胞迁移运动得以进行，这些步骤紧密配合，不断重复，导致肿瘤细胞持续向远处转移。因此，为进一步验证Dicer与舌鳞癌细胞Tca-8113生物学行为之间的关系，我们在此研究中继续用小干扰RNA沉默Dicer的表达，利用划痕实验，粘附实验，迁移及转移实验检测Tca-8113细胞迁移，粘附及侵袭能力等的变化，结果发现，抑制Tca-8113细胞中Dicer的表达后，其黏附、侵袭、迁移能力均有显著提高，也就是说，Dicer能抑制舌鳞癌细胞的转移能力。
尽管Dicer的下调促进了细胞的侵袭迁移能力的机制还不清楚，其中所涉及的信号通路及网络也有待探讨，但是我们的初步研究证明了Dicer表达变化可影响舌鳞癌细胞的生物学行为，可作为一个靶点进行深入研究。
参考文献
1．Yan K, Jing C, Donglin L I, et al. Repression of Dicer is associated with invasive phenotype and chemoresistance in ovarian cancer[J]. Oncology Letters, 2013, 5(4):1149-1154.
2． Vincenzi B, Zoccoli A, Schiavon G, et al. Dicer and Drosha expression and response to Bevacizumab-based therapy in advanced colorectal cancer patients.[J]. European Journal of Cancer, 2013, 49(6):1501-1508.
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5． Zeng S, Yang J, Zhao J, et al. Silencing Dicer expression enhances cellular proliferative and invasive capacities in human tongue squamous cell carcinoma.[J]. Oncology Reports, 2014, 31(2):867.
6．Jiang Z, Jiang J, Yang H, et al. Silencing of Aurora kinase A by RNA interference inhibits tumor growth in human osteosarcoma cells by inducing apoptosis and G2/M cell cycle arrest.[J]. Oncology Reports, 2014, 31(3):1249.
7． 杨静，曾曙光，刘启才等。小干扰RNA沉默Dicer对人舌鳞癌细胞Tca-8113的细胞增殖和周期的影响。口腔疾病防治，2013,21（2）：61-67.
论文作者:杨静
论文发表刊物:《医师在线》2017年11月上第21期
论文发表时间:2018/2/4
标签：细胞论文; 转染论文; 肿瘤论文; 实验组论文; 对照组论文; 阴性论文; 能力论文; 《医师在线》2017年11月上第21期论文;