1.保定市第一中心医院 河北保定 071000；
2.保定市儿童医院 河北保定 071000
【摘 要】目的：通过检测乳腺癌组织中ABCG2、P-gp蛋白的表达和外周血标本T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞亚群及NK细胞比值，探讨其相关性和临床意义。方法：1免疫组织化学方法检测20例乳腺癌组织中ABCG2、P-gp蛋白表达情况；2四色荧光标记流式细胞术检测相同患者术前外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞亚群及NK细胞比值。结果：ABCG2蛋白表达与乳腺癌患者淋巴细胞亚群中CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、CD4+/CD8+比值和NK细胞比值无关（P＞0.05），与CD3+淋巴细胞（r=-0.600）和B淋巴细胞计数(r=-0.503)有关（P＜0.05）。P-gp蛋白表达与乳腺癌患者淋巴细胞亚群中CD3+淋巴细胞、CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、CD4+/CD8+比值和B淋巴细胞计数无关（P＞0.05），与NK细胞比值有关（r=0.471,P＜0.05）。结论： ABCG2蛋白表达与乳腺癌患者淋巴细胞亚群中CD3+淋巴细胞和B淋巴细胞计数具有相关性,提示乳腺癌患者乳腺癌耐药蛋白表达可能与机体免疫功能相关。P-gp蛋白表达与乳腺癌患者淋巴细胞亚群中NK细胞比值具有相关性,但是对乳腺癌患者T淋巴细胞和B淋巴细胞无相关性,提示乳腺癌患者P-糖蛋白表达可能与机体NK细胞杀伤功能相关。
【关键词】乳腺癌；淋巴细胞亚群；免疫组织化学；流式细胞术
【中图分类号】R737 【文献标识码】A 【文章编号】1674-8999（2015）9-0604-02
近年来，乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，研究发现肿瘤的多药耐药直接影响到乳腺癌患者化疗疗效，成为化疗失败的重要难题。并且肿瘤的发生和发展是一个非常复杂的过程,与机体免疫功能具有密切的关系。Ahmed等对早期造血细胞的研究表明，在体外ABCG2 可使原祖细胞增加，CD19＋淋巴细胞的发育受损，降低移植小鼠B淋巴细胞数量；在体内ABCG2增加部分祖细胞的比例和原始祖细胞群的数量，在早期造血过程中作为调节蛋白起到重要的作用。所以探讨ABCG2、P-gp在乳腺癌中的表达及与淋巴细胞亚群的关系不仅可以了解乳腺癌患者自身耐药情况，对术后应用化疗药物具有重要的指导作用，并且在理论的指导下进行实践具有一定的创新意义。
1 一般资料
1.1 标本来源
免疫组织化学方法标本取自保定市第一中心医院2008年9月～2010年12月手术治疗的乳腺肿瘤患者的存档蜡块。标本均常规取材，中性甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm厚连续切片。其中乳腺癌85例，包括浸润性导管癌（非特殊型）66例，浸润性小叶癌15例，髓样癌2例，导管内癌2例，病理分期（按2010AJCC乳腺癌分期标准）为I～III期，年龄34～62岁，平均年龄47.4岁；同时取乳腺纤维腺瘤组织40例为对照组，年龄23～42岁，平均年龄31.2岁。
全部标本均经病理证实，所有病例术前均未进行放疗、化疗及内分泌治疗。
1.2 研究方法
采用免疫组织化学SP两步法进行ABCG2、P-gp检测。小鼠抗人BCRP/ ABCG2 单克隆抗体BXP-21( ab3380)购自英国 Abcam 公司，稀释浓度为1:20，P-gp抗体及相关试剂盒均购自迈新生物技术开发有限公司，步骤严格按照试剂盒说明操作。流式细胞术采用美国Beckman Coulter 公司四色数字化流式细胞仪及其相应配套试剂。采集肿瘤病人及健康体检者血标本，取标记抗体各10μl 分别加入TruCOUNT试管管底,然后加入EDTA抗凝血100μl ,充分混匀,室温避光染色20min ,再加入溶血素500μl,充分混匀,室温避光15min，再加500μl的PBS，室温避光10min，后进行流式细胞术分析。
2 统计学分析
数据结果采用统计软件SPSS11.5进行统计分析，ABCG2和P-gp蛋白表达与乳腺癌患者淋巴细胞亚群各指标相关性分析，采用Spearman等级相关分析，均以α=0.05作为检验标准。
3 结果
3.1 乳腺癌患者组织中ABCG2蛋白表达与相同患者术前外周血淋巴细胞亚群中CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、CD4+/CD8+比值和NK细胞比值无关（P>0.05），与CD3+淋巴细胞和B淋巴细胞计数有关。CD3+淋巴细胞比值正常者ABCG2蛋白表达率（10.0%）低于不正常时（40.0%），差异有统计学意义（P<0.05）；B淋巴细胞比值正常者ABCG2蛋白表达率（10.0%）低于不正常时（40.0%），差异有统计学意义（P<0.05）（见表）。
3.2 乳腺癌患者组织中P-gp蛋白表达与相同患者术前外周血淋巴细胞亚群中CD3+淋巴细胞、CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞、CD4+/CD8+比值和B淋巴细胞计数无关（P>0.05），与NK细胞比值有关（P<0.05）。NK细胞比值正常者P-gp蛋白表达率（30.0%）高于不正常者（20.0%），差异有统计学意义（P<0.05）（见表）。
4 讨论
乳腺癌耐药蛋白（Breast cancer resistance protein，BCRP/ABCG2）是一种新发现的耐药蛋白，属于ABC膜转运蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）超家族G 的第二个成员（ABCG2）[1]。近年来在乳腺癌中的研究逐渐增多，大多数报告的结论是关于ABCG2蛋白的肿瘤耐药性 [2]，但是随着干细胞研究的逐渐深入，肿瘤干细胞学说被日益接受和重视。耐药蛋白ABCG2作为干细胞的重要标志物[3-5]，据资料显示可使早期血细胞中CD19＋淋巴细胞的发育受损，降低了移植NOD/SCID 小鼠中B-淋巴细胞的数量，使淋巴/骨髓细胞的比例发生转化。在体内ABCG2 增加了CD34＋祖细胞的比例和原始祖细胞群的数量[6]。在成熟外周血细胞群中, 如自然杀伤细胞和红系细胞的ABCG2/ Bcrp1 又呈高表达[7]。ABCG2不但作为耐药蛋白介导肿瘤细胞的多药耐药，同时，作为干细胞的重要标志物对血细胞中的淋巴细胞也产生一定的作用，而淋巴细胞又参与了免疫功能的调节。随着流式细胞术的应用，可以通过检测患者外周血淋巴细胞亚群的计数来反应机体的免疫功能状态。结合本实验结果，早期乳腺癌患者淋巴细胞亚群CD3+淋巴细胞、B细胞亚群与ABCG2均具有相关性，提示乳腺癌中ABCG2蛋白与T、B淋巴细胞亚群具有相关性。可以有以下两方面考虑，一方面在乳腺癌中ABCG2蛋白可以调节机体淋巴细胞进而影响其功能，另一方面ABCG2与淋巴细胞之间可能存在某种联系，从而相互影响，相互制约。作为多药耐药的另一重要指标P-gp为一种跨膜糖蛋白,由MDR1基因编码, 为依赖性膜转运蛋白。,结合本研究结果：早期乳腺癌患者术前淋巴细胞亚群NK比值与P-gp具有相关性，提示早期乳腺癌患者术前淋巴细胞亚群NK比值与P-gp存在着一定联系。
ABCG2是一种新发现的多药耐药蛋白，近年来引起广泛的关注，主要抵抗乳腺癌术后一线化疗常用药：蒽环类药物。所以了解乳腺癌患者的多药耐药，有助于临床医生选择合适的化疗方案。根据肿瘤干细胞学说，肿瘤组织是由分化程度不同的细胞构成的, 但只有肿瘤干细胞具有形成肿瘤的能力, 并且越来越多的研究证明SP (Side population) 表型已逐渐成为分离肿瘤干细胞的候选标志[8]。如果利用特异表型找到SP 细胞并以此为靶点进行治疗，可能成为攻克肿瘤的关键。这些细胞具有干细胞的很多特性，在肿瘤耐药和复发机制中可能起着关键作用[9]。随后的研究发现，所有SP 细胞均高表达ABCG2 基因[10]，将ABCG2作为干细胞的标志物[11]，相关报道称通过调控此蛋白可为将来干细胞的基因治疗提供新的靶基因。
Menard 等[12]认为，选择有效化疗药物治疗肿瘤，一方面取决于化疗药物对肿瘤细胞的毒性，另一方面要考虑其能否去除免疫抑制细胞，激发免疫效应细胞活性。本研究结果，ABCG2、P-gp与淋巴细胞亚群具有相关性，提示在临床应用化疗药物时，可以结合两者作为参考指标，在避免化疗药物耐药，增加疗效的同时也可以给患者应用适当的提高免疫力的药物，从而达到更好的效果。
近来，有学者已经开始了对多药耐药蛋白抑制剂的研究，ABCG2的影响因素如细胞因子和生长因子[13]；阿霉素和bisantrene[14]；抗病毒药物，HMGCoA还原酶抑制剂，致癌物质，黄酮类化合物[15];伊马替尼与BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂 。对于达沙替尼与BCR-ABL抑制剂激酶，在体内的相互作用与P-糖蛋白和ABCG2没有完全建立起来[16]，这为将来进一步研究是否通过逆转肿瘤的多药耐药来调节免疫功能，及通过改善患者的免疫功能状态来影响肿瘤的多药耐药奠定基础。本研究仅为阐述ABCG2与淋巴细胞亚群的相关性，样本量较少，但是两者之间相关机制尚待进一步大样本研究。
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论文作者:郭建美,郑淑君 通讯作者,魏娜,黄韬
论文发表刊物:《中医学报》2015年9月第30卷供稿
论文发表时间:2015/10/21
标签：淋巴细胞论文; 乳腺癌论文; 细胞论文; 蛋白论文; 比值论文; 患者论文; 肿瘤论文; 《中医学报》2015年9月第30卷供稿论文;